检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：陈艳乔传玲丁选亚杨焕良辛晓光韩庆功陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室

利用RT-PCR方法扩增猪流感病毒A/Swine/Henan/11/2005(H1N1)HA基因,克隆于PMD18-T载体进行测序。以PMD18-HA为模板、利用带酶切位点的引物再次扩增HA基因的开放阅读框(ORF),克隆到表达载体pET32a中,经双酶切、测序及PCR鉴定得到阳性重... 详细信息

利用RT-PCR方法扩增猪流感病毒A/Swine/Henan/11/2005(H1N1)HA基因,克隆于PMD18-T载体进行测序。以PMD18-HA为模板、利用带酶切位点的引物再次扩增HA基因的开放阅读框(ORF),克隆到表达载体pET32a中,经双酶切、测序及PCR鉴定得到阳性重组表达质粒pET-HA,将质粒转化到表达宿主菌BL21(DE3)中,经终浓度为1mM的IPTG诱导,SDS-PAGE结果显示,HA蛋白获得了高效表达,经Westernblot检测证实表达产物具有良好的免疫学活性,经间接ELISA预试验表明具有良好的抗原反应性。本研究为以重组HA蛋白为抗原建立H1亚型猪流感抗体的ELISA检测方法奠定了基础。

关键词：猪流感病毒 HA基因原核表达

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以GPT和GFP为双重筛选标记的禽痘病毒通用转移载体的构建及鉴定

以GPT和GFP为双重筛选标记的禽痘病毒通用转移载体的构建及鉴定

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：王艳丽李俊辉姜永萍夏俊裴磊冉多良陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室新疆农业大学动物医学院

禽痘病毒作为活载体已经得到广泛的应用,转移栽体的构建是重组禽痘病毒构建的重要环节。本研究构建了禽痘病毒通用转移载体pSY681-gfp-gpt,该载体含有gfp和gpt两个报告基因及背对的痘苗病毒晚期启动子P11和早期启动子P7.5,P11启动gfp和... 详细信息

禽痘病毒作为活载体已经得到广泛的应用,转移栽体的构建是重组禽痘病毒构建的重要环节。本研究构建了禽痘病毒通用转移载体pSY681-gfp-gpt,该载体含有gfp和gpt两个报告基因及背对的痘苗病毒晚期启动子P11和早期启动子P7.5,P11启动gfp和gpt两个基因,P7.5用于启动外源基因,在早期启动子P7.5下游引入NotⅠ和AflⅡ两个酶切位点,用于外源基因的插入。为检测禽痘病毒通用转移载体pSY681-gfp-gpt的效果,将H9亚型禽流感病毒A/Chicken/Shanghai/10/01(H9N2)的HA基因插入到此载体构建了转移载体pSY681-gfp-gpt-HA,应用TransIT-LT1 Transfection Reagent将此转移载体转染已感染禽痘病毒S-FPV-017的鸡胚成纤维细胞,利用gfp和gpt同时进行双重筛选、数轮蚀斑纯化构建了重组病毒rFPV-gpt-gfp-HA9,通过PCR、Western blot鉴定,结果证明,获得了能稳定表达AIV HA蛋白的重组禽痘病毒r-FPV-gpt-gfp-HA9。

关键词：重组禽痘病毒绿色荧光蛋白黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶 HA基因

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猪流感病毒神经氨酸酶基因(N1和N2)在昆虫细胞中的表达

猪流感病毒神经氨酸酶基因(N1和N2)在昆虫细胞中的表达

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：万春和刘明刘春国杨涛中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室福建省农业科学院畜牧兽医研究所

