检索结果-内蒙古大学图书馆

中国预防兽医学报 2017年第2期39卷 156-158页

作者：吴锦艳尚佑军陈妍王光祥田宏曹小安尹双辉樊天喜臧金凤栾志舫王耀杰王雪莹刘湘涛张志东中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046 甘肃省张家川回族自治县畜牧兽医工作站甘肃张家川741500

为了解国内羊肺炎支原体的流行情况,本研究应用正向间接血凝试验(IHA)对2014年~2015年间采自我国12个省44个市、县的3 402份未免疫血清样品进行了绵羊肺炎支原体(MO)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)抗体的检测。结果显示:MO抗体阳性率为... 详细信息

为了解国内羊肺炎支原体的流行情况,本研究应用正向间接血凝试验(IHA)对2014年~2015年间采自我国12个省44个市、县的3 402份未免疫血清样品进行了绵羊肺炎支原体(MO)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)抗体的检测。结果显示:MO抗体阳性率为31.92%(1 086/3 402),其中阳性率最高的省份为内蒙古76.8%(636/828),其次是河北50%(60/120)、吉林21.99%(93/423);Mccp的抗体阳性率为10.67%(363/3 402),其中阳性率最高省份为河南35.14%(39/111),其次为河北27.5%(33/120)、山东22.5%(27/120);另有来自河北、辽宁、吉林、海南、黑龙江、内蒙古和安徽7省份的少量血清样品同时检测出MO和Mccp两种抗体,表明该病的流行存在不同菌株混合感染的情况,这在河北地区最为严重(15%)。分析表明,羊支原体肺炎在我国大部分地区流行相当严重,尤其在河北、河南和山东等集约化舍饲养殖发展的地区。绵羊的抗体阳性率明显高于山羊,表明MO在致病性和感染性方面相对Mccp更强。本研究为评估羊支原体肺炎在我国的流行状况以及制定有效防制措施提供了实验依据。

关键词：羊支原体肺炎抗体水平调查与分析

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2014-2015年我国MCCP血清流行病学调查与分析

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中国兽医学报 2017年第6期37卷 1046-1049,1058页

作者：吴锦艳陈妍王光祥尹双辉田宏栾志舫臧金凤王耀杰尚佑军张志东刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046兰州730070 河北农业大学动物医学院河北保定071001 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070

山羊支原体肺炎(CCPP)为选择性免疫项目,只有受到威胁时才紧急免疫接种,导致该病的流行日趋严重,通过对2014-2015年我国12个省42个地区山羊支原体肺炎山羊亚种(MCCP)血清抗体水平的监测分析我国目前MCCP的流行趋势、流行原因。被调查的... 详细信息

山羊支原体肺炎(CCPP)为选择性免疫项目,只有受到威胁时才紧急免疫接种,导致该病的流行日趋严重,通过对2014-2015年我国12个省42个地区山羊支原体肺炎山羊亚种(MCCP)血清抗体水平的监测分析我国目前MCCP的流行趋势、流行原因。被调查的878份血清样品中,有112份为抗体阳性,平均阳性率12.76%。目前除山西省没有检测到MCCP血清抗体外,其余省份均有MCCP的流行,其中河南、河北、山东3个省份抗体阳性率最高,分别为35.14%(13/37),27.5%(11/40)及22.5%(9/40);江苏省是阳性率最低的省份,阳性率为2.7%(1/37);定性分析结果显示:当血清效价达到1∶16时,112份阳性中,30份可判定为"++++",42份为"+++";对18份强阳性血清样品定量分析结果显示:CCPP血清抗体效价最高可达1∶256。可见,2014-2015年间,MCCP引起的CCPP在我国流行非常严重,尤其河南、河北、山东等省份,不仅为准确评估MCCP在我国现阶段的流行状况以及造成的危害提供参考,也为有效防控该病提供技术支撑。

关键词： MCCP 血清学调查与分析 2014-2015年

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慢病毒介导稳定表达抑制PRRSV复制的shRNA细胞系的建立

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畜牧兽医学报 2016年第11期47卷 2280-2287页

作者：吴锦艳田宏尚佑军陈妍王光祥刘湘涛张志东中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

利用慢病毒表达技术将稳定持续抑制PRRSV复制的shRNA导入Marc-145细胞,建立稳定表达靶向抑制PRRSV复制的shRNA的Marc-145阳性细胞克隆,并从细胞模型水平阐明抑制PRRSV复制的关键靶基因的干扰效果。采用LR重组技术,将pENTR/U6/Nsp9-4、pE... 详细信息

