检索结果-内蒙古大学图书馆

中国预防兽医学报 2008年第12期30卷 915-919页

作者：王海伟涂亚斌周国辉杨德成张亚科于力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室黑龙江哈尔滨150001

为构建Asia1型口蹄疫病毒Asia1/YS/CHA/05株的感染性克隆,根据该毒株的全基因组序列,将其分为6段进行RT-PCR扩增,并拼接克隆至pBluescript II SK(+)载体中,构建了全长基因组的cDNA克隆pAsi。用NotⅠ将质粒线性化后体外转录并转染BHK-21... 详细信息

为构建Asia1型口蹄疫病毒Asia1/YS/CHA/05株的感染性克隆,根据该毒株的全基因组序列,将其分为6段进行RT-PCR扩增,并拼接克隆至pBluescript II SK(+)载体中,构建了全长基因组的cDNA克隆pAsi。用NotⅠ将质粒线性化后体外转录并转染BHK-21细胞,转染细胞中出现明显的细胞病变。RT-PCR结合序列分析表明,拯救病毒中作为人工设计的分子标记PstⅠ酶切位点被消除,因此,排除了亲本病毒污染的可能。该感染性克隆的构建,为深入探讨Asia1型口蹄疫病毒的致病机理以及新型疫苗的研制奠定了基础。

关键词： Asial型口蹄疫病毒全长cDNA 体外转录和转染病毒拯救

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牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的截短表达与鉴定

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中国预防兽医学报 2008年第3期30卷 200-205页

作者：李娇薛飞朱远茂祖立闯中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

利用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)BA株接种MDBK细胞,提取病毒RNA。参照已发表的BVDV基因组序列,利用Oligo 6生物学软件设计扩增E2基因的1对引物,引入酶切位点并去掉E2蛋白的跨膜区及疏水区。通过RT-PCR扩增了长约1 000 bp的E2基因片段,克隆到... 详细信息

利用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)BA株接种MDBK细胞,提取病毒RNA。参照已发表的BVDV基因组序列,利用Oligo 6生物学软件设计扩增E2基因的1对引物,引入酶切位点并去掉E2蛋白的跨膜区及疏水区。通过RT-PCR扩增了长约1 000 bp的E2基因片段,克隆到pMD18-T载体上,酶切并测序鉴定。然后将目的片段进一步定向克隆到pET30a表达载体,转化BL21表达菌。取转化菌培养,并用IPTG诱导,获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。将重组蛋白变性、纯化和复性后,用免疫印迹与间接ELISA检测表明纯化的重组蛋白具有良好的免疫原性,为牛病毒性腹泻病毒诊断试剂的研制奠定了基础。

关键词：牛病毒性腹泻病毒 E2蛋白截短表达鉴定

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逆转录病毒基因组RNA的二聚作用

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病毒学报 2008年第6期24卷 487-491页

作者：高旭沈荣显相文华周建华中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室大动物传染病研究室哈尔滨150001 延边大学农学院动物医学系延吉133400

逆转录病毒科(Retroviridae)是一成员众多、易变异的RNA病毒科。在逆转录病毒复制周期内,所有逆转录病毒均将两拷贝的单股正链RNA带人病毒粒子。在此过程中,遗传物质——基因组RNA能顺利包装入病毒粒子是病毒复制与繁衍的关键,而基因组... 详细信息

逆转录病毒科(Retroviridae)是一成员众多、易变异的RNA病毒科。在逆转录病毒复制周期内,所有逆转录病毒均将两拷贝的单股正链RNA带人病毒粒子。在此过程中,遗传物质——基因组RNA能顺利包装入病毒粒子是病毒复制与繁衍的关键,而基因组RNA通过二聚作用(Dimerization)形成二聚体(Dimer)是包装逆转录病毒的前提。[第一段]