根据GenBank发表的N1和N2亚型猪流感NA基因序列设计引物,扩增出NA基因片段,将其克隆到pFastBacGP67A和pFastBacGP67C杆状病毒载体上,筛选阳性重组转座载体pFastBacGP67A-N1和pFastBacGP67C-N2,转化含有杆状病毒穿梭载体(Bacmid)的DH10Bac感受态细胞,构建杆状病毒表达载体获得重组转座子rBacmid-N1和rBacmid-N2,在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBv-N1和rBv-N2,再感染细胞,收获目的蛋白。通过SDS-PAGE蛋白电泳、免疫印迹法、免疫组化分析表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物学活性。

关键词：猪流感病毒神经氨酸酶基因昆虫细胞杆状病毒表达

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禽流感基因诊断技术研究进展

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动物医学进展 2008年第8期29卷 60-62页

作者：田丽娜王秀荣杨忠苹石霖陶启蒙陈化兰东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

禽流感是由流感病毒引起的一种人和动物的高度传染性疾病,不但造成养禽业的巨大经济损失,还对人类公共卫生安全存在威胁。因此,快速、准确的基因诊断技术对于禽流感的防控显得非常重要。近年来,主要有RT-PCR技术、荧光定量RT-PCR技术、... 详细信息

禽流感是由流感病毒引起的一种人和动物的高度传染性疾病,不但造成养禽业的巨大经济损失,还对人类公共卫生安全存在威胁。因此,快速、准确的基因诊断技术对于禽流感的防控显得非常重要。近年来,主要有RT-PCR技术、荧光定量RT-PCR技术、核酸依赖扩增技术(NASBA)以及基因芯片等基因诊断技术。文章就这些方法的基本原理、检测优点以及应用现状进行综述,以期为有效控制禽流感的发生与流行提供有力技术支撑。

关键词：禽流感反转录-聚合酶链反应核酸依赖扩增技术基因芯片

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表达H7亚型禽流感病毒HA基因的重组禽痘病毒的构建及其免疫效力评估

表达H7亚型禽流感病毒HA基因的重组禽痘病毒的构建及其免疫效力评...

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：李俊辉王艳丽姜永萍左青山冉多良陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室新疆农业大学动物医学院

本研究将我国H7亚型禽流感病毒分离株A/Chicken/Hebei/1/02(H7N2)的HA基因克隆到质粒pSY538上,把含有禽痘病毒启动子P11的LacZ基因亚克隆到质粒pSY538-HA7的SmaⅠ位点,然后切下同时含有HA和LacZ基因的片段再克隆到禽痘病毒载体pSY681的... 详细信息

本研究将我国H7亚型禽流感病毒分离株A/Chicken/Hebei/1/02(H7N2)的HA基因克隆到质粒pSY538上,把含有禽痘病毒启动子P11的LacZ基因亚克隆到质粒pSY538-HA7的SmaⅠ位点,然后切下同时含有HA和LacZ基因的片段再克隆到禽痘病毒载体pSY681的NotⅠ位点,构建出禽痘病毒转移载体pSY681-HA7-LacZ,将此重组质粒与亲本禽痘病毒S-FPV-017共转染鸡胚成纤维细胞,通过加入X-gal进行数轮重组病毒的筛选、纯化,获得一株重组病毒rFPV-H7HB,PCR和Western blot鉴定结果表明重组鸡痘病毒可以稳定表达HA蛋白。分别用106PFU、104PFU、102PFU剂量的重组病毒rFPV-H7HB经翅膀刺种途径接种免疫4周龄SPF鸡,免疫3周后分别用100LD50的HPAIV A/FPV/Rostock/34(H7N1)鼻腔途径进行攻击。结果,不同剂量的重组病毒免疫后均可诱导出较高水平的HI抗体,并可完全抵抗H7N1毒株的致死性攻击,而非免疫对照组在攻毒后全部发病并死亡。结果表明,稳定高效表达我国H7亚型禽流感分离株A/Chicken/Hebei/1/02(H7N2)HA基因的重组禽痘病毒rFPV-H7HB可为我国H7亚型高致病性禽流感的防制提供必要和有效的物质技术储备。

