检索结果-内蒙古大学图书馆

中国动物传染病学报 2012年第6期20卷 36-39页

作者：刘银冰陈利苹鄢秋龙曹俊刘思国黑龙江八一农垦大学动物科技学院大庆163319 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室哈尔滨150001

从副结核分支杆菌K-10菌株基因组中扩增出516 bp的MAP1588C基因片段,插入原核表达载体pET-28b(+),转化至大肠杆菌BL21(DE3),在0.5 mmol/L的IPTG诱导下进行表达;利用融合蛋白的组氨酸标签进行亲和层析纯化重组蛋白;通过抗6 His标签抗体的... 详细信息

从副结核分支杆菌K-10菌株基因组中扩增出516 bp的MAP1588C基因片段,插入原核表达载体pET-28b(+),转化至大肠杆菌BL21(DE3),在0.5 mmol/L的IPTG诱导下进行表达;利用融合蛋白的组氨酸标签进行亲和层析纯化重组蛋白;通过抗6 His标签抗体的Western blot验证了纯化蛋白产物;另外,副结核阳性牛血清可检测到该蛋白条带。结果表明,表达的重组蛋白MAP1588C的蛋白分子量为21 kDa,具有良好抗原性,有望将此抗原用于建立副结核的ELISA诊断方法。

关键词：副结核分支杆菌 MAP1588C蛋白重组表达免疫性

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结核分枝杆菌rv3036c基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

结核分枝杆菌rv3036c基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第九次学术研讨会

作者：陈利苹曹俊刘银冰鄢秋龙刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／动物细菌病研究室，黑龙江哈尔滨 150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／动物细菌病研究室，黑龙江哈尔滨 150001 黑龙江八一农垦大学，黑龙江大庆 163319

本研究以结核分枝杆菌强毒株H37Rv基因组DNA为模板，扩增rv3036c基因，将此基因片段连接于表达载体pET-28a(+)，获得重组质粒pET-28a-ru3036c，并将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，经1 mmol／L IPTG诱导表达组氨酸标签融合蛋白R_v3... 详细信息

本研究以结核分枝杆菌强毒株H37Rv基因组DNA为模板，扩增rv3036c基因，将此基因片段连接于表达载体pET-28a(+)，获得重组质粒pET-28a-ru3036c，并将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，经1 mmol／L IPTG诱导表达组氨酸标签融合蛋白R_v3036c，用Ni-NTAHis口Bind Resin纯化目的蛋白，经westem-b10t验证了蛋白的纯化结果。Rv3036c蛋白纯化产物免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体。并通过间接EuSA方法检测抗体效价。结果显示，重组质粒双酶切鉴定和DNA序列测定均完全正确;sDS-PAGE和westem_blot分析结果显示，pET-28a-Rv3036c VT,可溶形式表达，蛋白分子量大小为28ku，且具有很好的免疫原性。以上结果为进一步研究rv3036c基因在结核分枝杆菌致病性中的作用奠定了很好的基础。

关键词：结核分枝杆菌原核表达多克隆抗体蛋白纯化

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HBK-SPF鸭MHCⅠ区域多态性分析

HBK-SPF鸭MHCⅠ区域多态性分析

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全国生物遗传多样性高峰论坛

作者：武永淑杨柳杨超李海超廉传江韩建林韩凌霞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物研究室兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业部畜禽遗传资源与利用重点开放实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物研究室兽医生物技术国家重点实验室东北农业大学中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业部畜禽遗传资源与利用重点开放实验室

禽主要组织相容性复合体是一组紧密连锁高度多态的基因群,与免疫反应或敏感性密切相关,鸭MHC I区域全长36.8kb,由TAP1、TAP2和5个MHC I拷贝基因(UAA-UEA)组成。HBK-SPF鸭是中国农业科学院哈尔滨兽医研究所培育的无特定病原体种鸭,包括B... 详细信息

禽主要组织相容性复合体是一组紧密连锁高度多态的基因群,与免疫反应或敏感性密切相关,鸭MHC I区域全长36.8kb,由TAP1、TAP2和5个MHC I拷贝基因(UAA-UEA)组成。HBK-SPF鸭是中国农业科学院哈尔滨兽医研究所培育的无特定病原体种鸭,包括B和Q 2个品系,已封闭繁育了7个世代。本文在鸭MHC I区域筛选了4个微卫星位点,通过单链构象多

关键词： HBK-SPF 单倍型 MHC 多态性分析

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适应无血清培养的HEK293细胞的建立

适应无血清培养的HEK293细胞的建立

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第九次学术研讨会

作者：孟其麟孙元李红梅王楠田大勇仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨 150001 延边大学农学院动物医学系，吉林延吉 130001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨 150001