利用慢病毒表达技术将稳定持续抑制PRRSV复制的shRNA导入Marc-145细胞,建立稳定表达靶向抑制PRRSV复制的shRNA的Marc-145阳性细胞克隆,并从细胞模型水平阐明抑制PRRSV复制的关键靶基因的干扰效果。采用LR重组技术,将pENTR/U6/Nsp9-4、pENTR/U6/Nsp9-6及pENTR/U6/-CON分别与pDEST载体进行LR重组,获得表达骨架,重组后的表达载体在转染试剂介导下与已经优化的辅助质粒Vira PowerTM Packaging Mix共转染293-FT包装细胞,获得慢病毒样粒子,并用其感染Marc-145细胞,杀稻瘟菌素抗性筛选获得阳性细胞克隆,通过PCR、CPE、TCID50、Real-time PCR和间接免疫荧光试验等方法分别验证上述细胞株的稳定整合以及其表达的shRNA对PRRSV增殖的抑制效果。结果显示:优势干扰序列和无关序列被稳定整合在靶细胞基因组上,无论观察细胞病变效应、免疫荧光产生情况、致细胞半数感染量还是实时定量分析相对表达量,与正常Marc-145和整合有无关序列的两株阴性对照细胞相比,整合有NSP9-4和NSP9-6的两株细胞由于表达了靶向抑制PRRSV复制的shRNA,PRRSV对其易感性降低,而且差别显著,分别将其命名为Marc/pU6/NSP9-4和Marc/pU6/NSP9-6。经验证,本研究成功构建两株稳定表达靶向抑制PRRSV复制的shRNA细胞——Marc/pU6/NSP9-4、Marc/pU6/NSP9-6,同时获得一株表达无意义shRNA的Marc/pU6-CON辅助细胞,该细胞表达的shRNA具有明显抑制PRRSV复制的功能,不仅可以从细胞模型水平阐明抑制PRRSV复制的关键靶基因,也为PRRSV感染引起宿主细胞的变化以及对机体的致病机制等研究提供资料。

关键词： PRRSV shRNA Marc-145细胞系慢病毒表达技术

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小反刍兽疫病毒H蛋白的表达及间接ELISA方法的建立

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中国兽医学报 2016年第7期36卷 1109-1114页

作者：栾志舫陈妍吴锦艳王光祥田宏尹双辉杨顺利尚佑军张志东刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046

利用原核表达系统表达了小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)血凝素蛋白(H)作为ELISA包被抗原,建立了PPR抗体检测的间接ELISA方法,并对所建立方法的相关条件进行了优化。优化结果显示:抗原的最佳包被质量浓度为20mg... 详细信息

利用原核表达系统表达了小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)血凝素蛋白(H)作为ELISA包被抗原,建立了PPR抗体检测的间接ELISA方法,并对所建立方法的相关条件进行了优化。优化结果显示:抗原的最佳包被质量浓度为20mg/L;血清最佳稀释度为1∶80;酶标二抗的最佳浓度为1∶20 000;抗原抗体反应时间和酶标二抗孵育时间均为45min。批内及批间重复试验结果变异系数均小于10%,说明该方法具有较好的可重复性。检测羊口疮、羊痘、蓝舌病和山羊支原体血清结果均为阴性,说明该方法具有良好的特异性。检测临床血清样品80份,并与国外c-ELISA试剂盒比较,符合率为93.75%。因此,本方法可以用于小反刍兽疫的临床血清抗体检测及流行病学调查。

关键词：小反刍兽疫原核表达 H蛋白间接酶联免疫吸附试验

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2007—2014年国内外小反刍兽疫流行现状及分析

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中国兽医学报 2016年第4期36卷 687-693页

作者：吴锦艳尚佑军田宏陈妍王光祥栾志舫张志东中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046

小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒引起山羊、绵羊、野生反刍动物及骆驼的一种急性、亚急性高度接触性传染病。自2007年小反刍兽疫作为外来动物疫病传入我国以来,在国务院、农业部和国家有关部委的密切关注和大力支持下,使疫情的流行蔓延趋... 详细信息

小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒引起山羊、绵羊、野生反刍动物及骆驼的一种急性、亚急性高度接触性传染病。自2007年小反刍兽疫作为外来动物疫病传入我国以来,在国务院、农业部和国家有关部委的密切关注和大力支持下,使疫情的流行蔓延趋势得到有效控制。但是到了2013年年底,小反刍兽疫风波再次掀起,而且波及面积也逐步扩大,截至2014年6月,疫情已蔓延近20多个省份,严重影响我国国际贸易和经济发展。本文就近几年以及目前国内外小反刍兽疫流行现状进行整理并加以分析,以期为我国小反刍兽疫防控提供参考。

