检索结果-内蒙古大学图书馆

中国兽医科学 2018年第7期48卷 811-817页

作者：冯倩吴锦艳王光祥陈妍杜国玉李玲霞尚佑军张志东刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室

为了确证口疮病毒112基因的免疫学特性,本研究参考Gen Bank载录的口疮病毒NZ2株112基因序列设计1对特异性引物,通过PCR扩增口疮病毒112全基因,连接到原核表达载体p ET-28a（＋）中,将测序正确的重组质粒命名为p ET-28a（＋）-ORFV 112,... 详细信息

为了确证口疮病毒112基因的免疫学特性,本研究参考Gen Bank载录的口疮病毒NZ2株112基因序列设计1对特异性引物,通过PCR扩增口疮病毒112全基因,连接到原核表达载体p ET-28a（＋）中,将测序正确的重组质粒命名为p ET-28a（＋）-ORFV 112,并转化到Rosetta（DE3）感受态细胞中,用IPTG进行诱导重组ORFV 112蛋白表达,并分别进行SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定,并运用生物信息学软件对口疮病毒112蛋白的性质和结构进行预测分析。结果表明,ORFV 112基因的大小约为861 bp;通过重组表达的融合蛋白大小约为40 ku;SDS-PAGE和Western-blot分析表明,该蛋白具有免疫反应原性。预测分析表明,ORFV 112蛋白分子式为C1357H2155N367O451S11,理论等电点（PI）为4.68,消光系数为23 295,脂肪指数为81.78,总平均疏水性（GRAVY）为-0.383,其二级结构主要以α-螺旋（29.37%）和无规则卷曲（40.56%）构成。本研究为深入研究口疮病毒112蛋白结构与功能及该蛋白与宿主细胞的相互作用奠定了基础。

关键词：口疮病毒 ORFV 112基因原核表达生物信息学分析

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Asia1型口蹄疫病毒第V群猪源和牛源毒株全基因组比较分析

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微生物学通报 2010年第9期37卷 1312-1319页

作者：郑海学靳野尚佑军郭建宏田宏杨亚民刘湘涛才学鹏中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

为了查明Asia1型FMDV第Ⅴ群猪源和牛源毒株的序列差异,采用RT-PCR方法,对Asia1型FMDV第Ⅴ群猪源分离毒株Asia1/HN/06的基因组全序列进行了扩增和测序,并与第Ⅴ群牛源和猪源参考毒株基因组进行比较分析。结果表明,Asia1/HN/06毒株全基因... 详细信息

为了查明Asia1型FMDV第Ⅴ群猪源和牛源毒株的序列差异,采用RT-PCR方法,对Asia1型FMDV第Ⅴ群猪源分离毒株Asia1/HN/06的基因组全序列进行了扩增和测序,并与第Ⅴ群牛源和猪源参考毒株基因组进行比较分析。结果表明,Asia1/HN/06毒株全基因组序列长约8236nt[含38个A的poly(A)尾],其中5'NCR长1116nt,前导蛋白(L)编码区长603nt,结构蛋白与非结构蛋白编码区的核苷酸序列为6990nt,3′NCR长93nt,3′端是至少含有38个A的poly(A)尾巴。猪源毒株和牛源毒株的全基因比较分析表明,属于第Ⅴ群,全基因编码区核苷酸和氨基酸的同源性均为98.0%,主要差别是猪源毒株Asia1/HN/06在细胞受体结合位点变为RDD和155位置的N变为S或D,该群毒株3A更具有猪源毒株特征,有4个特异性氨基酸变异。明确了Asia1型FMDV第Ⅴ群猪源和牛源毒株的序列差异,为进一步利用反向遗传技术研究猪源和牛源毒株差异位点或基因在病毒表型变异中的作用奠定基础。

关键词： FMDV 全基因组受体结合位点 3A基因

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新型高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株全长cDNA克隆的构建与分析

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中国兽医科学 2013年第5期43卷 458-465页

作者：王松豪郑海学杨帆曹伟军刘芳张艳刘华南郭建宏中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

为了获得高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)弱毒株的全基因组序列和病毒基因组全长cDNA克隆,根据高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株(EF635006)和经典CH-1a株(AY032626)全基因组序列设计并合成特异引物,进而用RT-PCR分6段扩增了H... 详细信息