本研究采用培养液渐进替换的方法获得了一株适应无血清培养的HEK293细胞(29SF)，经检测293SF细胞具有稳定的腺病毒增殖能力与外源蛋白表达能力;平均病变时间为97.00 h，比HEK293细胞缩短12.9％;毒价达到107.48TCIDmL，比HEK293细胞提高4... 详细信息

本研究采用培养液渐进替换的方法获得了一株适应无血清培养的HEK293细胞(29SF)，经检测293SF细胞具有稳定的腺病毒增殖能力与外源蛋白表达能力;平均病变时间为97.00 h，比HEK293细胞缩短12.9％;毒价达到107.48TCIDmL，比HEK293细胞提高43.3％;并且随着代数的提高稳定性良好，连续传16代后293sF细胞状态与易感性没有发生变化。此细胞系为腺病毒的无血清生产奠定材料基础。

关键词：腺病毒无血清培养蛋白表达稳定性

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HBK-SPF鸭MHC I区域微卫星标记分析

HBK-SPF鸭MHC I区域微卫星标记分析

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首届中国SPF禽类实验动物与兽用生物制品产业论坛

作者：武永淑韩建林韩凌霞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物研究室兽医生物技术国家重点实验室 150001 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业部畜禽遗传资源与利用重点开放实验室 100193 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业部畜禽遗传资源与利用重点开放实验室 100193 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物研究室兽医生物技术国家重点实验室 150001

禽主要组织相容性复合体是一组紧密连锁高度多态的基因群，与免疫反应或敏感性密切相关，鸭MHCⅠ区域全长36.8kb,由TAP1、TAP2和5个MHC（Ⅰ)拷贝基因（UAA-UEA)组成。HBK-SPF鸭是中国农业科学院哈尔滨兽医研究所培育的无特定病原体种鸭... 详细信息

禽主要组织相容性复合体是一组紧密连锁高度多态的基因群，与免疫反应或敏感性密切相关，鸭MHCⅠ区域全长36.8kb,由TAP1、TAP2和5个MHC（Ⅰ)拷贝基因（UAA-UEA)组成。HBK-SPF鸭是中国农业科学院哈尔滨兽医研究所培育的无特定病原体种鸭，包括B和Q2个品系，已封闭繁育了7个世代。本文在鸭MHCⅠ区域筛选了4个微卫星位点，通过单链构象多态性分析和聚合酶链式反应直接测序，发现A位点具有多态性，为（GT)n的重复结构，第6代HBK-B和HBK-Q的31个个体和第7代的140个个体进行聚合酶链式反应，结果直接测序，得到15种（GT)n基因型，未发现纯合基因型，重复结构之前的108bp中，发现了4种纯合单倍型和6种杂合单倍型;B位点未得到目的产物：C位点位于MHC（Ⅰ)拷贝基因UDA和UEA之间，扩增结果与UAA和UBA之间序列高度同源，无法判断基因型;D位点表现为单态，为（ATA)15的固定重复结构。本结果为进一步研究鸭MHC（Ⅰ)基因组序列提供了依据。

关键词：无特定病原体鸭主要组织相容性复合体微卫星标记

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5个新的鸭β-防御素的分离、鉴定及其抗病毒机制的初探

5个新的鸭β-防御素的分离、鉴定及其抗病毒机制的初探

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中国畜牧兽医学会动物营养学分会第十一次全国动物营养学术研讨会

作者：张可心蔺丽娟韩宗玺邵昱昊刘胜旺马得莹东北农业大学动物营养研究所中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室

本研究采用RT-PCR方法,分别从鸭肺脏和骨髓组织中扩增到5个新的β-防御素基因,将测序结果与已发现的禽β-防御素(AvBD)和部分哺乳类动物β-防御素的氨基酸序列构建进化树并进行同源性分析。结果显示,这5个基因分别是鸭AvBD1、鸭AvBD3、... 详细信息