关键词：逆转录病毒科 RNA病毒病毒基因组二聚作用病毒复制病毒粒子遗传物质二聚体

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丝状支原体丝状亚种SC型LppC基因的表达纯化

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中国预防兽医学报 2008年第2期30卷 90-93页

作者：李媛乔祖健王亮张建华辛九庆中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

丝状支原体丝状亚种SC型是A类烈性传染病牛传染性胸膜肺炎的病原体。脂蛋白LppC是重要的免疫优势抗原,LppC基因是MmmSC的特异性基因。本研究通过PCR方法,扩增MmmSC标准株PG1的LppCN末端基因。将该序列克隆到pMDT-18载体上并测序,用pET32... 详细信息

丝状支原体丝状亚种SC型是A类烈性传染病牛传染性胸膜肺炎的病原体。脂蛋白LppC是重要的免疫优势抗原,LppC基因是MmmSC的特异性基因。本研究通过PCR方法,扩增MmmSC标准株PG1的LppCN末端基因。将该序列克隆到pMDT-18载体上并测序,用pET32a为载体构建重组质粒进行诱导表达。LppCN末端基因长度为644bp,将其与NCBI上发布的Afade株、欧洲群代表株L2比较,它的核酸序列同源性为100%,表明LppC基因在种内高度保守。原核表达结果得到大小为45ku的目的蛋白,用Ni-NTA系统进行纯化得到高纯度的蛋白,Westernblot结果表明,重组蛋白能与牛传染性胸膜肺炎阳性血清反应,具有免疫学活性,为进一步与LppQ融合表达奠定基础。

关键词：牛传染性胸膜肺炎(CBPP) 丝状支原体丝状亚种SC(MmmSC) LppC

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胸膜肺炎放线杆菌体内表达基因的筛选

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中国兽医科学 2008年第10期38卷 847-850页

作者：刘慧芳刘思国王春来司微王聃杜艳芬赵海玲赫明雷中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

利用体内诱导抗原技术对胸膜肺炎放线杆菌（APP）体内表达的基因进行了初步筛选。将收集到的5份感染了APP1型的猪血清混合．分别用体外培养的APP1和大肠杆菌BL21（DE3）的全菌及全菌裂解物进行吸附。用ELISA方法检测吸附效果，经吸附后... 详细信息

利用体内诱导抗原技术对胸膜肺炎放线杆菌（APP）体内表达的基因进行了初步筛选。将收集到的5份感染了APP1型的猪血清混合．分别用体外培养的APP1和大肠杆菌BL21（DE3）的全菌及全菌裂解物进行吸附。用ELISA方法检测吸附效果，经吸附后血清D150nm分别由原来的0．927和0．239降低为0．196和0．078。同时,将APP1基因组DNA以Bsp143I进行酶切，回收500～2000bp的片段，与pET30a／b／c载体连接，构建了APP1基因组质粒表达文库，库容量（CFU）为2．0×10^5。用吸附后的血清通过菌落原位免疫杂交筛选该基因组表达文库，从3000个菌落中获得了12个阳性克隆。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌体内诱导抗原技术菌落原位免疫杂交

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猪肺炎支原体中国分离株热休克蛋白Hsp70(Dnak)的全基因克隆及C末端基因的表达与免疫活性分析

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中国预防兽医学报 2008年第3期30卷 169-173页

作者：李媛张建华王亮乔祖建辛九庆中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,MHP)是猪气喘病的病原。DnaK又称为热休克蛋白Hsp70,具有分子伴侣和免疫的作用。以MHP中国分离株Yin-1为模板,扩增了DnaK基因的全序列,将该序列克隆到pMD18-T载体上并测序。测序结果Yin-1株DnaK... 详细信息

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,MHP)是猪气喘病的病原。DnaK又称为热休克蛋白Hsp70,具有分子伴侣和免疫的作用。以MHP中国分离株Yin-1为模板,扩增了DnaK基因的全序列,将该序列克隆到pMD18-T载体上并测序。测序结果Yin-1株DnaK基因即Hsp70基因全长1 803 bp,编码600 aa,第631～633位TGA在支原体编码色氨酸而不是作为终止密码子。将该序列与多种致病支原体DnaK基因进行分析比较,发现Yin-1株与232株、J株、7 448株等MHP菌株的DNA同源性为99.3%～99.4%,氨基酸同源性为99.2%～99.3%,而与非同种支原体的DNA和氨基酸同源性仅为64.5%～74.4%和59.3%～77%。这表明DnaK基因在种内高度保守,种间差异较大。以pET28a为载体构建重组质粒,原核表达DnaK C末端大小为1 kb左右的基因,对表达的蛋白进行纯化后,通过Western blot检测它的免疫活性。原核表达得到大小为41 ku的目的蛋白,经Western blot证实,纯化蛋白可与MHP阳性猪血清反应,具有免疫活性。

