检索结果-内蒙古大学图书馆

H5N1亚型高致病性禽流感病毒NP基因在昆虫细胞中的表达及其表达产物的生物学活性

中国兽医科学 2008年第5期38卷 380-385页

作者：万春和刘明刘春国杨涛刘大飞齐金龙陈浩杜金铃李洪涛中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

根据GenBank上登录的H5N1亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV)核蛋白(NP)基因序列设计引物,通过PCR扩增出A/Goose/HLJ/QFY/04(H5N1)毒株的NP基因片段,将其克隆到pFastBacGP67B杆状病毒载体上,将筛选的阳性重组转座载体pFastBacGP67B-NP转化... 详细信息

根据GenBank上登录的H5N1亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV)核蛋白(NP)基因序列设计引物,通过PCR扩增出A/Goose/HLJ/QFY/04(H5N1)毒株的NP基因片段,将其克隆到pFastBacGP67B杆状病毒载体上,将筛选的阳性重组转座载体pFastBacGP67B-NP转化至含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,构建了杆状病毒表达载体,获得了重组转座子(rBacmid-NP),在脂质体介导下转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBv-NP)。SDS-PAGE分析、Western-blotting检测、免疫组化分析和ELISA试验结果表明,分子质量约为54 ku的重组核蛋白得到了高效表达,该表达蛋白具有良好的生物学活性。

关键词：禽流感病毒核蛋白基因昆虫细胞杆状病毒表达

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H9亚型禽流感病毒SD96株HA蛋白特异性单抗的制备及鉴定

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中国预防兽医学报 2008年第2期30卷 149-152,160页

作者：李雪平邓国华田国斌陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

本研究用H9N2亚型禽流感病毒分离株A/Chicken/Shandong/6/1996(CK/SD/6/96)免疫6周龄BALB/c雌性小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。采用血凝抑制(HI)和ELISA方法筛选阳性细胞克隆,连续多次克隆培养后获得3株能稳定分泌H9亚... 详细信息

本研究用H9N2亚型禽流感病毒分离株A/Chicken/Shandong/6/1996(CK/SD/6/96)免疫6周龄BALB/c雌性小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。采用血凝抑制(HI)和ELISA方法筛选阳性细胞克隆,连续多次克隆培养后获得3株能稳定分泌H9亚型HA特异性单抗的细胞株1F4C4、9F12D1、2C5H12。3株阳性杂交瘤细胞的培养上清及腹水对CK/SD/6/96的HI效价分别为26、24、21和212、210、27。特异性试验表明该3株单抗均不与其他主要禽类病毒和其他14个HA亚型的禽流感病毒发生交叉反应。1F4C4和2C5H12抗体亚类为IgG2b,9F12D1为IgG2a。这3株单抗对H9亚型不同抗原群流感毒株有不同程度的中和作用,表现出单抗识别抗原位点的差异性,为进一步研究H9亚型流感病毒的抗原性差异以及抗原识别提供了物质基础和条件。

关键词：禽流感单抗 ELISA

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检测流感病毒H5亚型抗体竞争ELISA方法的建立及初步应用

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中国预防兽医学报 2008年第9期30卷 716-720页

作者：李雪平邓国华高玉伟唐艳玲艾嘉亮葛叶陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

本研究采用灭活的H5亚型禽流感纯化病毒包被ELISA反应板,以辣根过氧化物酶标记的HA蛋白单克隆抗体作为竞争检测抗体,建立了检测H5亚型流感病毒抗体的竞争ELISA(C-ELISA)方法。实验结果表明:抗原最佳包被浓度为8.27μg/mL(1∶800),酶标... 详细信息

本研究采用灭活的H5亚型禽流感纯化病毒包被ELISA反应板,以辣根过氧化物酶标记的HA蛋白单克隆抗体作为竞争检测抗体,建立了检测H5亚型流感病毒抗体的竞争ELISA(C-ELISA)方法。实验结果表明:抗原最佳包被浓度为8.27μg/mL(1∶800),酶标抗体最佳稀释倍数为1∶800,待检血清最佳稀释倍数为1∶10。对已知阳性样品的检测结果表明,本研究中所建立的竞争ELISA方法的敏感性高于经典的血凝抑制方法(HI)。特异性试验表明该ELISA方法仅能检测H5亚型流感病毒抗体,具有良好的特异性。对临床样品检测表明C-ELISA与HI方法的符合率达到93%以上。该方法可以对不同种属动物血清H5亚型流感病毒抗体进行快速定量的检测,为H5亚型流感病毒流行病学调查与抗体的检测提供了一种快速、方便、敏感的方法。

关键词：禽流感单抗竞争ELISA

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H5亚型高致病性禽流感病毒抗原捕捉ELISA诊断方法的建立

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中国预防兽医学报 2008年第1期30卷 68-71,80页

作者：曲站红邓国华王桂芹张立春田国彬于康震陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室中国兽医药品监察所北京100081