关键词：小反刍兽疫疫情分布

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口蹄疫病毒的抗原结构学的研究进展

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中国预防兽医学报 2016年第3期38卷 253-256页

作者：刘亚丽丁耀忠马小元张杰张永光中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点开放实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室甘肃兰州730046

口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus,FMDV）属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属,完整的病毒粒子由衣壳包裹着单股正链RNA构成。FMDV基因组全长约为8.5 kb,主要分为5＇端非编码区、编码区、3＇端非编码区和多聚腺苷酸（poly（A））。5... 详细信息

口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus,FMDV）属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属,完整的病毒粒子由衣壳包裹着单股正链RNA构成。FMDV基因组全长约为8.5 kb,主要分为5＇端非编码区、编码区、3＇端非编码区和多聚腺苷酸（poly（A））。5＇端非编码区的5端共价连接病毒自身编码的非结构蛋白（VPg）,而且还包含有S-片段、

关键词：口蹄疫病毒 FMDV 抗原结构非结构蛋白衣壳抗原位点正链病毒科病毒粒子编码区

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O型与A型口蹄疫重组标记疫苗病毒株的制备及鉴定

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中国预防兽医学报 2016年第2期38卷 96-100页

作者：袁红李平花马雪青方先珍白兴文孙普卢曾军包慧芳曹轶梅李冬付元芳陈应理张婧刘在新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点实验室/国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046 河南省动物疫病预防控制中心河南郑州450008

为研制针对我国边境地区(尤其是西南边境)流行的A型口蹄疫(FMD)的标记疫苗储备病毒株,本研究通过化学合成东南亚地区流行的A型口蹄疫疫毒(FMDV)A/VN/03/2009株的P1基因,将其插入含FMDV编码非结构蛋白3A aa91-aa105位缺失的O/HN/93病毒... 详细信息

为研制针对我国边境地区(尤其是西南边境)流行的A型口蹄疫(FMD)的标记疫苗储备病毒株,本研究通过化学合成东南亚地区流行的A型口蹄疫疫毒(FMDV)A/VN/03/2009株的P1基因,将其插入含FMDV编码非结构蛋白3A aa91-aa105位缺失的O/HN/93病毒全长重组质粒p OFS/3A_(91-105)中,构建FMDV A型和O型嵌合的全长重组质粒p O/3A_(91-105)-AP1。该重组质粒经NotⅠ酶切线性化后转染于表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞中,拯救得到FMDV重组病毒。间接免疫荧光、RT-PCR和序列测定结果表明拯救的FMDV为正确的A型和O型间嵌合及3A aa91-aa105缺失的重组病毒。病毒蚀斑和一步生长曲线表明拯救病毒的感染性和复制能力稍低于其亲本病毒。该型间嵌合标记病毒的成功拯救为研制防控边境地区A型FMD的储备疫苗奠定了基础。

关键词：口蹄疫病毒型间嵌合标记病毒

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一株A型口蹄疫流行毒株全序列的测定及其全长感染性克隆的构建

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微生物学通报 2016年第9期43卷 2019-2027页

作者：袁子文李平花孙普白兴文袁红马雪青卢曾军刘在新魏彦明甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046

【目的】测定一株A型口蹄疫流行毒株的全基因组序列,并构建其全长感染性克隆。【方法】参照已公布的A型口蹄疫病毒序列设计引物,将分离的口蹄疫病毒株A/Sea-97/CHA/2014全基因组分为4个重叠的片段进行RT-PCR扩增,并对其进行序列测定与... 详细信息

【目的】测定一株A型口蹄疫流行毒株的全基因组序列,并构建其全长感染性克隆。【方法】参照已公布的A型口蹄疫病毒序列设计引物,将分离的口蹄疫病毒株A/Sea-97/CHA/2014全基因组分为4个重叠的片段进行RT-PCR扩增,并对其进行序列测定与分析。利用酶切连接法将4个基因片段依次克隆至p Blue Script SKhdv载体中,构建该流行毒株的全长c DNA克隆p QAHN。pQAHN经NotⅠ线性化后转染表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞,拯救病毒。【结果】口蹄疫病毒全基因组序列测定结果表明该毒株基因组全长8 171 bp[不包括poly(C)区段和poly(A)尾巴],开放阅读框为6 996 bp,编码2 332个氨基酸,5′和3′非编码区分别为1 091 bp和95 bp。VP1系统发生树分析表明该毒株与A/GDMM/CHA/2013毒株亲缘关系最近,相似性为99.1%。线化全长质粒转染BSR/T7细胞68 h后可观察到典型的细胞病变。拯救病毒的间接免疫荧光、RT-PCR和序列测定结果表明成功拯救出了具有感染性的FMDV。拯救病毒与亲本病毒的噬斑表型及生长曲线试验表明二者具有相似的生长表型和增殖能力。【结论】该研究为我国口蹄疫病原生态分布、分子流行病学调查以及A型FMD新型疫苗的研究提供了有益的材料。