关键词：禽流感 H7亚型 HA基因重组禽痘病毒

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猪流感病毒M基因实时荧光定量PCR诊断方法的建立

猪流感病毒M基因实时荧光定量PCR诊断方法的建立

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：张春明乔传玲陈艳杨焕良辛晓光陈化兰冉多良中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室新疆农业大学动物医学学院

根据猪流感病毒(SIV)M基因的保守序列,使用Primer Express2.0软件设计并合成一套特异性引物和TaqMan MGB探针,建立了SIV M基因实时荧光定量PCR检测方法。使用含有选定检测序列的重组质粒pMD-M标准品做标准曲线,结果表明:该方法的灵敏度1... 详细信息

根据猪流感病毒(SIV)M基因的保守序列,使用Primer Express2.0软件设计并合成一套特异性引物和TaqMan MGB探针,建立了SIV M基因实时荧光定量PCR检测方法。使用含有选定检测序列的重组质粒pMD-M标准品做标准曲线,结果表明:该方法的灵敏度1EID50,标准曲线的相关系数为0.99949,组间与组内重复试验变异系数分别为0.21%,0.65%,除猪流感病毒外,其他5种猪病病毒检测均为阴性,样品检测与病毒滴定及病毒分离结果的符合率均为100%,该方法特异性好、重复性佳,为SIV检测提供了一种特异、敏感、快速的定量检测方法。

关键词： SIV TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR

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抗猪流感病毒H1亚型HA蛋白特异性单克隆抗体的研制

抗猪流感病毒H1亚型HA蛋白特异性单克隆抗体的研制

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：李洪涛刘明刘春国杜金铃孙恩成刘洋中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室东北农业大学黑龙江八一农垦大学

本试验构建了H1亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)HA基因表达质粒,基因免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,加强免疫后取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。通过ELISA、HI试验筛选阳性克隆。应用ELISA、HI试验和Western blot试... 详细信息

本试验构建了H1亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)HA基因表达质粒,基因免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,加强免疫后取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。通过ELISA、HI试验筛选阳性克隆。应用ELISA、HI试验和Western blot试验测定McAb的反应性和特异性。共获得3株分泌抗H1亚型猪流感病毒HA蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为8C4、8C6、9D6。McAb腹水ELISA效价在1:16000～1:256000之间;HI效价为1:512～1:256000;对A/Swine/Guangdong/LM/2004的中和效价分别为:10-2.83、10-6.4、10-5.8。Western blot分析结果显示,3株McAb只与H1亚型猪流感病毒HA蛋白反应。HA蛋白特异性McAb的研制为H1抗原变异分析及H1亚型猪流感诊断方法的建立奠定了物质基础。

关键词：猪流感基因免疫单克隆抗体血凝抑制

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H5N1亚型禽流感病毒HA基因核酸疫苗的构建及免疫效果研究

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动物医学进展 2008年第7期29卷 13-18页

作者：陈浩刘明刘春国杨涛李洪涛杜金玲孙恩成东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 黑龙江八一农垦大学黑龙江大庆163319

采用RT-PCR技术扩增了高致病性禽流感病毒A/Goose/HLJ/QFY/04(H5N1)HA基因,然后将其克隆到真核表达载体pCI-neo中,获得重组质粒pCI-HA。在脂质体介导下转染Vero细胞,单抗免疫组化IPMA结果表明,HA蛋白在VeroE6细胞上大量表达。pCI-HA质... 详细信息