本研究在已有H5亚型禽流感病毒特异性单抗基础上,建立了以多抗作为包被抗体、单抗作为检测抗体的抗原捕捉ELISA方法。通过对各个反应条件进行优化,获得的最佳工作条件为:羊血清1∶1600倍稀释;单抗1∶10000稀释;酶标抗体最适工作浓度为1... 详细信息

本研究在已有H5亚型禽流感病毒特异性单抗基础上,建立了以多抗作为包被抗体、单抗作为检测抗体的抗原捕捉ELISA方法。通过对各个反应条件进行优化,获得的最佳工作条件为:羊血清1∶1600倍稀释;单抗1∶10000稀释;酶标抗体最适工作浓度为1∶5000倍稀释;单抗反应时间1.5h;酶标抗体作用时间1.5h。特异性试验和敏感性试验结果表明:该方法具有良好的特异性和敏感性,可用于H5亚型高致病性禽流感病毒的检测。

关键词：禽流感病毒 H5亚型 ELISA

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猪流感病毒血凝素基因原核表达及其在间接ELISA中的初步应用

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畜牧与兽医 2008年第11期40卷 10-13页

作者：陈艳乔传玲丁选亚杨焕良辛晓光韩庆功陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

利用RT-PCR方法扩增猪流感病毒A/Swine/Henan/11/2005(H1N1)血凝素(HA)基因,克隆于pMD18-T载体进行测序。以pMD18-HA为模板、利用带酶切位点的引物再次扩增HA基因的开放阅读框(ORF),克隆到表达载体pET32a中,经双酶切、测序及PCR鉴定得... 详细信息

利用RT-PCR方法扩增猪流感病毒A/Swine/Henan/11/2005(H1N1)血凝素(HA)基因,克隆于pMD18-T载体进行测序。以pMD18-HA为模板、利用带酶切位点的引物再次扩增HA基因的开放阅读框(ORF),克隆到表达载体pET32a中,经双酶切、测序及PCR鉴定得到阳性重组表达质粒pET-HA,将质粒转化到表达宿主菌BL21(DE3)中,经终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导,SDS-PAGE结果显示,HA蛋白获得了高效表达,经Western-blot检测证实表达产物具有良好的免疫学活性,在间接ELISA中的初步应用表明具有良好的抗原反应性。本研究为以重组HA蛋白为抗原建立H1亚型猪流感抗体的ELISA检测方法奠定了基础。

关键词：猪流感病毒 HA基因原核表达

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猪流感病毒M基因实时荧光定量PCR诊断方法的建立

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中国预防兽医学报 2008年第10期30卷 805-810页

作者：张春明乔传玲陈艳杨焕良辛晓光陈化兰冉多良中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

根据猪流感病毒(SIV)M基因的保守序列,设计并合成一对特异性引物和TaqManMGB探针,建立了SIVM基因实时荧光定量PCR检测方法。使用含有M基因的重组质粒pMD-M作为标准品绘制标准曲线,其相关系数为0.999,检测结果表明:该方法的敏感性可达到1... 详细信息

根据猪流感病毒(SIV)M基因的保守序列,设计并合成一对特异性引物和TaqManMGB探针,建立了SIVM基因实时荧光定量PCR检测方法。使用含有M基因的重组质粒pMD-M作为标准品绘制标准曲线,其相关系数为0.999,检测结果表明:该方法的敏感性可达到1个EID50,组间与组内重复试验变异系数分别为0.21%和0.65%,除SIV外,其他5种猪病病毒检测均为阴性,样品检测与病毒滴定及病毒分离结果的符合率均达到100%,该方法特异性强、重复性好,有望成为SIV的一种特异、敏感、快速的定量检测方法。

关键词： SIV Taq Man MGB探针实时荧光定量PCR

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H5N1亚型高致病性禽流感病毒A/Duck/Guangxi/53/02株感染性克隆的构建

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中国兽医学报 2008年第5期28卷 536-538,552页

作者：温峰琴樊树芳胡永浩邓国华陈化兰甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室／兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

A/Duck/Guangxi/53/02(DKGX)是从我国南方健康鸭体内分离到的H5N1亚型禽流感病毒,该病毒对鸡具有高致病性,而且能感染哺乳动物模型Balb/c小鼠,但不致死小鼠(MLD50>106.5)。本试验根据GenBank上的序列DKGX/53/02设计了8对引物,建立了... 详细信息

A/Duck/Guangxi/53/02(DKGX)是从我国南方健康鸭体内分离到的H5N1亚型禽流感病毒,该病毒对鸡具有高致病性,而且能感染哺乳动物模型Balb/c小鼠,但不致死小鼠(MLD50>106.5)。本试验根据GenBank上的序列DKGX/53/02设计了8对引物,建立了对DKGX的8质粒反向遗传操作系统,并通过细胞转染技术成功拯救了R-DKGX。R-DKGX在对哺乳动物模型Balb/c小鼠的致病性方面保持了与亲本野生毒(W-DKGX,MLD50>106.5)一致的生物学特性,即106EID50鼻腔感染小鼠后3 d均只能在肺脏检测到病毒,病毒含量分别为(3.22±0.51)lgEID50/mL和(3.69±0.88)lgEID50/mL,MLD50>106.5。