本研究采用RT-PCR方法,分别从鸭肺脏和骨髓组织中扩增到5个新的β-防御素基因,将测序结果与已发现的禽β-防御素(AvBD)和部分哺乳类动物β-防御素的氨基酸序列构建进化树并进行同源性分析。结果显示,这5个基因分别是鸭AvBD1、鸭AvBD3、鸭AvBD5、鸭AvBD6和鸭AvBD16。其中,鸭AvBD1 cDNA大小为198 bp,编码65个氨基酸,与鸵鸟AvBD1氨基酸同源性最高为78%;鸭AvBD3 cDNA大小为182 bp,编码60个氨基酸残基,与鸡AvBD3氨基酸同源性高达100%;鸭AvBD5cDNA大小为201 bp,编码66个氨基酸残基,与鸡AvBD5氨基酸同源性达97%;鸭AvBD6 cDNA大小为204 bp,编码67个氨基酸残基,与鸡AvBD6氨基酸同源性高达100%;鸭AvBD16 cDNA大小为155bp,编码50个氨基酸,与鸡AvBD3同源性最高,为62%。将这5个鸭AvBD基因分别亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1,转化大肠杆菌BL21,进行IPTG诱导表达。将表达的蛋白进行纯化,同时根据其各自的氨其酸序列分别合成相应的5条多肽。以4种革兰氏阳性菌和8种革兰氏阴性菌为检测菌,采用菌落计数法测定重组和合成的鸭AvBD1、鸭AvBD3、鸭AvBD5、鸭AvBD6、鸭AvBD16和GST蛋白的抗菌活性,以及盐离子浓度对其抗菌活性的影响。并对这些蛋白的溶血活性进行测定。结果表明,与GST标签蛋白相比,重组和合成鸭AvBD1、鸭AvBD3、鸭AvBD5、鸭AvBD6和鸭AvBD16蛋白对12种细菌均有显著的抑制作用(P<0.05或P<0.01)。在高盐浓度下,这些蛋白对四联球菌和多杀性巴氏杆菌的抗菌活性显著降低(P<0.05或P<0.01)。此外,这些蛋白溶血活性极低,与阴性对照相比,无显著差异(P>0.05)。本试验还测定了这5个重组蛋白的体外抗鸭肝炎病毒作用,结果表明,与阳性对照(病毒组)相比,这些重组蛋白显著延长了鸭胚的存活时间(P<0.05或P<0.01),相反地,GST无显著作用(P>0.05),表明这些重组蛋白具有抗鸭肝炎病毒的作用。为探讨这些鸭AvBDs基因在体内组织中的表达水平是否受鸭肝炎病毒诱导,及其抗病毒作用的信号转导机制。本研究以鸭肝炎病毒感染鸭,采用荧光定量PCR方法,分别检测了攻毒后24h、32h、48h、72h、96h鸭体内法氏囊、脾脏、胸腺、盲肠扁桃体、骨髓、肝脏、肾脏和肺脏组织中这5个鸭AvBDs基因的表达量,以及几个细胞因子:鸭白介素-2(IL-2)、白介素-18(IL-18)和γ干扰素(IFN-γ),以及Tol1样受体7(TLR7)基因在除肾脏和肺脏外的上述组织中的表达量。结果显示,经鸭肝炎病毒诱导后,除鸭AvBD1、鸭AvBD3和IFN-γ在肝脏中没有被诱导表达外,其余基因在肝脏组织中均被诱导表达或表达量显著上调(P<0.05或P<0.01)。此外,在攻毒后的各个时间点,也检测到这些基因在其他组织中发生诱导表达或表达水平显著上调(P<0.05或P<0.01)。同时,本试验结果还显示,这些防御素和细胞因子在组织中的表达量与TLR7的表达量呈正相关。结果提示,这些鸭AvBDs与细胞因子在体内的抗病毒作用可能受TLR7介导的信号转导通路调控。

关键词：鸭β-防御素抗菌活性抗病毒活性诱导表达信号转导

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3个新的鹅β-防御素的分离、鉴定及其抗菌机制的初探

3个新的鹅β-防御素的分离、鉴定及其抗菌机制的初探

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中国畜牧兽医学会动物营养学分会第十一次全国动物营养学术研讨会

作者：张名岳张可心韩宗玺邵昱昊刘胜旺马得莹东北农业大学动物营养研究所中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室

本试验应用RT-PCR方法,从鹅的脾脏、骨髓和法氏囊等组织器官中扩增到3个新的鹅AvBDs基因。将其推导的氨基酸序列与其他β-防御素序列分析比较,结果显示这3个AvBDs基因分别为鹅β-防御素1（AvBD1）、鹅β-防御素3（AvBD3）和鹅β-防御素6... 详细信息

