检索结果-内蒙古大学图书馆

中国预防兽医学报 2025年第2期47卷 117-123页

作者：赵志国田井满李明慧白晓利宋兴栋李雁冰陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室/农业农村部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

2023年5月本实验室从家禽的监测样品中分离到一株H5N6亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV),命名为A/chicken/Jiangsu/S1/2023(H5N6)株,简称CK/JS/S1/2023(H5N6)株。为进一步了解该病毒的生物学特性,本研究对其进行全基因组的分段PCR扩增与测... 详细信息

2023年5月本实验室从家禽的监测样品中分离到一株H5N6亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV),命名为A/chicken/Jiangsu/S1/2023(H5N6)株,简称CK/JS/S1/2023(H5N6)株。为进一步了解该病毒的生物学特性,本研究对其进行全基因组的分段PCR扩增与测序分析各基因节段编码的关键氨基酸位点及各基因节段的遗传演化分析,采用Simplot软件分析该病毒全基因组的重配事件,采用交叉血凝抑制试验分析该病毒的抗原性。结果显示,该病毒HA蛋白的裂解位点为PLRERRRKR↓GLF,符合HPAIV的分子特征。关键氨基酸位点分析显示HA蛋白受体结合区域出现S^(133)A和T^(156)A增强病毒与人型受体(α2,6)结合能力的突变;NA蛋白颈部出现了aa59~aa69的缺失;PB1蛋白的D622G、M1蛋白的^(I43)M和T^(215)A及NS1蛋白的I106M,这些位点的突变均可以增强病毒对哺乳动物的致病性。遗传演化分析结果显示,该病毒HA基因属于2.3.4.4b亚分支,NA基因及5个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M)均属于欧亚分支,NS基因属于等位基因A分支(Allele A)。基因重配分析结果显示该病毒是由野鸟源的H5N8和家鸭源的H5N6、H4N6和H3N2AIV形成的一株多元重配病毒。抗原性分析结果显示,该病毒与2.3.4.4b亚分支H5-Re14疫苗株抗原性相匹配。将该病毒以10~1EID_(50)/50μL~10~6EID_(50)/50μL剂量经鼻腔感染小鼠,通过小鼠的存活率和各脏器病毒滴度分析该病毒的致病性。结果显示,感染组小鼠均出现精神沉郁、被毛凌乱、体质量下降等症状,感染该病毒后第4 d开始出现死亡。经计算该病毒对小鼠的半数致死量(MLD_(50))为1.5 log_(10)EID_(50),呈高致病性(MLD_(50)<3 log_(10)EID_(50))。该病毒不经提前适应即可在小鼠的多脏器中有效复制,其在肺脏中的病毒滴度最高,达到7.25 log_(10)EID_(50)/m L。本研究通过对H5N6亚型HPAIV的部分生物学特性研究,为2.3.4.4b亚分支H5亚型HPAI的防控提供数据支持与借鉴。

关键词： H5N6亚型高致病性禽流感病毒分子特征遗传演化抗原性哺乳动物致病性

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宿主细胞磷酸甘油酸变位酶5调控A型流感病毒复制机制的研究

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中国预防兽医学报 2024年第9期46卷 885-894,922页

作者：王雨琴李奇兵王波王一涵刘旭伟单智博王一晗李梦雅李呈军陈化兰姜丽中国农业科学院哈尔滨兽医所动物疫病防控全国重点实验室/农业农村部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

为探究宿主因子磷酸甘油酸变位酶5(PGAM5)调控A型流感病毒复制的机制,本研究设计并合成PGAM5 siRNA和阴性对照Scrambled siRNA(NC siRNA),将二者分别转染A549细胞后,采用荧光定量PCR(qPCR)和western blot(WB)检测该siRNA的干扰效果,利... 详细信息