关键词： A型口蹄疫病毒全序列测定全长感染性克隆

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表达EGFP报告基因口蹄疫病毒亚基因组复制子的构建

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微生物学通报 2016年第8期43卷 1746-1752页

作者：袁红李平花袁子文白兴文孙普马雪青李坤寻广谨卢曾军包慧芳陈应理曹轶梅付元芳张婧刘在新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070

【目的】构建含有EGFP报告基因的口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子系统。【方法】利用融合PCR方法,将EGFP报告基因替换O型FMDV全长c DNA克隆中的前导蛋白Lb和结构蛋白P1基因,构建含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子FMDV-EGFP。复制子... 详细信息

【目的】构建含有EGFP报告基因的口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子系统。【方法】利用融合PCR方法,将EGFP报告基因替换O型FMDV全长c DNA克隆中的前导蛋白Lb和结构蛋白P1基因,构建含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子FMDV-EGFP。复制子质粒连续转化、测序检验复制子载体的稳定性。Not I线性化的复制子FMDV-EGFP用脂质体介导法转染表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞后,不同时间段观察EGFP荧光表达情况。转染的细胞用流式、间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot检测该复制子载体的自主复制能力和口蹄疫病毒蛋白的表达情况。【结果】复制子质粒的连续转化及测序表明报告基因可以稳定存在。FMDV-EGFP复制子转染BSR/T7细胞3 h后在荧光显微镜下能够看到绿色荧光,EGFP荧光信号随着转染时间的延长逐渐增加,并且荧光信号可持续6 d以上。转染24 h后的细胞流式分析显示转染的细胞中有6.0%发出荧光,说明构建的复制子载体能够有效表达EGFP蛋白。另外,间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot方法也检测到该复制子RNA在BSR/T7细胞中能够进行自主复制,并且能够表达病毒的非结构蛋白。【结论】含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子的成功构建为进一步研究病毒复制、翻译机制及筛选抗病毒药物等奠定了坚实的基础。

关键词： EGFP 口蹄疫病毒复制子

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家畜布鲁氏菌BP26基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

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河北农业大学学报 2016年第3期39卷 100-104,111页

作者：臧金凤尚佑军陈妍吴锦艳王光祥张志东刘湘涛孙继国河北农业大学动物医学院河北保定071001 中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046

利用原核表达的布鲁氏菌BP26蛋白作为标准抗原蛋白,建立布鲁氏菌病抗体检测方法。本试验从布鲁氏菌S2疫苗株通过PCR扩增获得BP26基因,构建融合表达质粒pET-28a-BP26后并转化BL21宿主菌,IPTG诱导表达,应用Western blot鉴定表达产物,并以... 详细信息

利用原核表达的布鲁氏菌BP26蛋白作为标准抗原蛋白,建立布鲁氏菌病抗体检测方法。本试验从布鲁氏菌S2疫苗株通过PCR扩增获得BP26基因,构建融合表达质粒pET-28a-BP26后并转化BL21宿主菌,IPTG诱导表达,应用Western blot鉴定表达产物,并以纯化的重组蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件,建立布鲁氏菌病抗体ELISA检测方法。结果表明,通过反应条件优化确定抗原的适宜包被浓度为5μg/mL,血清适宜稀释度为1∶20,二抗的适宜工作浓度为1∶20 000;通过敏感性试验结果表明,当血清稀释至1∶1 280时,仍检测为阳性;通过批间、批内重复性试验,变异系数均小于10%,表明本检测方法具有较高的重复性。用该方法对100份临床样本进行检测,并与试管凝集试验(SAT)进行相符性验证,符合率为94%,为布鲁氏菌病临床血清抗体检测及流行病学调查提供了技术手段。

关键词：布鲁氏菌 BP26蛋白间接酶联免疫吸附试验

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