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2021中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第16次学术研讨会

作者：李文卉岳龙张念章刘垠鞠闫鸿斌李立贾万忠付宝权中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室

目的:脑多头蚴病是由多头带绦虫的中绦期幼虫脑多头蚴寄生于羊等神经系统引起的一种人畜共患寄生虫病。该病可引起家畜死亡,不仅给畜牧业造成巨大的经济损失,而且威胁着人体健康。方法:本研究以多头带绦虫基因组DNA为模板,PCR扩增TmAdh... 详细信息

目的:脑多头蚴病是由多头带绦虫的中绦期幼虫脑多头蚴寄生于羊等神经系统引起的一种人畜共患寄生虫病。该病可引起家畜死亡,不仅给畜牧业造成巨大的经济损失,而且威胁着人体健康。方法:本研究以多头带绦虫基因组DNA为模板,PCR扩增TmAdh基因家族成员基因组序列,获得6个含有N端信号肽和1个FnⅢ结构域的基因序列。序列预测分析发现6个TmAdh基因都由3个外显子和2个内含子组成;其蛋白序列一致性在44.9-99.2%;进化分析发现该蛋白属于带科绦虫免疫保护性抗原家族的一个新的亚类。将TmAdh1-4基因进行在pGEX4T-1表达系统成功表达出产物大小约为39.0、38.1、38.9和37.8ku的重组蛋白,并进行反应原性及细胞黏着活性检测。结果:脑多头蚴自然感染绵羊血清与TmAdh3重组蛋白反应明显,而与TmAdh1、TmAdh2和TmAdh4重组蛋白反应不明显,而且该蛋白都具有细胞黏着活性。免疫组化表明TmAdh1-4重组蛋白主要分布在脑多头蚴原头节的上皮、顶突、小钩、组织内部有零星分布。重组蛋白的动物免疫保护实验结果显示TmAdh1、TmAdh3和TmAdh4重组蛋白免疫绵羊后抗体水平都显著上升,三免后达到峰值,攻虫后抗体水平开始逐渐下降。动物免疫保护实验表明TmAdh1、TmAdh3、TmAdh4重组蛋白的减虫率分别为61.71%、53.17%、50.76%。结论:本研究为进一步研制脑多头蚴病疫苗奠定基础。

关键词：多头带绦虫 TmAdh 纤连蛋白三型(FnⅢ)结构域原核表达黏着活性功能性抗原

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环形泰勒虫SPAG蛋白的原核表达及反应原性分析

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中国兽医科学 2020年第3期50卷 269-275页

作者：相权珈关贵全刘爱红王锦明李有全王晓星李志殷宏刘军龙罗建勋中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室甘肃兰州730046 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

根据GenBank中公布的环形泰勒虫子孢子表面抗原(SPAG)基因序列,结合生物信息学分析,对SPAG蛋白跨膜区和抗原表位进行分析。选取基因片段设计表达引物,从环形泰勒虫不同虫株的SPAG基因的保守区扩增目的片段,并构建SPAG-pET-30a重组表达载... 详细信息

根据GenBank中公布的环形泰勒虫子孢子表面抗原(SPAG)基因序列,结合生物信息学分析,对SPAG蛋白跨膜区和抗原表位进行分析。选取基因片段设计表达引物,从环形泰勒虫不同虫株的SPAG基因的保守区扩增目的片段,并构建SPAG-pET-30a重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)表达系统中进行表达,并对SPAG重组蛋白的反应原性进行分析。结果显示,获得的SPAG基因片段长度为882 bp,重组蛋白分子质量约为42 ku。反应原性分析显示,该重组蛋白可与环形泰勒虫阳性血清发生特异性反应,与中华泰勒虫、瑟氏泰勒虫、牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫的阳性血清无交叉反应。本研究结果表明,SPAG蛋白有较好的反应原性和种特异性,可作为检测环形泰勒虫的候选抗原建立相应血清学诊断方法。

关键词：环形泰勒虫 SPAG蛋白原核表达反应原性

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莫能菌素钠、磺胺嘧啶和蒿甲醚体内外抗弓形虫RH株速殖子的效果分析