为探究宿主因子磷酸甘油酸变位酶5(PGAM5)调控A型流感病毒复制的机制,本研究设计并合成PGAM5 siRNA和阴性对照Scrambled siRNA(NC siRNA),将二者分别转染A549细胞后,采用荧光定量PCR(qPCR)和western blot(WB)检测该siRNA的干扰效果,利用细胞活力试剂盒检测下调PGAM5表达对细胞活力的影响。结果显示,与转染NC siRNA的阴性对照细胞相比,PGAM5 siRNA能够极显著抑制PGAM5在A549细胞中的转录及表达水平(P<0.001、P<0.01)且对细胞活力基本无影响。为探究PGAM5对流感病毒复制的影响,将PGAM5siRNA和NC siRNA分别转染A549细胞36 h后经流感病毒A/WSN/1933(WSN,H1N1)株感染,分别于感染后24 h、48 h及72 h收获上清经噬斑滴定测定各组细胞中的病毒滴度;分别于感染后3 h~5 h采用WB检测病毒各蛋白的表达水平。结果显示,与阴性对照细胞相比,随着感染时间的延长,转染PGAM5 siRNA细胞中的病毒滴度均极显著下降(P<0.001),尤其在转染后72 h病毒滴度下降最多;且该细胞中流感病毒PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1和NS1蛋白的表达水平均呈下降趋势,以感染后3 h上述蛋白表达水平的降低最为显著。为探究PGAM5调控流感病毒复制的机制,将PGAM5 siRNA和NC siRNA分别转染A549细胞,36 h后以MOI 10 WSN株感染细胞,1 h后分别采用WB检测病毒NP蛋白的表达水平,分析PGAM5对流感病毒吸附和内吞的影响,并于感染后0、3 h、4 h及5 h通过激光共聚焦试验检测细胞内病毒NP蛋白的定位,以确定下调PGAM5对流感病毒vRNP复合体入核及出核的影响,采用Image J统计含病毒NP蛋白的细胞在v RNP复合体入核及出核中的比例。结果显示,与对照组相比,下调PGAM5基因的表达后,吸附在细胞表面或内吞进入各组细胞中的病毒粒子中NP蛋白的表达水平均无显著差异。激光共聚焦观察可见,在下调PGAM5表达的细胞中,病毒NP蛋白先定位于细胞表面,再向细胞核内聚集,而后完成出核、最后定位在细胞质中,与阴性对照细胞结果一致;但在该组细胞中,病毒NP蛋白趋向出核以及完成出核的细胞比例均显著低于阴性对照细胞(P<0.05)。将p CAGGS、pCAGGS-PGAM5及pCAGGS-PGAM5+pCAGGS-Importinα1/3/5/7-Flag/PGAM5和pCAGGS-PGAM5、pCAGGS-Importinβ1-Flag以及pCAGGS-PGAM5+pCAGGS-Importinβ1-Flag分别转染HEK293T细胞,24 h后利用Co-IP试验检测PGAM5与核输入蛋白的相互作用;将pCAGGS-PGAM5、pCAGGS-NS2-Flag及pCAGGS-PGAM5+pCAGGS-NS2-Flag和pCAGGS-PGAM5、pCAGGS-M1-Myc及pCAGGSPGAM5+pCAGGS-M1-Myc分别转染HEK293T细胞,24 h后经Co-IP试验检测PGAM5与核输出蛋白的相互作用。结果显示,PGAM5与核输入蛋白Importinα1/α3/α5/α7及Importinβ1及核输出蛋白M1/NS2均无相互作用。提示,宿主因子PGAM5可能并非通过与M1/NS2的互作调控流感病毒vRNP复合体的出核。本研究首次报道宿主因子PGAM5可以促进流感病毒的复制,且其主要参与调控流感病毒vRNP复合体的出核过程。本研究为深入了解PGAM5蛋白功能奠定了研究基础,也为流感的防控提供了新思路。

关键词：流感病毒复制磷酸甘油酸变位酶5

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A型流感病毒PB2蛋白帽子结合结构域的原核表达与鉴定

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中国预防兽医学报 2024年第2期46卷 107-112,139页

作者：林维鹏崔鹏飞王思文邓国华陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室/农业农村部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

A型流感病毒是一种重要的人畜共患病病原,严重威胁全球公共卫生安全。PB2蛋白的帽子结合结构域(CBD)在流感病毒的转录过程中发挥重要功能,是抗流感病毒药物的重要靶点之一。为获得高纯度原核表达的A型流感病毒的CBD蛋白,本研究利用同源... 详细信息

A型流感病毒是一种重要的人畜共患病病原,严重威胁全球公共卫生安全。PB2蛋白的帽子结合结构域(CBD)在流感病毒的转录过程中发挥重要功能,是抗流感病毒药物的重要靶点之一。为获得高纯度原核表达的A型流感病毒的CBD蛋白,本研究利用同源重组策略将8×His标签与一株H5N1亚型高致病性禽流感病毒的CBD区基因序列克隆至原核表达载体pET28a中,构建重组质粒pET28a-8×His-CBD,经PCR及测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经不同浓度IPTG诱导不同时间后,经SDS-PAGE检测蛋白表达后使用镍柱纯化。结果显示,菌体裂解上清中在21 ku处可见目的条带,与8×His-CBD蛋白预期大小符合,且以0.5 mmol/L IPTG于37℃诱导6 h时蛋白表达量最高,镍柱纯化后可获得纯度大于95%的8×His-CBD蛋白。为确定该蛋白是否具有生物学活性,本研究以帽子结构类似物m7GTP对其进行等温滴定量热试验,结果显示8×His-CBD蛋白和m~7GTP结合时存在明显热峰,表明8×His-CBD蛋白具有生物学活性;经计算,其Kd值为1.71×10^(-5)(±2.92×10^(-6))mol/L。本研究结果对流感病毒的基础研究和抗流感病毒药物的研发具有借鉴意义。

