检索结果-内蒙古大学图书馆

两株H1N1亚型猪流感病毒HA蛋白中和性单克隆抗体的制备及抗病毒活性研究

畜牧兽医学报 2018年第7期49卷 1460-1466页

作者：梁文花贾云慧许程志吴运谱陈艳杨焕良乔传玲陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室哈尔滨150069

为了制备抗欧亚类禽型(Eurasian avian-like,EA)H1N1猪流感病毒(SIV)血凝素(HA)蛋白的单克隆抗体(MAb)并对其生物学活性进行检测,利用SIV A/swine/Henan/11/2005(HN11)增殖、纯化的全病毒蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾... 详细信息

为了制备抗欧亚类禽型(Eurasian avian-like,EA)H1N1猪流感病毒(SIV)血凝素(HA)蛋白的单克隆抗体(MAb)并对其生物学活性进行检测,利用SIV A/swine/Henan/11/2005(HN11)增殖、纯化的全病毒蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,采用间接ELISA和HI检测方法进行筛选。结果获得了两株能稳定分泌抗HA蛋白MAb的杂交瘤细胞株,分别命名为2B6和4C7;两株MAbs的腹水ELISA和HI效价均分别高于1∶107和5log2;两株MAbs能够在IFA试验中与病毒HA蛋白发生反应,而在Western blot试验中不能检测到病毒HA蛋白;病毒中和试验结果显示这两株MAbs对EA H1N1SIV具有病毒中和活性;MAbs的抗病毒活性又进一步通过小鼠的感染试验进行了评估,结果表明接种了MAbs的小鼠获得了有效抵抗同源及异源H1N1SIV感染的保护效果。研究证实制备的两株MAbs具有较高的病毒中和活性和较强的抗病毒感染能力,可以将其进一步应用于抗EA H1N1SIV的感染及开展病毒抗原性变异的分子基础研究。

关键词：猪流感病毒 HA蛋白单克隆抗体中和活性

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抗猪甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备与特性分析

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畜牧兽医学报 2011年第5期42卷 711-716页

作者：张健陈艳乔传玲杨焕良唐续辛晓光陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室哈尔滨150001

本研究旨在制备猪甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)蛋白的特异性单克隆抗体。采用RT-PCR方法扩增猪甲型H1N1流感病毒的HA基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGS上,获得重组质粒pCAGGS-HA,转染293T细胞,通过间接免疫荧光(IFA)检测表明HA蛋白在293... 详细信息

本研究旨在制备猪甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)蛋白的特异性单克隆抗体。采用RT-PCR方法扩增猪甲型H1N1流感病毒的HA基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGS上,获得重组质粒pCAGGS-HA,转染293T细胞,通过间接免疫荧光(IFA)检测表明HA蛋白在293T细胞中得到表达。将pCAGGS-HA以100μg.只-1剂量免疫5周龄BALB/c小鼠,获得4株稳定分泌抗HA蛋白单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株,分别命名为11G7、3C10、3G3和2B11。其中11G7诱导小鼠产生的腹水HI效价为14log2,中和效价为1∶8 192,HI试验结果进一步表明11G7只与甲型H1N1流感病毒发生反应,而不与其他H1N1、H1N2、H3N2、H5N1及H9N2亚型流感病毒反应。该MAb的制备将为建立猪甲型H1N1流感病毒与传统亚型SIV的鉴别诊断方法奠定基础。

关键词：甲型H1N1猪流感病毒 HA MAb

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表达H5亚型禽流感病毒HA基因的DNA疫苗免疫保护效力研究

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中国农业科学 2004年第7期37卷 1071-1075页

作者：姜永萍于康震邓国华田国斌乔传玲陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

表达高致病力禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1) [GD/1/96(H5N1)]HA基因的DNA疫苗质粒pCIHA5具有良好的免疫保护性,为了将其开发并应用于实际,对其免疫保护效力进行了进一步的研究。结果表明,用10、40、70、100和150g pCIHA... 详细信息

表达高致病力禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1) [GD/1/96(H5N1)]HA基因的DNA疫苗质粒pCIHA5具有良好的免疫保护性,为了将其开发并应用于实际,对其免疫保护效力进行了进一步的研究。结果表明,用10、40、70、100和150g pCIHA5和油苗1次免疫后,其免疫保护率分别为12.5%(1/8)、58.3%(7/12)、72.7%(8/11)、50.0%(6/12)、66.7%(8/12)和100%(12/12),其中70和100g剂量组的病毒分离结果为1/8和2/6;用剂量为5、20、35和50g pCIHA5分别免疫2次,免疫保护率分别为45.5%(5/11)、58.3%(7/12)、58.3%(7/12)和91.7%(11/12),5g的病毒分离结果为1/5,其余组未分离出病毒;pCIHA5免疫后AGP抗体均未检出,油苗免疫后其HI抗体虽高,但AGP抗体也呈阳性。结果显示,加强免疫应为DNA疫苗质粒pCIHA5的安全免疫方式,DNA疫苗质粒pCIHA5虽具有较为稳定的免疫原性和免疫保护性,但有必要进一步提高其在肌肉组织中的有效表达水平和抗体反应水平。