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中国兽医科学 2020年第5期50卷 624-630页

作者：翟斌涛马元元谢世臣彭俊杰梁盼红朱兴全杨晓野贺君君中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室甘肃兰州730046 内蒙古农业大学兽医学院内蒙古呼和浩特010018

通过弓形虫RH株速殖子在宿主体内和体外的感染试验,比较了莫能菌素钠、磺胺嘧啶和蒿甲醚的抗弓形虫效果。体外试验:用四甲基偶氮唑盐(MTT)法,评价了3种不同浓度的药物对人包皮成纤维细胞(HFF)毒性及增殖情况;在药物的安全浓度范围内,用5... 详细信息

通过弓形虫RH株速殖子在宿主体内和体外的感染试验,比较了莫能菌素钠、磺胺嘧啶和蒿甲醚的抗弓形虫效果。体外试验:用四甲基偶氮唑盐(MTT)法,评价了3种不同浓度的药物对人包皮成纤维细胞(HFF)毒性及增殖情况;在药物的安全浓度范围内,用5×10^4个弓形虫RH株速殖子感染5×10^5个HFF细胞,每种药物设置5个浓度梯度,培养48 h后观察药物体外抑制虫体在细胞内的增殖效果;以相对抑制率为指标,评估药物的体外抗弓形虫效果。体内试验:用5×10^4个弓形虫RH株速殖子接种小鼠,4 h后,3种药物分高中低剂量组进行灌胃给药,连续给药5 d后停药,观察并记录小鼠每天死亡情况;且每天每组随机抽取1只小鼠,检查腹腔液中速殖子量及停药后是否复发,评价药物体内抗弓形虫效果。体外试验结果表明:莫能菌素钠可显著抑制细胞内弓形虫的增殖,效果优于蒿甲醚,而磺胺嘧啶的效果波动性较大。体内试验结果表明:莫能菌素钠显著延长小鼠平均存活时间,磺胺嘧啶次之,蒿甲醚最次。体内和体外试验结果均显示出莫能菌素钠能显著抑制弓形虫速殖子增殖,延长小鼠存活时间。本研究为后续抗弓形虫药物研究以及临床用药提供了参考依据。

关键词：弓形虫速殖子莫能菌素钠磺胺嘧啶蒿甲醚体内试验体外试验

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基于壳聚糖及PLGA纳米材料的刚地弓形虫DNA疫苗对小鼠的免疫保护性研究

基于壳聚糖及PLGA纳米材料的刚地弓形虫DNA疫苗对小鼠的免疫保护...

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2021中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第二届青年科学家学术论坛

作者：于正青曹万迪高旭辰 Muhammad Tahir Aleem 刘军龙罗建勋严若峰徐立新宋小凯李祥瑞南京农业大学动物医学院中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室

刚地弓形虫作为一种重要的人畜共患寄生性原虫,可以引起严重的公共卫生问题。而目前这一重要的寄生性原虫却未见有效的治疗药物及疫苗问世。利用来自于刚地弓形虫短链氧化还原家族（SDR家族）中的氧化还原酶,我们构建了弓形虫TgSDRO-pVA... 详细信息

刚地弓形虫作为一种重要的人畜共患寄生性原虫,可以引起严重的公共卫生问题。而目前这一重要的寄生性原虫却未见有效的治疗药物及疫苗问世。利用来自于刚地弓形虫短链氧化还原家族（SDR家族）中的氧化还原酶,我们构建了弓形虫TgSDRO-pVAX1 DNA疫苗,后利用纳米材料壳聚糖和聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）进行包被以提升DNA疫苗免疫保护效果。我们将构建好的TgSDRO-pVAX1质粒转染至HEK293-T细胞中,通过激光共聚焦显微镜和Western blot进行真核表达验证。体内试验结果表明,试验组小鼠血清中的抗体水平及细胞因子水平均受到了调控;脾脏淋巴细胞增殖试验结果显示淋巴细胞的增殖受到了促进;流式细胞术的结果显示,试验组树突状细胞迅速成熟并在细胞表面产生了MHC分子,产生的MHC分子进而促进了脾脏淋巴细胞CD4和CD8T淋巴细胞比例的升高;攻虫试验结果显示,经过壳聚糖及PLGA包被的TgSDRO-pVAX1 DNA疫苗可有效降低小鼠体内弓形虫负担。总之,经过壳聚糖及PLGA包被的TgSDRO-pVAX1 DNA疫苗可能成为一种有前途的抵抗弓形虫病的疫苗。