为了获得高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)弱毒株的全基因组序列和病毒基因组全长cDNA克隆,根据高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株(EF635006)和经典CH-1a株(AY032626)全基因组序列设计并合成特异引物,进而用RT-PCR分6段扩增了HP-PRRSV弱毒株的全基因组。将扩增的各个cDNA重叠片段分别克隆到pMD20-T载体中,建立了PRRSV弱毒株的初级cDNA克隆,并对基因组cDNA序列进行了测定。根据测序结果,选择特异的酶切位点,将各个亚克隆产物逐段亚克隆入经过改造的低拷贝pOK12载体中,通过引入MluⅠ和EcoRⅠ酶切位点将聚合酶Ⅱ、Ⅰ和T7启动子序列及榔头锤酶基因置于病毒基因组的5′端,引入NotⅠ和FseⅠ将聚合酶Ⅱ、Ⅰ终止子序列及戊型肝炎病毒核酶基因置于病毒基因组的3′端,结果得到了病毒基因组全长cDNA克隆ppAPRRSVOK12。测序结果表明,该毒株基因组全长15 319bp[不包括poly(A)尾];全基因序列比对结果显示,该毒株属于北美洲型毒株,与HuN4的同源性高达99.5%。测序及酶切鉴定结果证实,HP-PRRSV弱毒株基因组全长cDNA克隆已构建成功。

关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组全长cDNA克隆感染性分子克隆序列分析

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口疮病毒GIF蛋白的原核表达及对小鼠免疫细胞的影响

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中国兽医科学 2019年第10期49卷 1222-1232页

作者：冯倩吴锦艳李玲霞杜国玉尚佑军刘湘涛刘永生中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室

探究口疮病毒GIF蛋白对小鼠骨髓源树突状细胞成熟及Naive CD4^+T细胞极化作用的影响。原核表达口疮病毒GIF蛋白,用纯化后的蛋白刺激小鼠树突状细胞,利用流式细胞术检测细胞表面分子的表达情况,ELISA方法检测细胞培养上清中细胞因子IL-12... 详细信息

探究口疮病毒GIF蛋白对小鼠骨髓源树突状细胞成熟及Naive CD4^+T细胞极化作用的影响。原核表达口疮病毒GIF蛋白,用纯化后的蛋白刺激小鼠树突状细胞,利用流式细胞术检测细胞表面分子的表达情况,ELISA方法检测细胞培养上清中细胞因子IL-12P40、TNF-α、IL-10、IL-1β的分泌情况。将Naive CD4^+T细胞与经不同质量浓度的GIF蛋白刺激后的树突状细胞共培养,用ELISA检测该树突状细胞对Naive CD4^+T细胞的免疫刺激能力,并进一步检测培养上清中IFN-γ和IL-5的分泌水平。结果显示,成功克隆了ORFV117基因,表达了羊口疮病毒GIF蛋白。经不同质量浓度蛋白刺激后,树突状细胞的表面共刺激分子CD86、CD40的表达水平均明显升高,其中5μg/mL蛋白刺激后,MHCⅡ表达水平显著升高,IL-12P40、TNF-α、IL-1β、IL-10释放水平显著升高。经不同质量浓度的GIF重组蛋白刺激后的树突状细胞对Naive CD4^+T细胞的刺激能力增强,淋巴细胞共培养上清中IFN-γ分泌量显著增加。这表明一定质量浓度的口疮病毒GIF蛋白能促进小鼠骨髓源树突状细胞的成熟,能够激活抗原递呈作用,并且具有刺激T细胞分化的能力。

关键词：口疮病毒 GIF蛋白纯化树突状细胞

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新城疫病毒HN基因在CHO/dhf细胞中的表达

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中国兽医科学 2009年第1期39卷 6-10页

作者：张继乐陈豪泰张杰马丽娜金雷刘永生中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046

为了实现新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶(HN)基因在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达,构建了同时含有HN基因和二氢叶酸还原酶(dhfr)基因的真核表达载体pCI-HN-D。将纯化后的重组质粒通过脂质体转染二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢(CHO/dhf... 详细信息

为了实现新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶(HN)基因在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达,构建了同时含有HN基因和二氢叶酸还原酶(dhfr)基因的真核表达载体pCI-HN-D。将纯化后的重组质粒通过脂质体转染二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢(CHO/dhf)细胞,经3轮氨甲喋呤加压筛选,获得了稳定表达HN基因的细胞株。用间接免疫荧光和免疫印迹检测目的蛋白的表达情况。结果表明,HN基因在CHO/dhfr-细胞中成功表达。