关键词： A型流感病毒 PB2蛋白帽子结合结构域原核表达纯化

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醛糖还原酶AKR1B1调控甲型流感病毒复制机制的初步研究

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中国预防兽医学报 2024年第8期46卷 775-782页

作者：王一晗王波王雨琴李奇兵王一涵李梦雅姜丽陈化兰李呈军中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室/农业农村部动物流感重点开发实验室黑龙江哈尔滨150069

醛糖还原酶AKR1B1属于醛酮还原酶家族,是一种NADPH依赖性酶,可催化还原亲水性和疏水性醛。本实验室前期实验发现AKR1B1可以抑制流感病毒复制。为了探究醛糖还原酶AKR1B1调控流感病毒复制的具体机制,本研究通过siRNA干扰下调A549细胞中AK... 详细信息

醛糖还原酶AKR1B1属于醛酮还原酶家族,是一种NADPH依赖性酶,可催化还原亲水性和疏水性醛。本实验室前期实验发现AKR1B1可以抑制流感病毒复制。为了探究醛糖还原酶AKR1B1调控流感病毒复制的具体机制,本研究通过siRNA干扰下调A549细胞中AKR1B1基因的表达后,经荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测细胞内AKR1B1 m RNA的转录水平;通过western blot检测siRNA干扰后细胞内AKR1B1蛋白的表达水平;采用噬斑滴定法检测过表达及干扰AKR1B1后对流感病毒滴度的影响;通过western blot检测干扰AKR1B1表达后对细胞内病毒蛋白表达量的影响及甲型流感病毒A/WSN/33(H1N1)(简写为WSN)感染过程中对内源AKR1B1蛋白表达量的影响;采用激光共聚焦试验检测干扰AKR1B1表达对流感病毒NP蛋白核转运的影响;利用双荧光素酶报告系统检测过表达AKR1B1对流感病毒聚合酶活性的影响。RT-qPCR检测结果显示si_AKR1B1_671和si_AKR1B1_721均能极显著下调A549细胞中AKR1B1基因mRNA的转录水平,与对照组相比分别下降95.62%和85.10%(P<0.001),且不影响细胞活力;western blot检测结果显示si_AKR1B1_671能极显著降低细胞中AKR1B1蛋白的表达量(P<0.001),干扰AKR1B1能够增加细胞内病毒蛋白HA、PB2、NP、M1和NS1的表达量;噬斑滴定结果显示,与对照组相比,干扰AKR1B1表达能显著增加流感病毒WSN的病毒滴度,于感染后24 h和48 h病毒滴度分别上升了4.39倍(P<0.01)和5.53倍(P<0.001);与对照组相比,过表达AKR1B1后,流感病毒滴度于感染后24 h和48 h分别下降了62.59%(P<0.01)和82.78%(P<0.001);激光共聚焦试验结果显示,干扰AKR1B1表达不影响流感病毒的入核和出核阶段;Western blot检测结果显示,在流感病毒WSN感染过程中,细胞内源AKR1B1蛋白的表达量较为稳定,不受病毒感染的影响;双荧光素酶报告试验结果显示,与对照组相比,过表达AKR1B1后流感病毒的聚合酶活性下降了26.24%(P<0.001)。上述结果首次表明,醛糖还原酶AKR1B1通过抑制流感病毒聚合酶活性抑制流感病毒复制,干扰AKR1B1蛋白表达对流感病毒NP蛋白的入核和出核均无影响,并且流感病毒感染不影响细胞内源性AKR1B1的表达。本研究初步探究了宿主因子AKR1B1参与流感病毒复制的分子机制,为进一步了解流感病毒的复制调控提供了实验数据。

关键词：流感病毒醛糖还原酶 AKR1B1 流感病毒聚合酶

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一株欧亚类禽H1N1亚型猪流感病毒的遗传进化分析及其对小鼠的致病力研究

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中国预防兽医学报 2023年第6期45卷 553-558页

作者：刘雅茹宋祖晨孟飞黄凯伦王飞飞陈艳陈化兰杨焕良中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室/农业农村部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