关键词：刚地弓形虫氧化还原酶壳聚糖 PLGA 免疫保护小鼠

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基于高通量测序的多房棘球蚴感染小鼠肝组织中差异circRNA的生物信息学分析

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中国兽医科学 2020年第4期50卷 437-443页

作者：李秀荣李立闫鸿斌辇晓峰张林生付宝权贾万忠中国农业科学院、兰州兽医研究所、家畜疫病病原生物学国家重点实验室、国家动物包虫病专业实验室、甘肃省动物寄生虫病重点实验室、农业部人兽共患病重点实验室甘肃兰州730046 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

分析多房棘球蚴感染小鼠肝组织中差异表达的环状RNA(circRNA),探究circRNA在宿主感染过程中可能参与的调控作用。采用高通量circRNA芯片技术比较感染组和对照组小鼠肝组织circRNA表达谱的差异,利用生物信息学对差异circRNA亲本基因进行G... 详细信息

分析多房棘球蚴感染小鼠肝组织中差异表达的环状RNA(circRNA),探究circRNA在宿主感染过程中可能参与的调控作用。采用高通量circRNA芯片技术比较感染组和对照组小鼠肝组织circRNA表达谱的差异,利用生物信息学对差异circRNA亲本基因进行GO和KEGG富集分析。结果显示,上调表达的circRNA有201个,下调表达的circRNA有9个,差异表达共计210个,经实时荧光定量PCR验证出其中4个上调和2个下调差异circRNA的表达水平变化趋势与芯片结果相一致。GO富集分析显示,在分子功能、生物过程及细胞组分均有富集;KEGG富集通路则有内吞作用、SNARE蛋白相关囊泡运动、矿物质吸收等与免疫相关的信号通路。结果提示,感染多房棘球蚴的小鼠肝组织与对照组小鼠肝组织比较,circRNA表达谱发生了显著性变化,这些差异表达的circRNA及其潜在的靶分子可能与多房棘球蚴感染宿主早期免疫反应有关。

关键词：多房棘球蚴小鼠环状RNA 生物信息学高通量测序

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弓形虫Tgcsp2基因敲除株的表型和毒力

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中国兽医学报 2020年第1期40卷 140-146页

作者：牛美容李法财谢世臣聂兰碧朱兴全赵光辉西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100 中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点/甘肃省动物寄生虫病重点实验室甘肃兰州730046

为研究弓形虫冷休克蛋白2(cold shock domain protein 2 of ***,Tgcsp2)在弓形虫感染宿主过程中的作用,本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了弓形虫Tgcsp2基因缺失株(ΔTgcsp2)。通过空斑试验和细胞裂解试验探究ΔTgcsp2虫株在体外的生长能... 详细信息

为研究弓形虫冷休克蛋白2(cold shock domain protein 2 of ***,Tgcsp2)在弓形虫感染宿主过程中的作用,本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了弓形虫Tgcsp2基因缺失株(ΔTgcsp2)。通过空斑试验和细胞裂解试验探究ΔTgcsp2虫株在体外的生长能力,结果表明ΔTgcsp2虫株的空斑形成能力和细胞裂解能力相对于RH野生株较弱;弓形虫感染细胞要经过入侵、复制和逸出3个过程。为探究Tgcsp2影响体外感染的具体过程,本研究对ΔTgcsp2虫株和RH野生株进行入侵试验、复制试验和逸出试验,结果表明ΔTgcsp2虫株的入侵能力、复制能力和逸出能力都有不同程度的减弱;将ΔTgcsp2虫株和RH野生株感染BALB/c小鼠进行了体内毒力试验;结果表明,与RH野生株相比,ΔTgcsp2虫株对小鼠的毒力减弱。综上所述,Tgcsp2基因对弓形虫体外生长和体内毒力具有重要的作用。

