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科技导报 2006年第3期24卷 9-13页

作者：操胜刘光亮孟庆文杨增岐亓文宝于康震吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 农业部畜牧兽医总站北京100026 西北农林科技大学动物科技学院

禽流感病毒是养禽业危害最严重的病原微生物之一。为探讨小干涉RNA(siRNA)对A型禽流感病毒复制的干扰作用,以H5亚型AIV PB2基因为靶序列,设计合成了4对编码siRNAs的DNA序列,将其克隆到psiRNA-hH1neo载体中,构建siRNAs表达载体,鉴定正确... 详细信息

禽流感病毒是养禽业危害最严重的病原微生物之一。为探讨小干涉RNA(siRNA)对A型禽流感病毒复制的干扰作用,以H5亚型AIV PB2基因为靶序列,设计合成了4对编码siRNAs的DNA序列,将其克隆到psiRNA-hH1neo载体中,构建siRNAs表达载体,鉴定正确后将重组质粒转染MDCK细胞,采用G418筛选建立抗性细胞系,用血凝(HA)试验和real time RT-PCR试验检测抑制效果, 在细胞水平筛选出具有高效抑制AIV复制的2个靶位点PB2-1154、PB2-342、为AIV的基因功能研究,抗病毒药物的开发和转基因动物的研究奠定了基础。

关键词：禽流感病毒聚合酶Ⅱ基因 RNA干扰

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表达禽流感病毒NA1及NA2基因重组禽痘病毒的构建

表达禽流感病毒NA1及NA2基因重组禽痘病毒的构建

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中国畜牧兽医学会禽病学分会第十三次学术研讨会

作者：王全英乔传玲张洪波陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室暨兽医生物技术国家重点实验室内蒙古农业大学动物医学系

从含有禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)NA1基因的质粒PMD18-TNA1中切下NA1基因片段,将其亚克隆到pSY538的EcoRI位点,将带有痘苗病毒启动子P11的LacZ基因平端克隆到该质粒的SmaI位点,然后切下同时含有NA1及LacZ基因的片段再亚克... 详细信息

从含有禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)NA1基因的质粒PMD18-TNA1中切下NA1基因片段,将其亚克隆到pSY538的EcoRI位点,将带有痘苗病毒启动子P11的LacZ基因平端克隆到该质粒的SmaI位点,然后切下同时含有NA1及LacZ基因的片段再亚克隆到禽痘病毒载体pSY681的NotI位点,从而构建出表达AIV NA1基因的重组禽痘病毒转移载体。应用脂质体介导的方法将转移载体转染已感染禽痘病毒S-FPV-017的鸡胚成纤维细胞,在X-gal存在的条件下,经过蓝白斑筛选、数轮蚀斑纯化、PCR和Western-blot检测等,结果获得了能稳定表达NA1蛋白的重组禽痘病毒。从含有禽流感病毒A/Chicken/Guangdong/21/02(H9N2)NA2基因的质粒PBD-NA2中扩增出NA2基因片段,将其克隆到PCAGG的SmaI位点,同时将pSY538用EcoRI和BamHI进行双酶切,然后用EcoRⅠ和BglⅡ将NA2基因切下,将其粘端亚克隆到pSY538的EcoRI和BamHI位点,以下同NA1的重组禽痘病毒的构建,结果获得了能稳定表达NA2蛋白的重组禽痘病毒。实验结果表明所获得的重组病毒rFPV-NA1和rFPV-NA2遗传性状稳定,并能够对其重组的单个外源基因进行表达,且在培养细胞中的表达产物具有与AIV蛋白相似的生物学特性。

关键词：禽流感病毒神经氨酸酶基因重组禽痘病毒

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一株鹅源H5N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及生物学特性分析

一株鹅源H5N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及生物学特性分析

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中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2006年学术年会

作者：刘春国刘明杨涛张云张晓霁潘蔚绮中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室哈尔滨150001 中国科学院广州生物医药与健康研究院广州510663

分离到一株鹅源H5N2亚型禽流感病毒,S P F鸡静脉接种致病指数为2.99,但鸭子对该病毒不敏感.病毒感染小鼠后仅在肺内复制,但不致病.HA蛋白裂解位点上插入有多个连续的碱性氨基酸(RRRKKR),从分子上证实这是一株高致病性禽流感病毒.核酸序... 详细信息