猪流感病毒(SIV)是一种重要的人兽共患病毒,不仅对养猪业造成重大的经济损失,也对其他哺乳动物和人类有潜在感染风险。本研究团队前期对山东猪群常规流行病学调查时分离到一株H1N1亚型SIV,简称SW/SD/260/2021株,为了解该SIV的生物学特... 详细信息

猪流感病毒(SIV)是一种重要的人兽共患病毒,不仅对养猪业造成重大的经济损失,也对其他哺乳动物和人类有潜在感染风险。本研究团队前期对山东猪群常规流行病学调查时分离到一株H1N1亚型SIV,简称SW/SD/260/2021株,为了解该SIV的生物学特征和其对小鼠的致病性,本研究利用鸡胚对病毒纯化传代后,采用Reed-Muench方法测定SIV SW/SD/260/2021株EID50、TCID50,对其全基因组测序并分析其同源性。采用MEGA7.0中的邻接法构建HA和NA基因的进化树。进一步将该SIV以106 EID50/只滴鼻感染小鼠,于感染后3 d剖杀各组小鼠,采集各脏器组织,检测其体内病毒的复制情况,剩余小鼠在14 d内观察临床症状、记录体质量等,评价该SIV对哺乳动物的致病性。结果显示,该病毒株经纯化后EID50为107.25/0.1 mL,TCID50为105.67/0.1 mL;全基因组序列的BLAST比对结果显示,该病毒株的8个节段与来自辽宁、天津、Oman(阿曼苏丹)、江苏等多地不同年份的H1N1猪或人流感病毒高度同源。小鼠致病性试验结果显示,该病毒在小鼠的鼻甲和肺中呈高水平复制,病毒滴度均达104 EID50以上;感染组小鼠出现精神沉郁、被毛凌乱、食欲减退、体质量快速下降等症状,并于感染后第4 d全部死亡。本研究对欧亚类禽H1N1亚型SIV的序列进行分析,阐明了该病毒的基因遗传演化、分子特征和致病性,并揭示了欧亚类禽H1N1亚型SIV的跨种传播风险,为我国SIV的监测和SI的防控提供参考依据。

关键词：猪流感病毒 H1N1 进化分析致病力

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一株野鸟源H5N8高致病性禽流感病毒的遗传演化分析及生物学特性研究

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中国预防兽医学报 2023年第5期45卷 445-451页

作者：白晓利李明慧田井满宋兴栋刘丽娜李雁冰陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室/农业农村部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

2021年本实验室从发病野鸟组织样品中分离到一株H5N8亚型禽流感病毒(AIV),命名为A/black-headed gull/Tibet/1-2/2021(H5N8),简称为BH Gull/TB/1-2/2021(H5N8)。为进一步了解该病毒的生物学特性,本研究对其基因组测序并经遗传演化分析,... 详细信息

2021年本实验室从发病野鸟组织样品中分离到一株H5N8亚型禽流感病毒(AIV),命名为A/black-headed gull/Tibet/1-2/2021(H5N8),简称为BH Gull/TB/1-2/2021(H5N8)。为进一步了解该病毒的生物学特性,本研究对其基因组测序并经遗传演化分析,结果显示,该病毒HA蛋白的裂解位点为PLREKRRKR↓GLF,符合高致病性AIV(HPAIV)的分子特征。在遗传进化上HA基因属于2.3.4.4b分支,外部基因与部分内部基因(PB1、PA、NP、NS)均与2020年~2021年分离到的H5N8亚型AIV相应基因的同源性最高,且处于同一分支;PB2基因与一株H9N2亚型AIV PB2基因同源性最高,为99.25%;M基因与近两年流行的2.3.4.4b分支H5N1亚型AIV同源性最高,且处于同一分支,推测该病毒为一株重组病毒。抗原性分析结果显示,该病毒与2.3.4.4分支H5-Re8、2.3.4.4b分支H5-Re14疫苗株抗原性相近。不同哺乳动物细胞系生长曲线结果显示,该病毒可在哺乳动物细胞系中有效复制,但其在A549中的复制效率高于其在MDCK及293T细胞中的复制效率。BALB/c小鼠感染实验结果显示,该病毒不经提前适应即可在小鼠的多脏器中有效复制,对小鼠的半数致死量(MLD50)为0.98log10EID50,对小鼠呈高致病性。本研究结果对H5亚型HPAI的综合防控和公共安全预警具有借鉴意义。

关键词： H5N8 高致病性禽流感遗传演化分析抗原性分析哺乳动物致病性

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一株H1N1亚型猪流感病毒的遗传演化分析及在雪貂体内复制和飞沫传播能力评估

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中国预防兽医学报 2023年第10期45卷 987-993页

作者：张奕杰孟飞杨焕良宋祖晨陈艳陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室/农业农村部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