关键词：禽流感病毒血凝素基因 DNA疫苗免疫保护效力

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在DNA芯片平台上探测AIV不同亚型cDNA

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中国农业科学 2005年第2期38卷 394-398页

作者：王秀荣邓国华于康震石锐刘丽玲乔传玲陈化兰孔宪刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

对以基因芯片技术为基础的检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒的快速诊断技术进行了研究。试验中所使用的病毒为A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)、A/African　starling/983/79(H7N1)和　A/Turkey/Wisconsin/1/66(H9N2)。通过RT-PCR获得大约500　bp的禽流感病毒基因cDNAs片段,克隆,从重组质粒扩增DNA片段,并点到玻璃载体上,制成芯片。在病毒RNA反转录过程中,用Cy5标记样品　cDNAs。样品　cDNAs是一个包括禽流感病毒HA和M基因的混合物。依据M基因鉴别型,依据HA基因鉴别亚型。扫描芯片上探针结合位点,杂交信号与预期设想基本一致。结果显示,DNA芯片技术可以提供一种有效的AIV诊断方法。

关键词：禽流感病毒基因芯片亚型鉴定

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猪源H9N2亚型流感病毒HA基因的序列测定及真核表达

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中国预防兽医学报 2007年第12期29卷 916-919页

作者：韩庆功乔传玲杨焕良陈艳辛晓光丁选亚陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室

利用RT-PCR扩增猪流感病毒A/Swine/Zhejiang/7/2004(H9N2)(SW/ZhJ7/04)HA基因,测序后将其克隆到真核表达载体pCAGGS上,经酶切分析、PCR鉴定和测序验证,得到重组表达质粒pCAGGS-HA,之后将其转染293T细胞,48h后收集转染细胞样品,进行SDS-PAGE分析,结果显示HA蛋白获得了表达。经Western blot检测,结果表明pCAGGS-HA能够在体外瞬时表达具有免疫学活性的HA蛋白,通过免疫小鼠,对其免疫效果进行了初步研究。

关键词：猪流感病毒 HA基因序列测定真核表达

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表达载体pCAGGS显著增强禽流感DNA疫苗的免疫保护效果

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中国农业科学 2006年第4期39卷 825-830页

作者：姜永萍张洪波步志高李呈军赵有淑王秀荣于康震陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部畜牧兽医总站

目的将A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的HA基因插入鸡β-actin启动子高效真核表达载体pCAGGS,构建了DNA疫苗质粒pCAGGHA5,以提高H5亚型禽流感DNA疫苗的表达水平和免疫保护效果。方法将pCAGGHA5和表达GD/1/96(H5N1)HA基因的质粒pCIHA5通过间接免疫荧光法和Western-blot分析检测转染293T细胞后瞬时表达的HA抗原蛋白,随之将pCAGGHA5及pCIHA5分别以100μg和10μg剂量一次免疫3周龄SPF鸡,4周后用100LD50的HPAIVGD/1/96(H5N1)鼻腔途径进行攻击。结果间接免疫荧光法和Western-blot分析表明2种表达质粒均可正确表达H5亚型HA抗原蛋白,载体pCAGGS表达水平显著高于载体pCI;免疫SPF鸡后,100μgpCAGGHA5可形成5/5的免疫保护,100μgpCIHA5可形成2/4的免疫保护,10μgpCAGGHA5可形成对免疫鸡5/5的免疫保护,而10μgpCIHA5则基本不能形成免疫保护,pCAGGHA5诱导的HI抗体水平远远高于pCIHA5。结论鸡β-actin启动子表达载体pCAGGS可显著提高HA基因体外表达水平和H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平,增强免疫保护效果。

关键词：禽流感 H5亚型鸡β-actin启动子 DNA疫苗免疫保护

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H5N1亚型禽流感病毒HA基因在昆虫细胞中的表达及其生物活性鉴定

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中国生物工程杂志 2007年第3期27卷 42-46页

作者：张晓霁刘明刘春国杨涛张云中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

经RT-PCR扩增了H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因(HA)片段,限制性内切酶酶切后将其克隆到pFastBacHTA杆状病毒转座载体,经酶切鉴定及测序,筛选出阳性重组转座载体pFastBac-H5。将pFastBacH5转化含有杆状病毒穿梭载体(bacmid)的DH10Bac感受... 详细信息

经RT-PCR扩增了H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因(HA)片段,限制性内切酶酶切后将其克隆到pFastBacHTA杆状病毒转座载体,经酶切鉴定及测序,筛选出阳性重组转座载体pFastBac-H5。将pFastBacH5转化含有杆状病毒穿梭载体(bacmid)的DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选和PCR鉴定获得重组杆状病毒穿梭载体rBacmid-H5。rBacmid-H5在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,SDS-PAGE蛋白电泳、Western blot、血凝试验和血凝抑制试验分析表明:分子量约63kDa重组血凝素蛋白(rH5)在sf9昆虫细胞中实现了高效表达。rH5具有血凝活性,而且其血凝活性能够被H5N1禽流感病毒高免血清所抑制;rH5免疫鸡诱导产生针对H5N1禽流感病毒亚型特异的血凝抑制抗体,说明表达的重组蛋白具有与天然蛋白相似的生物活性。