关键词：猪肺炎支原体猪喘气病伴侣蛋白DnaK 热休克蛋白70

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猪传染性胸膜肺炎放线杆菌基因组表达文库的构建及对小鼠的免疫保护作用研究

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中国预防兽医学报 2008年第2期30卷 153-156页

作者：刘慧芳周媛媛刘思国宫强王勇刘建东王春来常月红迟磊赵昆云孟克中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

本研究应用限制性内切酶MboⅠ消化胸膜肺炎放线杆菌血清7型的基因组DNA,回收500bp～3000bp的片段,插入到真核表达载体pCDNA3.1(+)的BamHⅠ酶切位点构建重组质粒,电转化大肠杆菌TG1,获得胸膜肺炎放线杆菌的基因组表达文库(大约含有106个... 详细信息

本研究应用限制性内切酶MboⅠ消化胸膜肺炎放线杆菌血清7型的基因组DNA,回收500bp～3000bp的片段,插入到真核表达载体pCDNA3.1(+)的BamHⅠ酶切位点构建重组质粒,电转化大肠杆菌TG1,获得胸膜肺炎放线杆菌的基因组表达文库(大约含有106个克隆)。将该文库随机分为10个亚文库(10个Clone pool),分别提取每个亚文库的重组质粒免疫小鼠(n=130只),免疫剂量为100μg,免疫3次后以1型胸膜肺炎放线杆菌进行攻毒,通过相对保护率、肺组织荷菌数、病理组织学3个指标测定其对小鼠的免疫保护作用。试验结果表明,Clone pool3、Clone pool2、Clone pool6和Clone pool7的免疫效果明显优于其他免疫组,尤其是Clone pool3的免疫保护效果最佳。本研究成功构建了7型胸膜肺炎放线杆菌的基因组表达文库,从而为筛选和获得新的保护性抗原基因奠定基础。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌基因组表达文库构建保护作用

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基因修饰对鸡新城疫病毒F48E9株HN基因DNA疫苗表达效力的影响

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生物工程学报 2008年第2期24卷 226-231页

作者：贺笋石星明王云峰王玫冉多良童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨150001 新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830052

DNA疫苗的免疫效果与抗原基因的表达量和免疫原性有直接关系,为了提高目的基因的表达量,本研究对NDV F_(48)E_9株的HN基因进行了修饰,对修饰前后HN基因表达水平进行了比较。利用分子生物学软件将NDV F_(48)E_9株的HN基因的密码子全部替... 详细信息

DNA疫苗的免疫效果与抗原基因的表达量和免疫原性有直接关系,为了提高目的基因的表达量,本研究对NDV F_(48)E_9株的HN基因进行了修饰,对修饰前后HN基因表达水平进行了比较。利用分子生物学软件将NDV F_(48)E_9株的HN基因的密码子全部替换为鸡体内偏嗜性密码子,同时在HN基因的5′端加上同样已替换密码子的禽流感病毒HA蛋白信号肽序列以期望提高目的蛋白在细胞中的表达。修饰后HN基因命名为SoptiHN,剔除信号肽的HN基因命名为optiHN。将SoptiHN、optiHN和F_(48)E_9株的HN基因分别克隆到真核表达载体pVAX1和含有多个鸡体内最适免疫刺激序列CpG-ODN的载体pVAX1-CpG中,将他们分别命名为pV-SoptiHN、pVC-SoptiHN、pV-optiHN、pVC-optiHN和pV-HN、pVC-HN,用这些质粒转染293T细胞,48小时后间接免疫荧光和Western blotting检测细胞中瞬时表达的HN蛋白。结果显示,与未经修饰的HN基因相比,修饰后的HN基因体外瞬时表达水平明显提高,并且密码子优化与添加信号肽序列这两种途径都可以提高HN基因的体外表达量.