关键词：禽流感病毒 H5N1 感染性克隆

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H5N1亚型禽流感病毒A／Anhui／2／2005活候选疫苗株的构建及其对鸡致病性的研究

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中国预防兽医学报 2008年第11期30卷 831-835页

作者：樊树芳许传田索永兵陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室／兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 内蒙古农业大学动物科学与医学学院内蒙古呼和浩特010018

A/Ann Arbor/6/60ca(H2N2)冷适应疫苗供体株具有冷适应性、温度敏感性和致弱性表型。本研究利用基因工程技术体外合成A/Ann Arbor/6/60ca(H2N2)冷适应疫苗株具有冷适应性的内部基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS,从A/Anhui/2/2005(H5N1)毒株... 详细信息

A/Ann Arbor/6/60ca(H2N2)冷适应疫苗供体株具有冷适应性、温度敏感性和致弱性表型。本研究利用基因工程技术体外合成A/Ann Arbor/6/60ca(H2N2)冷适应疫苗株具有冷适应性的内部基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS,从A/Anhui/2/2005(H5N1)毒株获得HA、NA,并对HA基因上的多个连续碱性氨基酸基序进行了缺失修饰。将上述8个基因片段分别克隆至pBD双向表达载体中测序鉴定。利用质粒反向遗传操作系统,将构建正确的8个重组pBD质粒转染Vero细胞拯救病毒。经RT-PCR和序列测定鉴定,结果表明本试验成功获得了一株H5N1亚型A/Anhui/2/2005重组病毒,将其命名为AH/AAca,救获的重组病毒具有预期的温度敏感性和冷适应性生物学特性。随后进行了AH/AAca人工感染SPF鸡的感染性和致病性试验,结果表明其对鸡既无感染性,也无致病性。AH/AAca的获得为评价其在小鼠、非人类灵长目等动物模型上的保护效力的研究打下了坚实基础,为我国预防人禽流感的流行建立了技术储备。

关键词：禽流感病毒反向遗传操作救获病毒冷适应性温度敏感性

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鸭源H5N1亚型禽流感病毒分离株的致病性及表面蛋白基因序列分析

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畜牧与兽医 2008年第11期40卷 17-20页

作者：杨德全李雁冰施建忠陈化兰张书霞南京农业大学动物医学院江苏南京210095 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室国家禽流感参考实验室黑龙江哈尔滨150001

分析1株2004年从广东省分离获得的HSN1型禽流感病毒株A／Duck／GuangdongJiedong／23／2004对SPF鸡和鸭的致病性，并对其血凝素（HA）基因和神经氨酸酶（NA）基因的序列进行测定，与GenBank中收录的其他序列进行比较。结果，此分离株对... 详细信息

分析1株2004年从广东省分离获得的HSN1型禽流感病毒株A／Duck／GuangdongJiedong／23／2004对SPF鸡和鸭的致病性，并对其血凝素（HA）基因和神经氨酸酶（NA）基因的序列进行测定，与GenBank中收录的其他序列进行比较。结果，此分离株对SPF鸡和鸭均具有高致病性，且致死率达100％。HA基因与SCK／ST／475／04的同源率最高，而NA基因与Ck／GD／178／04同源率最高。进化分析结果表明，此毒珠与DK／Chi—na／E319-2／03的HA、NA亲缘关系较近，推测它们来源于同一祖代毒株。推导的HA基因氨基酸裂解位点为-RRRKK-，具有典型高致病性禽流感的特征序列；NA基因颈部49～68位20个氨基酸缺失是近年来H5N1亚型优势流行株共同的遗传标志。

关键词：禽流感病毒 1-15N1亚型致病性血凝素神经氨酸酶序列分析

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实时荧光定量PCR技术快速定量检测H3N2亚型猪流感病毒

实时荧光定量PCR技术快速定量检测H3N2亚型猪流感病毒

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：陈艳张春明乔传玲杨焕良张飞吴运谱辛晓光陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室

选取H3N2亚型猪流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)基因保守序列,使用Primer Express2.0软件设计出特异性引物和TaqMan MGB探针,利用实时荧光定量PCR技术来检测猪流感病毒。使用含有选定检测序列的重组质... 详细信息

选取H3N2亚型猪流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)基因保守序列,使用Primer Express2.0软件设计出特异性引物和TaqMan MGB探针,利用实时荧光定量PCR技术来检测猪流感病毒。使用含有选定检测序列的重组质粒pMD-H3、pMD-N2标准品做标准曲线,结果表明该方法的灵敏度为100拷贝/反应,标准曲线的相关系数分别为0.99015(H3)、0.99947(N2),除猪流感病毒H3N2亚型外,猪流感病毒H1N1亚型、H9亚型与其他5种猪病病毒检测均为阴性,样品检测与病毒滴定及病毒分离结果的符合率均为100%,该方法特异性好、重复性佳,为H3N2亚型猪流感病毒检测提供了一种特异、敏感、快速的定量检测方法。

关键词：猪流感病毒 TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR

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