采用RT-PCR技术扩增了高致病性禽流感病毒A/Goose/HLJ/QFY/04(H5N1)HA基因,然后将其克隆到真核表达载体pCI-neo中,获得重组质粒pCI-HA。在脂质体介导下转染Vero细胞,单抗免疫组化IPMA结果表明,HA蛋白在VeroE6细胞上大量表达。pCI-HA质粒在有或无脂质体佐剂存在下以50μg剂量免疫接种Balb/c小鼠和SPF鸡,对照组只接种50μgpCI-neoDNA,各组以相同剂量加强免疫两次,每次免疫间隔3周。每次免疫前采集血清用ELISA检测抗体效价。最后一次免疫后3周用106EID50的高致病性流感病毒A/Goose/HLJ/QFY/04(H5N1)进行攻毒试验。免疫组小鼠抗体效价与对照组相比明显升高,但脂质体佐剂免疫组与非脂质体免疫组小鼠抗体效价差异不显著,基因免疫组小鼠能够抵抗H5N1高致病性禽流感病毒的致死性攻击。该核酸疫苗虽然能够诱导SPF鸡产生抗体应答,但抗体产生缓慢,效价较低。

关键词：禽流感病毒 HA基因核酸疫苗免疫效力

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H3N2亚型猪流感病毒HA基因序列测定及抗原性分析

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动物医学进展 2008年第3期29卷 5-9页

作者：刘大飞杨涛刘明刘春国桑学波刘大程中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 黑龙江农垦总局畜牧兽医总站哈尔滨分站．黑龙江哈尔滨150038 莱阳市城厢兽医站山东莱阳265200

采用RT～PCR技术对4株H3N2亚型猪流感病毒的HA基因进行了扩增，将获得的PCR产物分别与pMD18-T克隆载体连接，进行序列测定。测序结果显示，4个毒株均含有完整的开放阅读框，并且均未发现核苷酸插入或缺失现象；分离毒株间核苷酸同源性... 详细信息

采用RT～PCR技术对4株H3N2亚型猪流感病毒的HA基因进行了扩增，将获得的PCR产物分别与pMD18-T克隆载体连接，进行序列测定。测序结果显示，4个毒株均含有完整的开放阅读框，并且均未发现核苷酸插入或缺失现象；分离毒株间核苷酸同源性为99．4％～99．7％，氨基酸同源性为98．2％～99．3％。同源性分析表明，4个毒株与2003年的猪流感病毒广东分离株有很高同源性（均在99％以上），说明近段时间我国H3N2亚型的猪流感病毒变异不大，重组的频率不是很高，同时又与人流感病毒香港分离株有较高的同源性（均为99．4％）。交叉血凝抑制试验显示，S3株与其他3毒株抗原性差异明显。鉴于猪在流感病毒传播与复制间的特殊地位，应密切监测猪流感。

关键词：猪流感病毒 HA基因克隆抗原性分析

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H3N2亚型猪流感病毒的拯救

H3N2亚型猪流感病毒的拯救

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：杜金玲刘明杨涛刘春国李洪涛孙恩成万春和刘大飞陈浩齐金龙中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室黑龙江八一农垦大学动物科技学院福建省农科院畜牧兽医研究所

利用反向遗传学操作技术,以A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)毒株为亲本株,采用RT-PCR技术对该病毒的8个基因片段分11段进行扩增,通过与双向转录载体pHW2000连接,转染293T和MDCK共培养细胞,成功拯救出全部基因均来自于A/Swine/Henan/S4/01(H3... 详细信息

利用反向遗传学操作技术,以A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)毒株为亲本株,采用RT-PCR技术对该病毒的8个基因片段分11段进行扩增,通过与双向转录载体pHW2000连接,转染293T和MDCK共培养细胞,成功拯救出全部基因均来自于A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)的猪流感病毒,生物学实验结果表明该拯救毒株在鸡胚半数感染量,组织培养半数感染量,稳定性试验等方面都与亲本株保持一致。拯救的H3N2亚型猪流感病毒经鸡胚多次传代后血凝价最高可达到1颐256,在接种MDCK60h后,血凝价可达到1颐64。H3N2亚型猪流感病毒的拯救成功,为研究流感病毒突破种间屏障分子机制和猪流感基因工程疫苗株的筛选奠定了基础。

关键词：猪流感 H3N2亚型反向遗传病毒拯救

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