为了探究利卡灵-B在体外和体内的抗弓形虫活性,并探究其抗弓形虫作用机制,本文建立绿猴肾细胞感染弓形虫速殖子的感染模型,分别用荧光定量PCR法和Giemsa染色法检测利卡灵-B对虫体增殖和入侵宿主细胞的抑制作用。建立弓形虫的急性感染的小鼠模型,采用腹腔注射的方式对不同浓度利卡灵-B的体内抗虫效果进行评价。采用透射电镜观察利卡灵-B孵育后弓形虫的超微结构的变化,随后用MitoTracker Red CMXRos探针、MDC和DAPI染色液验证利卡灵-B对弓形虫产生的影响;采用流式细胞术检测利卡灵-B是否引起弓形虫死亡。结果显示,在体外活性试验中,利卡灵-B抑制虫体增殖,半数抑制浓度为14.05±3.96μg/mL,抑制虫体入侵宿主细胞,且呈浓度依赖性。在小鼠急性感染模型的体内药效学试验中,低剂量腹腔注射组存活率为50%,高剂量腹腔注射组的存活率为90%。透射电镜观察显示:利卡灵-B引起了虫体线粒体肿胀,周围出现自噬的双层膜结构,在孵育后24 h,虫体内细胞核周围出现裂隙,核膜消失;通过MitoTracker Red CMXRos探针标记、MDC和DAPI染色后发现,利卡灵-B引起弓形虫线粒体损伤,产生自噬,破坏细胞核结构,流式细胞仪检测进一步证实利卡灵-B引起弓形虫死亡。研究结果发现,利卡灵-B可以抑制虫体入侵和增殖,可以保护弓形虫急性感染的小鼠免于死亡,对弓形虫的抑制作用可能与线粒体自噬有关。
[目的]本文旨在研究肉豆蔻木脂素抗弓形虫RH株的体内和体外活性,并探讨其作用机制。[方法与结果]采用CCK-8法检测了肉豆蔻木脂素对绿猴肾细胞(Vero)的细胞毒性,结果表明在132μg/mL剂量以下,肉豆蔻木脂素对Vero细胞没有细胞毒性。肉豆蔻木脂素在20～90μg/mL的浓度范围内,可显著降低弓形虫的入侵和增值,半数抑制浓度为32.41μg/mL。在弓形虫感染Balb/c小鼠的急性感染模型中,肉豆蔻木脂素采用腹腔注射方式给药,显著降低了Balb/c小鼠的组织中的弓形虫荷载量(P<0.01)。采用扫描电镜和透射电镜观察肉豆蔻木脂素对弓形虫超微结构的影响,结果显示肉豆蔻木脂素孵育后,引起弓形虫速殖子表面形变和线粒体肿胀、变形和脊结构破坏,并有类似自噬的双层膜结构产生。采用MitoTracker Red CMXRos探针验证了肉豆蔻木脂素孵育后虫体线粒体膜电位的下降,同时,ATP水平下降。MDC染色显示肉豆蔻木脂素引起了弓形虫的自噬,且自噬基因在mRNA水平和蛋白水平的表达量显著增加。[结论]试验结果表明,肉豆蔻木脂素具有较好的体内和体外抗虫效果,可能通过损伤弓形虫线粒体功能,引起弓形虫自噬,导致弓形虫死亡。肉豆蔻木脂素可作为抗弓形虫候选先导化合物,具有开发成为新的抗弓形虫治疗药物的潜在价值。
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