本实验室于2016年在天津分离到一株猪流感病毒(SIV),命名为A/swine/Tianjin/312/2016(H1N1)(简称为TJ312株)。为了解该株病毒的生物学特性及遗传演化特征,本研究对经PCR分段扩增该病毒全基因组并测序,采用SeqMan软件拼接成全基因组序列... 详细信息

本实验室于2016年在天津分离到一株猪流感病毒(SIV),命名为A/swine/Tianjin/312/2016(H1N1)(简称为TJ312株)。为了解该株病毒的生物学特性及遗传演化特征,本研究对经PCR分段扩增该病毒全基因组并测序,采用SeqMan软件拼接成全基因组序列经BLAST比对,得到与该SIV各基因节段序列同源性最高的病毒株,采用mafft分析其各基因节段编码氨基酸序列的分子特征,利用MEGA5.1软件分别构建该病毒8个基因节段的进化树。结果显示,SIV TJ312株各基因节段与2016年分离自天津的H1N1 SIV相应各基因节段的同源性在99%~100%。进化树结果显示该病毒株HA、NA和M基因均来自欧亚类禽H1N1(EA H1N1)SIV谱系;PB2、PB1、PA和NP基因来自2009/H1N1流感病毒谱系;NS基因来自北美三重配H1N2 SIV谱系。蛋白分子特征分析结果显示,HA蛋白碱性氨基酸裂解位点序列为PSIQSR↓G,符合低致病性流感病毒分子特征;受体结合位点符合人源唾液酸受体(α-2,6唾液酸受体)的分子特性;NA蛋白aa275为H、aa295为N,且该蛋白头部区域未缺失,表明该病毒对奥司他韦类药物敏感;PA蛋白^(356)R为病毒复制增强和对哺乳动物致病性增强的分子特征;NP蛋白存在^(41)I以及^(210)E病毒聚合酶活性增强的分子特征;M2蛋白的^(31)N表示该SIV对金刚烷胺类药物耐药。将该病毒以10^(6) EID_(50)/只经鼻腔感染2只雪貂,感染后96 h剖杀,采集各脏器组织观察其剖检病变并对出现病变的肺脏制备病理切片观察其组织病变,采用免疫组化试验检测肺脏组织中的病毒抗原。将采集的所有脏器处理后接种鸡胚检测脏器内的病毒滴度评估该病毒在雪貂体内的复制能力;将该株病毒以上述剂量经鼻腔感染3只雪貂分别放入3个铁笼内作为感染组,24 h后在相邻3个铁笼内分别放入1只未感染雪貂作为传播组。所有雪貂自感染组接种病毒后2 d起,隔天采集鼻洗液至第14 d,通过检测雪貂鼻洗液内的病毒滴度与感染后21 d血清HI抗体效价评估病毒在雪貂间的飞沫传播能力。结果显示,TJ312株感染后引起雪貂肺脏明显的剖检病变,其余脏器均无肉眼可见病变。肺脏病理切片及免疫组化结果显示,肺脏组织出现了一定的病理损伤,且支气管上皮细胞中出现大量棕黄色和深棕色颗粒,即检测到了病毒抗原。病毒滴定结果显示,TJ312株在雪貂呼吸道内复制良好,在其鼻甲中复制能力最强,平均病毒滴度6.13 log_(10)EID_(50)/mL,在其肺右下叶中的复制能力次之,平均病毒滴度可达6 log_(10)EID_(50)/mL。在脾脏、肾脏、肝脏中均未检出病毒。但在1只雪貂的脑中检出微量病毒,滴度为0.63 log_(10)EID_(50)/mL。飞沫传播试验中,感染组3只雪貂的鼻洗液中均检测到高滴度的病毒,病毒滴度最高达5.50 Log_(10)EID_(50)/mL,血清中均检测到了高水平的HI抗体效价(1∶1280、1∶1280、1∶2560);传播组3只雪貂中有1只鼻洗液病毒滴定结果呈阳性(最高达5.75 Log_(10)EID_(50)/mL)且其血清中检出较高的HI抗体效价(1∶2560)。上述结果表明,TJ312株可能是由2016年天津其他H1N1 SIV间的基因节段重组而来,且该株病毒存在部分耐药性及对哺乳动物致病性增强的氨基酸分子特征。病毒在雪貂的呼吸道中复制水平较高并对其肺脏造成损害,且可以通过飞沫在雪貂间传播。本研究为进一步了解EA H1N1 SIV的生物学特性及探究其感染机制提供一定的参考依据。

关键词：猪流感病毒欧亚类禽H1N1 遗传演化飞沫传播

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