本试验应用RT-PCR方法,从鹅的脾脏、骨髓和法氏囊等组织器官中扩增到3个新的鹅AvBDs基因。将其推导的氨基酸序列与其他β-防御素序列分析比较,结果显示这3个AvBDs基因分别为鹅β-防御素1（AvBD1）、鹅β-防御素3（AvBD3）和鹅β-防御素6（AvBD6）。经核苷酸序列测定分析结果表明,鹅AvBD1cDNA由198个碱基组成,编码65个氨基酸残基;鹅AvBD3 cDNA由182个碱基组成,编码60个氨基酸;鹅AvBD6 cDNA由204个碱基组成,编码67个氨基酸残基。鹅AvBD3和鹅AvBD6与对应的鸡AvBD3和鸡AvBD6基因的同源性为100%,鹅AvBD1与鸵鸟AvBD1基因的同源性最高,为70.7%。将鹅AvBD1、3、6基因分别亚克隆到表达载pGEX-6p-1上,构建3个重组表达质粒pGEX-Goose-AvBD1、3、6将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG进行诱导表达,后进行蛋白纯化。SDS-PAGE电泳表明,3种重组蛋白分子量为31～32kDa,3个重组菌的表达产物均以包涵体的形式存在。同时,根据这3个多肽的成熟序列,分别合成3个合成多肽（sAvBD1、3、6）。选用4株革兰氏阳性菌（四联球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌）和8株革兰氏阴性菌（奇异变形杆菌、绿脓杆菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、兔波氏杆菌）做为检测菌,利用菌落计数法测定抗菌活性,结果显示标签蛋白GST对各种细菌没有抑制作用;重组和合成蛋白对所测的12株细菌均具有不同程度的抑菌活性。本试验还以多杀性巴氏杆菌（G）和金黄色葡萄球菌（G）作为试验菌,测定不同盐浓度对重组蛋白以及合成蛋白的影响,结果显示,随着盐浓度的增加,其抗菌活性明显减弱,而在高盐浓度条件下,该重组蛋白仍具有抗菌活性。另外,对该重组、合成鹅AvBD1、3、6蛋白进行了溶血活性的试验,发现鹅AvBDs溶血活性极低,与阴性对照相比,无显著差异（P>0.05）。为探讨这3个鹅AvBDs的抗感染机制,本试验采用肠炎沙门氏菌人工感染15日龄东北籽鹅,分别于感染后6h、24h、48h、72h采取鹅部分组织样品,主要是免疫组织和肠组织,并用荧光定量PCR方法检测这3个基因,部分炎性细胞因子,及其鹅Toll样受体（Toll-like receptor,TLR）4的表达量。结果表明,受感染后,这3个AvBD基因在不同组织中的表达量变化较大,其中AvBD1基因在骨髓中的表达量显著提高,AvBD3基因在骨髓、脾和大肠中的表达量显著提高,AvBD6基因在免疫组织中的表达量都显著提高。以上结果说明了鹅AvBDs具有可诱导性。同时发现,TLR4,以及鹅白细胞介素（IL）-2,IL-18,γ干扰素（IFN-γ）基因的表达量也相应提高。本研究结果初步表明,受肠炎沙门氏菌感染后,鹅机体可能通过TLR4激活细胞信号转导途径,提供刺激分子,诱导由T细胞分化产生的两种鹅细胞因子（IL-2和IL-18）以及鹅干扰素基因（IFN-γ）和3种鹅AvBDs基因的表达,激活天然免疫反应,协同建立机体获得性免疫防御,共同抵御肠炎沙门氏菌对鹅机体的攻击。

关键词：鹅β-防御素抗菌活性 Toll样受体诱导表达信号转导

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表达猪圆环病毒2型Rep/Rep'蛋白的重组杆状病毒的构建及其鉴定

表达猪圆环病毒2型Rep/Rep'蛋白的重组杆状病毒的构建及其鉴定

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次人兽共患病学术研讨会暨第六届第十四次教学专业委员会

作者：刘丹陆月华吴洪丽危艳武唐青海王一平李胜斌刘建波魏萍刘长明东北农业大学动物医学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

摘要猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1编码的Rep蛋白与病毒复制相关,其与转录中剪切所得的小Rep'蛋白是病毒复制所必须的。为了构建表达PCV2-Rep和Rep'蛋白的重组杆状病毒,采用PCR法从病毒感染细胞中扩增Rep和Rep'蛋白基因,并克隆... 详细信息