分离到一株鹅源H5N2亚型禽流感病毒,S P F鸡静脉接种致病指数为2.99,但鸭子对该病毒不敏感.病毒感染小鼠后仅在肺内复制,但不致病.HA蛋白裂解位点上插入有多个连续的碱性氨基酸(RRRKKR),从分子上证实这是一株高致病性禽流感病毒.核酸序列比较分析表明W2株流感病毒HA基因与CK/HB/489/2004(H5N1)同源率达到99.4％,NA基因与CK/JL/53/01(H9N2)同源率达到99.8％;氨基酸水平上,HA与04年分离到的CK/HB/489/200(H5N1)、CK/HN/210/200(H5N1)、WD/GD/314/20(H5N1)和Swan/GX/307/2(H5N1)四株H5N1亚型流感病毒的同源率均为99.3％,NA与CK/JL/53/01(H9N2)同源率为99.6％.HA蛋白中含有8个潜在的糖基化位点,比大多数流感病毒多出一个170位的***蛋白222位和226位分别为Gln和Gly;226位为Leu,在基因序列上保持着与近期大陆分离的H5N1亚型禽流感毒株相近的分子特征.

关键词：禽流感病毒 H5N2亚型高致病性序列分析生物学特性

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H5亚型禽流感病毒HA基因昆虫／杆状病毒系统的表达及对BALB/c小鼠的免疫保护

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科技导报 2006年第3期24卷 5-8页

作者：孟庆文刘光亮于康震童光志刘娣施建忠陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 东北林业大学博士后流动站黑龙江省农业科学院博士后工作站北京100026 农业部畜牧兽医总站哈尔滨150086

经RT-PCR扩增了禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1／96 H5N1亚型1．7kb HA基因的cDNA,将其克隆到pMD18-T中并测序。亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacA的蜜蜂蜂毒素分泌信号下游中,测序正确后与线性化的杆状病毒DNA(Bac-N-BlueTM DNA)共转染... 详细信息

经RT-PCR扩增了禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1／96 H5N1亚型1．7kb HA基因的cDNA,将其克隆到pMD18-T中并测序。亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacA的蜜蜂蜂毒素分泌信号下游中,测序正确后与线性化的杆状病毒DNA(Bac-N-BlueTM DNA)共转染Sf9昆虫细胞。将重组杆状病毒感染HFive细胞,72h左右收获细胞,超声波裂解,SDS—PAGE结果表明HA基因在重组杆状病毒感染的HFive细胞中获得表达。蛋白胶薄层扫描分析显示:表达的HA蛋白占重组杆状病毒感染细胞总蛋白含量的17．1％。Western-blot 及血凝实验结果显示,表达的禽流感H5N1亚型病毒HA蛋白具有生物学活性。表达的H5 HA蛋白定量乳化后,皮下多点注射免疫SPF 级BALB/c雌性小鼠,免疫后产生了H5 HA特异抗体,并在三免前后达到并保持较高水平。用致死剂量的HPAIV H5N1攻击小鼠,免疫组小鼠提供了100％的保护力,而对照组小鼠先后发病且死亡:为研制禽流感H5N1亚型病毒亚单位疫苗,防制禽流感奠定了基础。

关键词：禽流感病毒血凝素重组杆状病毒亚单位疫苗免疫保护

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在DNA芯片平台上探测AIV不同亚型cDNA

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中国农业科学 2005年第2期38卷 394-398页

作者：王秀荣邓国华于康震石锐刘丽玲乔传玲陈化兰孔宪刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

对以基因芯片技术为基础的检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒的快速诊断技术进行了研究。试验中所使用的病毒为A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)、A/African　starling/983/79(H7N1)和　A/Turkey/Wisconsin/1/66(H9N2)。通过RT-PCR获得大约500　bp的禽流感病毒基因cDNAs片段,克隆,从重组质粒扩增DNA片段,并点到玻璃载体上,制成芯片。在病毒RNA反转录过程中,用Cy5标记样品　cDNAs。样品　cDNAs是一个包括禽流感病毒HA和M基因的混合物。依据M基因鉴别型,依据HA基因鉴别亚型。扫描芯片上探针结合位点,杂交信号与预期设想基本一致。结果显示,DNA芯片技术可以提供一种有效的AIV诊断方法。

关键词：禽流感病毒基因芯片亚型鉴定

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H5亚型禽流感DNA疫苗质粒pCAGGoptiHA5对高致病力禽流感病毒攻击的免疫保护

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畜牧兽医学报 2005年第11期36卷 1178-1182页

作者：姜永萍张洪波李呈军步志高于康震陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 农业部畜牧兽医总站北京100026