关键词： NDV,DNA疫苗密码子优化信号肽间接免疫荧光免疫印迹

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共表达PRRSVGP5蛋白和CSFV E2蛋白的“自杀性”DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答

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生物工程学报 2008年第10期24卷 1714-1722页

作者：孙建富赵和平李娜孙元夏照和周艳君王煜祁巧芬鲁承仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室哈尔滨150001 延边大学农学院动物医学系龙井133400

为了获得新型双价"自杀性"DNA疫苗,将猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5基因克隆于此前构建的表达猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2基因的甲病毒复制子载... 详细信息

为了获得新型双价"自杀性"DNA疫苗,将猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5基因克隆于此前构建的表达猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2基因的甲病毒复制子载体疫苗pSFV1CS-E2中。为了增强免疫效果,在密码子优化的GP5基因中插入了泛DR表位(PADRE),在CSFV E2基因后融合伪狂犬病病毒(PrV)UL49基因,获得了6种重组质粒。间接免疫荧光试验显示,PRRSV GP5和CSFV E2基因在瞬时转染的293T细胞中得到同时表达。将6种重组质粒和空载体pSFV1CS分别免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA方法检测血清抗体水平,通过基于CSFE/WST-8的淋巴细胞增殖试验和细胞因子ELISA评价疫苗诱导的细胞免疫。结果显示,除pSFV1CS组外,从各疫苗组小鼠血清中均可检测到低水平的针对GP5和E2蛋白的抗体;各疫苗组小鼠脾细胞经CSFV和PRRSV刺激后均能诱导特异性的淋巴细胞增殖;部分疫苗组小鼠脾细胞经CSFV和PRRSV刺激后可分泌较高水平的IFN-γ和IL-4;引入UL49的疫苗组细胞免疫应答显著高于其它疫苗组。结果表明,这些共表达GP5和E2蛋白的自杀性DNA疫苗可以诱导体液免疫和细胞免疫,PrV UL49可以增强其细胞免疫应答。

关键词： “自杀性”DNA疫苗猪繁殖与呼吸综合征病毒猪瘟病毒泛DR表位 VP22转导蛋白共表达

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抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及其生物*学特性鉴定

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2008年第11期36卷 35-39,46页

作者：赵磊魏建忠周国辉于永忠李万于力安徽农业大学动物科技学院安徽合肥230036 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室大动物病研究室黑龙江哈尔滨150001

【目的】针对O型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth Disease Virus,FMDV)制备特异性的单克隆抗体,为进一步研制O型口蹄疫诊断方法提供物质基础。【方法】用纯化的O型口蹄疫病毒免疫Balb/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,结合间接ELIS... 详细信息

【目的】针对O型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth Disease Virus,FMDV)制备特异性的单克隆抗体,为进一步研制O型口蹄疫诊断方法提供物质基础。【方法】用纯化的O型口蹄疫病毒免疫Balb/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,结合间接ELISA和间接免疫荧光(IFA)筛选,有限稀释法克隆,建立稳定的阳性杂交瘤细胞株,并对制备的单克隆抗体进行生物学特性鉴定。【结果】获得了2株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2B9和5F7,抗体亚类鉴定其均为IgG1/κ类型;IFA结果显示,2株单克隆抗体仅与O型FMDV反应,不与Asia1型FMDV反应,推测其均为抗O型FMDV的型特异性单克隆抗体;Western blot结果显示,2株单克隆抗体均无特异性条带出现,表明其所针对的抗原表位均为构象型表位;相加ELISA试验表明,2B9与5F7两株单克隆抗体识别的抗原表位相近或相同;经硫氰酸盐洗脱法测定,2B9和5F7的相对亲和力指数均为1.5 mol/L;中和试验显示,2株单克隆抗体都不具有中和活性。【结论】2株单克隆抗体的获得及其生物学性质的鉴定,为O型口蹄疫诊断方法的建立提供了基础材料。

关键词： O型口蹄疫病毒单克隆抗体生物学特性鉴定

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