关键词：新城疫病毒 HN基因二氢叶酸还原酶中国仓鼠卵巢细胞表达

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丝状霉形体山羊亚种巢式PCR检测方法的建立

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中国兽医科学 2007年第11期37卷 940-943页

作者：储岳峰逯忠新赵萍高鹏程贺英中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046

根据已发表的丝状霉形体簇各成员核苷酸序列,设计合成了2对引物McF、McR和MmcF、MmcR,建立了可以鉴别丝状霉形体山羊亚种(Mycoplasma ***,Mmc)的巢式PCR方法。特异性和敏感性试验结果显示,该方法只能对Mmc扩增出195 bp的片段,而对其他... 详细信息

根据已发表的丝状霉形体簇各成员核苷酸序列,设计合成了2对引物McF、McR和MmcF、MmcR,建立了可以鉴别丝状霉形体山羊亚种(Mycoplasma ***,Mmc)的巢式PCR方法。特异性和敏感性试验结果显示,该方法只能对Mmc扩增出195 bp的片段,而对其他病原菌不能扩增出任何条带,它最低能够检测出10 pg的Mmc DNA,说明该方法具有良好的特异性和很高的敏感性。田间试验结果显示,对4株霉形体分离株及其病料均可扩增出Mmc特异性片段,表明,该巢式PCR方法可用于Mmc快速鉴定和流行病学调查。

关键词：丝状霉形体山羊亚种巢式PCR 山羊传染性胸膜肺炎

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串联亲和纯化中应用不同标签组合的研究进展

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中国兽医科学 2012年第9期42卷 987-990页

作者：魏衍全孙世琪孙德惠郭慧琛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046

综述了原始串联亲和纯化方法的原理及其存在的缺陷和各种最新构建的串联亲和纯化标签组合及其从哺乳动物细胞中纯化蛋白复合物时的蛋白得率。与单步纯化方法相比,串联亲和纯化方法显著地减少了非特异性背景,可分离到高纯度的蛋白复合物... 详细信息

综述了原始串联亲和纯化方法的原理及其存在的缺陷和各种最新构建的串联亲和纯化标签组合及其从哺乳动物细胞中纯化蛋白复合物时的蛋白得率。与单步纯化方法相比,串联亲和纯化方法显著地减少了非特异性背景,可分离到高纯度的蛋白复合物。这一优势极大地简化了蛋白质鉴定及其相互作用关系的验证工作。

关键词：串联亲和纯化亲和标签蛋白复合体高蛋白得率

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A型口蹄疫病毒型特异性抗原的可溶性原核表达及多克隆抗体的制备

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中国人兽共患病学报 2010年第9期26卷 821-824页

作者：高闪电常惠芸独军政丛国正邵军军林彤中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫参考实验室家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

目的可溶性表达A型口蹄疫病毒型特异性结构蛋白VP1,制备型特异性的兔抗A型FMDV VP1多克隆抗体。方法以A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因重组克隆载体pGEM-AVP1为模板,设计表达引物,经PCR扩增获得上游带有OmpT信号肽编码序列的VP1基因编码区... 详细信息

目的可溶性表达A型口蹄疫病毒型特异性结构蛋白VP1,制备型特异性的兔抗A型FMDV VP1多克隆抗体。方法以A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因重组克隆载体pGEM-AVP1为模板,设计表达引物,经PCR扩增获得上游带有OmpT信号肽编码序列的VP1基因编码区,将其克隆至该表达载体pET-30a(+)中,构建可溶性原核表达载体pET-30a-OmpT-AVP1。将该重组质粒转化大肠杆菌工程菌株BL21-(DE3)-plysS,经IPTG诱导表达,以金属离子螯合层析法对可溶性表达的VP1融合蛋白进行纯化,然后用纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔制备其多克隆抗体,以ELISA、Western blot和间接免疫荧光法分别对多克隆抗体进行鉴定。结果 SDS-PAGE电泳分析显示pET-30a-OmpT-AVP1重组菌经诱导后表达一Mr约为33 000的VP1融合蛋白,与预期结果相符。目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带。Western blot分析结果显示,VP1蛋白可与豚鼠抗A型口蹄疫病毒阳性血清反应。用纯化VP1蛋白免疫新西兰大耳白兔制备的多克隆抗体效价达1∶12 800以上,具有较高的型特异性,并且可与同型FMDV细胞培养物中的病毒抗原发生反应。结论制备了具有高亲和性和特异性的兔抗A型FMDV结构蛋白VP1多克隆抗体,为A型FMDV易感动物的抗体筛查及病原鉴定奠定了基础。