关键词：弓形虫 Tgcsp2 CRISPR/Cas9 入侵复制逸出

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亚洲带绦虫45 kDa雌激素调节蛋白的表达及其杂交瘤细胞株的筛选与鉴定

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2019年第1期37卷 70-74页

作者：王立群梁盼红张少华侯俊玲王莉杰毛立骆学农中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室兰州730046

目的筛选并制备亚洲带绦虫45 kDa雌激素调节蛋白(Ta EP45)的杂交瘤细胞株。方法设计带有酶切位点的特异性引物,以亚洲带绦虫成虫总RNA为模板, RT-PCR扩增Ta EP45完整的开放阅读框(ORF),克隆至原核表达载体pET-30a (+),转化至大肠埃希菌B... 详细信息

目的筛选并制备亚洲带绦虫45 kDa雌激素调节蛋白(Ta EP45)的杂交瘤细胞株。方法设计带有酶切位点的特异性引物,以亚洲带绦虫成虫总RNA为模板, RT-PCR扩增Ta EP45完整的开放阅读框(ORF),克隆至原核表达载体pET-30a (+),转化至大肠埃希菌BL21 (DE3),用1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达带组氨酸(His)标签的TaEP4蛋白,用亚洲带绦虫囊尾蚴阳性猪血清蛋白质印迹(Western blotting)分析Ta EP45的反应原性。以纯化的Ta EP45免疫BALB/c小鼠(100μg/鼠,首次免疫用等量弗氏完全佐剂,第2、第3次免疫用等量弗氏不完全佐剂),选择血清抗体效价高的小鼠,取脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合,用纯化的Ta EP45和His标签蛋白ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株,用亚洲带绦虫全虫抗原Western blotting鉴定杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。结果 RT-PCR扩增获得的Ta EP45基因ORF长1 362 bp,编码453个氨基酸。重组融合蛋白的相对分子质量(Mr)约为60 000,可被亚洲带绦虫囊尾蚴阳性猪血清识别。筛选获得5株稳定分泌Ta EP45抗体的杂交瘤细胞株,其抗体效价均≥1∶2 430,亚型分别为IgG2b或IgG1。Western blotting分析结果显示, 5株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体均能与亚洲带绦虫全虫抗原发生反应。结论表达纯化了Ta EP45,筛选出5株能稳定分泌高滴度Ta EP45单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌的单克隆抗体能与亚洲带绦虫全虫抗原发生反应。

关键词：亚洲带绦虫 45 kDa雌激素调节蛋白杂交瘤细胞株

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一种无外源菌DNA污染的鸡球虫卵囊的制备方法

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黑龙江畜牧兽医 2020年第5期 108-111,151页

作者：龚振兴刘保红马雪婷殷昊李法财蔡建平中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/甘肃省动物寄生虫病重点实验室兰州730046 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

为了获得无鸡肠道和粪便细菌DNA污染的鸡球虫卵囊,试验采用实验室制备的无微生物污染的水配制相关试剂,对柔嫩艾美耳球虫卵囊采用漂浮纯化、灭菌处理和外源菌DNA去除等方法,获得高纯度的柔嫩艾美耳球虫卵囊;提取卵囊的基因组DNA,用细菌1... 详细信息

为了获得无鸡肠道和粪便细菌DNA污染的鸡球虫卵囊,试验采用实验室制备的无微生物污染的水配制相关试剂,对柔嫩艾美耳球虫卵囊采用漂浮纯化、灭菌处理和外源菌DNA去除等方法,获得高纯度的柔嫩艾美耳球虫卵囊;提取卵囊的基因组DNA,用细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增并进行序列分析,以鉴定该卵囊是否被外源菌DNA污染。结果表明:提取的柔嫩艾美耳球虫卵囊基因组DNA经PCR方法检测外源DNA呈阴性。说明用此方法制备的柔嫩艾美耳球虫卵囊无外源菌DNA污染,可用于制备高纯度的无外源菌DNA污染的鸡球虫卵囊。

关键词：鸡球虫卵囊制备基因组DNA 外源菌DNA

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球孢白僵菌对小亚璃眼蜱的毒力测定及其孢外水解酶活性分析

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中国动物检疫 2021年第12期38卷 116-120页