对H5亚型禽流感DNA疫苗质粒pCAGGoptiHA5的免疫效果进行了研究。pCAGGoptiHA5分别以100和10μg剂量一次或两次免疫3周龄SPF鸡,首次免疫后4周以同样剂量和途径进行第二次免疫,一次免疫后4周、两次免疫后2周分别用100LD50的HPAIV A/Goose/... 详细信息

对H5亚型禽流感DNA疫苗质粒pCAGGoptiHA5的免疫效果进行了研究。pCAGGoptiHA5分别以100和10μg剂量一次或两次免疫3周龄SPF鸡,首次免疫后4周以同样剂量和途径进行第二次免疫,一次免疫后4周、两次免疫后2周分别用100LD50的HPAIV A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)鼻腔途径进行攻击,观察发病与死亡情况,分别于攻毒后第3、5、7天采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测排毒情况,同时检测免疫后、攻毒前及攻毒后血清HI抗体、NT抗体以及AGP抗体的动态变化。结果,100μg pCAGGoptiHA5一次免疫、100μg pCAGGoptiHA5两次免疫以及10μg pCAGGoptiHA5两次免疫均可对免疫鸡形成100%完全保护(不发病、不致死、不排毒),10μg剂量pCAGGoptiHA5一次免疫可对免疫鸡形成100%的保护(不发病、不致死),结果表明,pCAGGoptiHA5作为疫苗效果良好、成本低廉,有望成为预防H5亚型高致病力禽流感的高效、安全新型基因工程疫苗。

关键词：禽流感 H5亚型 DNA疫苗pCAGGoptiHA5 免疫保护

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密码子的鸡体偏嗜性优化增强H5亚型禽流感HA基因的表达水平和免疫原性

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免疫学杂志 2005年第5期21卷 377-381页

作者：姜永萍张洪波李呈军步志高张芳芳于康震陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 农业部畜牧兽医总站北京100026

目的用鸡偏嗜性密码子替换H5亚型禽流感病毒A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的保护性免疫原HA基因的密码子,优化和构建了基因optiHA5,以提高H5亚型禽流感DNA疫苗的表达水平和免疫保护效果。方法利用寡核苷酸合成、重叠延伸... 详细信息

目的用鸡偏嗜性密码子替换H5亚型禽流感病毒A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的保护性免疫原HA基因的密码子,优化和构建了基因optiHA5,以提高H5亚型禽流感DNA疫苗的表达水平和免疫保护效果。方法利用寡核苷酸合成、重叠延伸PCR法及限制酶切法构建了密码子优化的HA基因(optiHA5),并将其插入表达载体pCI构建了DNA疫苗质粒pCIoptiHA5;将pCIoptiHA5和表达GD/1/96(H5N1)HA基因的质粒pCIHA5通过间接免疫荧光法和Western-blot分析检测转染293T细胞后瞬时表达的HA抗原蛋白;随之将pCIoptiHA5及pCIHA5分别以100μg和10μg剂量一次免疫3周龄SPF鸡,4周后用100LD50的HPAIVGD/1/96(H5N1)鼻腔途径进行攻击。结果间接免疫荧光法和Western-blot分析表明基因optiHA5表达水平显著高于野生型HA基因;免疫SPF鸡后,100μgpCIoptiHA5可形成75%的免疫保护,100μgpCIHA5可形成50%的免疫保护;10μgpCIoptiHA5可形成对免疫鸡75%的部分免疫保护,而10μgpCIHA5则基本不能形成免疫保护;pCIopti-HA5诱导的HI抗体水平远远高于pCIHA5。结论试验结果表明,HA基因密码子的优化可显著提高HA基因体外表达水平和H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平,提高免疫原性,增强免疫保护效果。

关键词：禽流感 H5亚型密码子优化的HA基因 DNA疫苗免疫保护

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具有HI活性的抗H5亚型流感病毒特异性单克隆抗体的研制

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中国预防兽医学报 2005年第5期27卷 329-332页

作者：张立春邓国华刘振勇田国彬于康震陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

以H5N1亚型禽流感病毒分离株A/Duck/Zhejiang/11/00(H5N1)(DZJ/1100)作为免疫原,浓缩纯化后免疫BALB/c小鼠,三次免疫后,取免疫小鼠脾细胞与SP2/O细胞融合,融合阳性细胞用血凝抑制(HI)方法进行检测,阳性细胞株经三代克隆纯化后,获得三株... 详细信息