关键词： A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1 原核表达可溶性 OmpT信号肽

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羊传染性脓疱病毒耐热冻干保护剂筛选及冻干曲线优化

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中国兽医学报 2018年第2期38卷 266-271页

作者：王光祥尚佑军王艳华宋成怡吴锦艳陈妍田宏刘湘涛张志东中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点开放实验室

采用冻干试验筛选出保护剂基础配方，再通过Plackett—Burman设计法筛选主要保护剂基质，然后通过Box-Behnken响应面分析法对羊传染性脓疱病毒（ORFV）耐热保护剂配方进一步优化，用冻干试验进一步验证筛选出1种针对ORFV保护效果最好的... 详细信息

采用冻干试验筛选出保护剂基础配方，再通过Plackett—Burman设计法筛选主要保护剂基质，然后通过Box-Behnken响应面分析法对羊传染性脓疱病毒（ORFV）耐热保护剂配方进一步优化，用冻干试验进一步验证筛选出1种针对ORFV保护效果最好的耐热冻干保护剂作为疫苗用候选配方。同时，依据前期试验获得的活疫苗冻干曲线，通过进一步优化，获得疫苗最佳冻千曲线。利用该冻干工艺冻干的疫苗，保护剂的保护率可达95．3％，且疫苗各项指标均达到《中华人民共和国兽用生物制品规程》要求。经37℃保存7，15，30d病毒滴度分别下降0．46，0．70，1．00；2～8℃保存3，6，12，24个月病毒滴度分别下降0．10，0．10，0．40，0．60，证明此配方制备的疫苗具有良好的热稳定性。本试验解决了ORFV细胞弱毒疫苗仅能在低温条件下保存和运输的瓶颈技术问题，使疫苗的储存、运输更为方便。

关键词：羊传染性脓疱病毒耐热冻干保护剂冻干曲线

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猪水泡病病毒HK′1/70株基因组全长cDNA的构建及其序列测定

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病毒学报 2007年第1期23卷 51-56页

作者：郑海学刘湘涛尚佑军张淼涛冯霞白兴文吴锦艳吕建亮孙世琪尹双辉郭建宏谢庆阁中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046 西北农林科技大学动物科学院陕西杨凌712100

从实验感染猪水泡病病毒(SVDV)的乳鼠组织中提取RNA,利用长距离的RACE技术,扩增出覆盖SVDVHK′1/70株全基因组的2个忠实性的cDNA重叠片段(3′PCR片段和5′PCR片段),分别克隆进pGEM-T Easy载体。利用AatⅡ和BssHⅡ酶切含5′PCR片段的重... 详细信息

从实验感染猪水泡病病毒(SVDV)的乳鼠组织中提取RNA,利用长距离的RACE技术,扩增出覆盖SVDVHK′1/70株全基因组的2个忠实性的cDNA重叠片段(3′PCR片段和5′PCR片段),分别克隆进pGEM-T Easy载体。利用AatⅡ和BssHⅡ酶切含5′PCR片段的重组质粒,回收目的片段,定向克隆于含3′PCR片段的重组质粒,构建出了SVDV HK′1/70株全长cDNA重组质粒,然后进行序列测定。结果表明,HK′1/70株基因组全基因组序列长7 401 nt(poly A除外),其中5′NCR长743 nt,该毒株蛋白编码区的核苷酸序列为6 558 nt,编码一个长2 185个氨基酸的聚合蛋白,3′NCR长102 nt,其后是至少含有74个A碱基的poly A尾。在HK′1/70株全长cDNA序列的5′端引入了T7启动子序列,在poly A3′端引入了Psp1406Ⅰ识别序列。通过序列同源性和进化树分析,结果表明,HK′1/70属于第Ⅱ抗原遗传群,SVDV与CB5的遗传关系最近,且位于CB5遗传进化树的分支上。HK′1/70株全长cDNA的序列测定及构建,为拯救SVDV和在分子水平进一步深入研究SVDV打下坚实的基础。

关键词：猪水泡病病毒 RACE 全长cDNA克隆分子克隆

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