关键词：禽流感病毒血凝素基因杆状病毒表达

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H3N2亚型猪流感病毒重组HA1蛋白间接ELISA诊断方法的建立

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畜牧兽医学报 2008年第9期39卷 1230-1234页

作者：丁选亚乔传玲陈艳杨焕良辛晓光韩庆功陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室哈尔滨150001

以pMD18-HA质粒为模板,PCR扩增HA1基因片段并与pET30a连接后,转化宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达HA1蛋白,对表达蛋白进行SDS-PAGE及Western blotting检测。结果表明,表达的重组HA1蛋白具有良好的反应原性,分子量约为45 ku。表达产物经过... 详细信息

以pMD18-HA质粒为模板,PCR扩增HA1基因片段并与pET30a连接后,转化宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达HA1蛋白,对表达蛋白进行SDS-PAGE及Western blotting检测。结果表明,表达的重组HA1蛋白具有良好的反应原性,分子量约为45 ku。表达产物经过纯化作为包被抗原建立了检测H3亚型猪流感抗体的间接ELISA方法。该方法具有较高的特异性和敏感性,重复性良好,通过检测40份血清,与HI检测结果相比较,其符合率达86.5%。该方法为检测H3亚型猪流感抗体提供了一种快速、准确、简便的技术手段。

关键词：猪流感病毒 HA1蛋白间接ELISA

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H9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法的建立

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中国兽医科学 2010年第4期40卷 384-389页

作者：包红梅王秀荣陶启蒙蔡东东王馥梅赵玉辉陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

通过分析流感数据库中123个HA序列,根据HA保守区序列设计并合成了1对引物,建立了一步法RT-PCR检测方法,预期扩增片段大小为732 bp。通过对H9亚型禽流感病毒（AIV）不同稀释度的尿囊液和棉拭子浸出液进行检测,证实病毒尿囊液的最低检出量... 详细信息

通过分析流感数据库中123个HA序列,根据HA保守区序列设计并合成了1对引物,建立了一步法RT-PCR检测方法,预期扩增片段大小为732 bp。通过对H9亚型禽流感病毒（AIV）不同稀释度的尿囊液和棉拭子浸出液进行检测,证实病毒尿囊液的最低检出量为1×10^4.7EID50/mL;阳性棉拭子的最低检出量为1×10^2.5EID50/mL。用该方法检测H1-H15亚型AIV和鸡新城疫病毒等其他14种禽病病原,结果仅有H9亚型AIV出现特异性目的条带,而其他均未出现目的条带。脏器及咽喉、泄殖腔棉拭子样品在1∶10稀释度下,病毒分离和RT-PCR方法可以达到相同的阳性检出率。表明建立的AIV H9亚型RT-PCR方法具有较好的特异性和敏感性。

关键词：禽流感病毒一步法RT-PCR H9亚型

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H1N1亚型猪流感病毒广东分离株全基因克隆及其遗传演化分析

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病毒学报 2008年第5期24卷 358-363页

作者：刘大飞刘明刘春国杨涛刘大程中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 莱阳市城厢兽医站山东莱阳265200

为了研究H1N1亚型SIV遗传演化与变异的特性,采用RT-PCR技术分别扩增A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)的8个基因片段,分别将其克隆到pMD18-T载体,进行全基因组序列测定。核苷酸序列测定结果显示:LM株SIV各基因片段均未发现核苷酸插入或... 详细信息

为了研究H1N1亚型SIV遗传演化与变异的特性,采用RT-PCR技术分别扩增A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)的8个基因片段,分别将其克隆到pMD18-T载体,进行全基因组序列测定。核苷酸序列测定结果显示:LM株SIV各基因片段均未发现核苷酸插入或缺失现象。HA切割位点处的氨基酸序列序列为IPSIQSR↓G,与高致病性SIV的H1N1亚型毒株的分子特征不符合。HA基因含有6个潜在的N-糖基化位点,4个在HA1的第11、23、87、和276位,增加2个分别在HA2的154和213位点;NA基因不仅在58、63、68、88和146位含有高度保守的N-糖基化位点,而且在44和235位增加2个潜在的N-糖基化位点,这可能是近期H1N1亚型SIV的一个分子特征。核苷酸同源性结果:HA基因与类人谱系的流感病毒分离株有很高的同源性(99%),而其他基因均与古典猪谱系的流感病毒分离株同源性较高(87%～98%)。从绘制的各个片段进化树和核苷酸同源性分析结果,可以推测该毒株HA基因可能来源于类人谱系的流感病毒;而其他基因来源于古典猪谱系的流感病毒。

关键词：猪流感病毒 RT-PCR 克隆遗传演化分析

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