以H5N1亚型禽流感病毒分离株A/Duck/Zhejiang/11/00(H5N1)(DZJ/1100)作为免疫原,浓缩纯化后免疫BALB/c小鼠,三次免疫后,取免疫小鼠脾细胞与SP2/O细胞融合,融合阳性细胞用血凝抑制(HI)方法进行检测,阳性细胞株经三代克隆纯化后,获得三株能稳定分泌抗血凝素特异性HI单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为DD7、FG10、CG12。三株杂交瘤细胞株产生的小鼠腹水和细胞培养液上清的HI滴度分别是213、215、211和278、、23。与其他具有血凝活性的禽类病毒以及其他14个HA亚型的禽流感病毒的交叉HI试验表明:这三株单抗具有良好的禽流感病毒亚型特异性;与其他H5亚型流感病毒分离株的HI试验和中和试验证实这三株单抗具有良好的交叉性(分别为7/8、8/8、8/8)和中和活性(6/8、8/8、8/8)。该亚型特异性单克隆抗体的研制成功为H5亚型禽流感病毒的疫情病原学快速诊断提供了坚实的物质保障。

关键词：禽流感血凝抑制试验单克隆抗体

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一株禽流感病毒全基因的序列分析

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中国预防兽医学报 2005年第5期27卷 332-335页

作者：刘丽玲王秀荣陈化兰邓国华乔传玲李呈军中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

通过反转录_聚合酶链式反应(RT_PCR)技术对禽流感病毒A/Turkey/Wisconsin/1/66(H9N2)的8个基因片段即PA、PB1、PB2、NS、NP、M、HA、NA分别进行扩增,然后将其克隆到PMD18_T载体后进行序列测定和拼接;并将克隆到的8个基因片段与以下毒株... 详细信息

通过反转录_聚合酶链式反应(RT_PCR)技术对禽流感病毒A/Turkey/Wisconsin/1/66(H9N2)的8个基因片段即PA、PB1、PB2、NS、NP、M、HA、NA分别进行扩增,然后将其克隆到PMD18_T载体后进行序列测定和拼接;并将克隆到的8个基因片段与以下毒株各个基因的相应序列进行比较分析:Duck/HongKong/Y280/97(DHKY280/97)、Duck/HongKong/YT439/97(DHKY439/97)、Quail/HongKong/G1/97(QHKG1/97)、A/Chicken/Beijing/1/94(CBJ1/94)、Chicken/HongKong/G9/97(CHKG9/97)、A/Turkey/California/1/66(TC/1/66)。结果表明:我们克隆到的TW1/66株的8个基因片段均含有相应病毒基因的完整开放阅读框架:TW1/66的各基因与TC/1/66株相应各基因同源性最高(NS基因除外,同源性只有67.4%)。与其它各毒株各基因同源性均较低,但与DHKY439/97各基因同源性高于与DHKY280/97、QHKG1/97、CBJ1/94、CHKG9/97各基因同源性。

关键词：禽流感病毒基因克隆序列测定

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含有鸡体偏嗜性密码子的H5亚型禽流感病毒HA基因的优化构建及其DNA疫苗体外瞬时表达研究

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中国预防兽医学报 2005年第6期27卷 441-444,449页

作者：姜永萍李呈军张洪波步志高张芳芳邓国华于康震陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 农业部畜牧兽医总站北京100026

不同物种间细胞在蛋白翻译过程中具有密码子使用的偏嗜性,鸡与A型流感病毒的密码子使用频率存在着明显差异.为此,利用寡核苷酸合成、重叠延伸PCR及限制酶切法构建了密码子优化的表达A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]HA蛋白... 详细信息

不同物种间细胞在蛋白翻译过程中具有密码子使用的偏嗜性,鸡与A型流感病毒的密码子使用频率存在着明显差异.为此,利用寡核苷酸合成、重叠延伸PCR及限制酶切法构建了密码子优化的表达A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]HA蛋白的基因optiHA5,并将其插入CMV启动子表达载体pCI构建了H5亚型DNA疫苗质粒pCIoptiHA5,将含有GD/1/96(H5N1)野生型HA基因的质粒pCIHA5和pCIoptiHA5分别转染293T细胞,间接免疫荧光检测转染后24～48h293T细胞中瞬时表达的HA抗原蛋白;Westemblot证实上述2种表达质粒均可正确表达H5亚型HA抗原蛋白,结果表明密码子优化的基因optiHA5体外瞬时表达水平显著高于野生型HA基因.这一结果为进一步开展SPF鸡免疫保护效果的比较研究奠定了基础.

关键词： H5亚型禽流感病毒 HA基因 DNA疫苗鸡体偏嗜性密码子偏嗜性寡核苷酸

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