作者：孙明任巧云漆晶晶聂英马超赵鑫潘丽仲富萍甘肃省民勤县畜牧兽医工作站甘肃武威733000 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室甘肃兰州730046 甘肃省武威市畜牧兽医总站甘肃武威733000

球孢白僵菌作为一种很重要的生防真菌,已被广泛用于农业害虫和蜱的防治。在侵染宿主的同时,球孢白僵菌分泌大量孢外水解酶,如孢外蛋白酶和几丁质酶。这些酶类不但能够降解宿主表皮,而且被认为是菌株致病性的关键决定因子。为获得高毒力... 详细信息

球孢白僵菌作为一种很重要的生防真菌,已被广泛用于农业害虫和蜱的防治。在侵染宿主的同时,球孢白僵菌分泌大量孢外水解酶,如孢外蛋白酶和几丁质酶。这些酶类不但能够降解宿主表皮,而且被认为是菌株致病性的关键决定因子。为获得高毒力菌株的筛选方法,选取实验室分离鉴定的5株球孢白僵菌菌株,通过测定菌株的孢外水解酶活性和菌株对小亚璃眼蜱的致死率,并对球孢白僵菌的毒力和酶活性进行了相关性分析。结果显示,菌株蛋白酶活性与菌株毒力无相关性,菌株几丁质酶活性与菌株毒力呈现负相关性。本研究为蜱生防高毒力菌株的筛选以及酶活性的初步分析提供了理论依据。

关键词：球孢白僵菌蜱孢外蛋白酶几丁质酶昆虫病原真菌

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环形泰勒虫TA04380蛋白的原核表达及间接ELISA诊断方法的建立

环形泰勒虫TA04380蛋白的原核表达及间接ELISA诊断方法的建立

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2021中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第二届青年科学家学术论坛

作者：曹天行张志刚石苗关贵全李有全殷宏罗建勋刘军龙中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心

牛环形泰勒虫病又称热带泰勒虫病(Tropical theileriosis),是由璃眼蜱传播的环形泰勒虫感染牛淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞及红细胞,引发牛体表淋巴结肿大和贫血等症状的血液原虫病。该病与东方泰勒虫病经常出现混合性感染,且多呈急... 详细信息

牛环形泰勒虫病又称热带泰勒虫病(Tropical theileriosis),是由璃眼蜱传播的环形泰勒虫感染牛淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞及红细胞,引发牛体表淋巴结肿大和贫血等症状的血液原虫病。该病与东方泰勒虫病经常出现混合性感染,且多呈急性型经过,感染率和死亡率都很高,是影响养畜牧业发展的重要疾病之一。为更好的区分检测环形泰勒虫,本研究建立了一种特异性良好的检测环形泰勒虫的间接ELISA方法。根据GeneBank上公布环形泰勒虫TA04380基因序列,构建在pET-30a(+)重组质粒,诱导表达并纯化该重组蛋白。通过蛋白免疫印迹分析TA04380重组蛋白的反应原性及与其他牛梨形虫交叉反应性。最终以TA04380重组蛋白为靶标分子建立一种诊断热带泰勒虫病的间接ELISA诊断方法,并与以SPAG蛋白建立的ELISA诊断方法进行比较。结果显示,免疫印迹结果显示TA04380重组蛋白能够与环形泰勒虫阳性血清和抗His单克隆抗体反应,与东方泰勒虫、中华泰勒虫、牛巴贝斯虫、牛双芽巴贝斯虫阳性血清及阴性牛血清无交叉反应。以本研究建立的间接ELISA方法与已发表的SPAG蛋白ELISA方法对同一批野外样品进行比较,检出率分别是54.4%(68/125)和49.6%(62/125),表明该方法具有较高的灵敏性和符合性,可用于诊断热带泰勒虫病的血清学诊断方法。综上,本研究中建立的以TA04380为靶标分子的间接ELISA诊断方法,具有较高的灵敏性、特异性,可用于大规模诊断热带泰勒虫病。

关键词：环形泰勒虫 TA04380 原核表达反应原性分析间接ELISA方法

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