摘要猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1编码的Rep蛋白与病毒复制相关,其与转录中剪切所得的小Rep'蛋白是病毒复制所必须的。为了构建表达PCV2-Rep和Rep'蛋白的重组杆状病毒,采用PCR法从病毒感染细胞中扩增Rep和Rep'蛋白基因,并克隆到杆状病毒转移载体(pBlueBac4.5/V5-His-TOPO)。将重组质粒与线性化杆状病毒DNA共转染昆虫细胞(Sf-21),经同源重组和蚀斑筛选,获得2株高效表达PCV2-Rep和Rep'蛋白的重组杆状病毒。经3次克隆的重组毒株毒价达7.0×10～7和3.0×10～7pfu/mL。蛋白表达分析表明,PCV2-Rep和Rep'蛋白分子量为36.0 ku和20.4ku,占总蛋白含量的6.2%和10.1%;这两种重组蛋白均可与PCV2抗体产生特异性反应,具有良好的免疫活性。用Ni-NTA亲和层析法纯化重组蛋白,其纯度达到92.5%和93.6%。本研究获得的PCV2-Rep和Rep'蛋白,为PCV2疫苗免疫与野毒感染之间鉴别诊断及病毒复制机制的研究奠定了基础。

关键词：猪圆环病毒2型 Rep/Rep'蛋白杆状病毒表达

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非洲猪瘟快速检测方法的建立及主要免疫原基因P54的原核表达

非洲猪瘟快速检测方法的建立及主要免疫原基因P54的原核表达

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中国畜牧兽医学会信息技术分会2012年学术研讨会

作者：王晓玲蔺文成胡峰王朝刘朝霞周顺毕克东刘业兵崔尚金中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室青岛农业大学动物科技学院中国兽药监察所

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、发热性、高度接触传染性疾病。世界动物卫生组织将其列为A类动物疫病,我国也将其列为一类动物疫病。本研究通过对非洲猪瘟主要免疫原基因P54基因序列进行分析,查找出P54蛋白的跨膜区在34-53氨... 详细信息

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、发热性、高度接触传染性疾病。世界动物卫生组织将其列为A类动物疫病,我国也将其列为一类动物疫病。本研究通过对非洲猪瘟主要免疫原基因P54基因序列进行分析,查找出P54蛋白的跨膜区在34-53氨基酸残基之间。应用PCR技术,扩增出P54基因跨膜信号肽缺失片段,经克隆和测序后构建出重组表达质粒pET-P54q,与P54全长序列的原核表达质粒pET-28b-P54,转化Rostta表达菌。重组菌经IPTG诱导,SDS-PAGE结果表明,pET-28b-P54的表达量较少,而pET-P54q表达量较高。用钴柱亲和层析纯化,得到跨膜信号肽缺失的P54融合蛋白。P54是主要免疫原,可以用于血清学检测,鉴于我国目前不能引进病毒,因此P54蛋白也具备作为亚单位疫苗的可能性。同时基于非洲猪瘟病毒(ASFV)P54基因,建立了纳米PCR检测方法,该方法特异性强,敏感性高,检测下限均达10～1copies/μL,是常规PCR检测技术敏感性的1000倍。对黑龙江、吉林和河南三个省份的8个地区临床送检的69份样品进行检测,检测结果显示均为阴性。

关键词：非洲猪瘟病毒 p54 纳米PCR 原核表达

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猪细小病毒非结构蛋白NS2和NS3基因的克隆与原核表达

猪细小病毒非结构蛋白NS2和NS3基因的克隆与原核表达

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第九次学术研讨会

作者：王晓玲蔺文成胡峰王朝刘朝霞周顺毕克东崔尚金中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨 150001 青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨 150001 青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109

通过重叠延伸PCR(SOE-PcR)方法扩增猪细小病毒BQ-C株的NS2、NS3基因，并将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)上，分别构建出重组表达质粒pEToNS2、pET-NS3。用不同浓度的IPTG进行诱导表达，***分析表明pET-NS2重组蛋白在IPTG浓度为1．2 m... 详细信息

通过重叠延伸PCR(SOE-PcR)方法扩增猪细小病毒BQ-C株的NS2、NS3基因，并将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)上，分别构建出重组表达质粒pEToNS2、pET-NS3。用不同浓度的IPTG进行诱导表达，***分析表明pET-NS2重组蛋白在IPTG浓度为1．2 mM、温度为37℃、诱导4 h时表达量最大，分子量为25 ku;pET-NS3重组蛋白在IPTG浓度为1 mM、温度为37℃、诱导4h时表达量最大，融合蛋白的分子质量为19．4ku。对表达的可溶性蛋白，用钴柱亲和层析纯化得到了NS2、NS3的重组蛋白，western blot鉴定表明，重组蛋白具有反应原性。本研究为猪细小病毒的自然免疫、发病机制、病毒复制、免疫机理等研究工作奠定了基础，未见以前有所报道。

关键词：猪细小病毒非结构蛋白基因克隆原核表达

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