检索结果-内蒙古大学图书馆

中国预防兽医学报 2022年第3期44卷 237-242页

作者：王一涵石文军李奇兵胡玉珍赵玉辉王广文严娅姜丽陈化兰李呈军中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业农村部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

本实验室前期通过质谱分析筛选到宿主因子II型角蛋白2(KRT2),推测其可能与流感病毒复制相关。为进一步研究KRT2对流感病毒复制的影响,本研究将真核表达质粒pCAGGS-KRT2-Myc转染至HEK293T细胞24 h后,感染A/WSN/1933(H1N1)株病毒,采用噬... 详细信息

本实验室前期通过质谱分析筛选到宿主因子II型角蛋白2(KRT2),推测其可能与流感病毒复制相关。为进一步研究KRT2对流感病毒复制的影响,本研究将真核表达质粒pCAGGS-KRT2-Myc转染至HEK293T细胞24 h后,感染A/WSN/1933(H1N1)株病毒,采用噬斑滴定、western blot及激光共聚焦技术检测过表达KTR2蛋白对流感病毒复制影响,结果显示,过表达KRT2蛋白后流感病毒滴度和NP蛋白表达均下降;激光共聚焦试验检测结果显示,过表达KRT2蛋白后,流感病毒复制早期NP蛋白向细胞核内的聚积受到了抑制。针对KRT2基因设计特异性siRNA-1/2,转染A549细胞后采用细胞活力检测试剂盒检测下调KRT2蛋白表达后对A549细胞活力影响,进一步利用荧光定量PCR方法检测干扰效率,筛选最佳siRNA,结果显示,与对照siRNA相比,KRT2特异性siRNA处理不影响A549细胞活力,且siRNA-2能更有效降低KRT2的表达。以A/WSN/1933(H1N1)株病毒感染siRNA-2转染后的A549细胞,采用噬斑滴定、western blot及激光共聚焦技术检测siRNA-2干扰下调KTR2蛋白表达对流感病毒复制影响,上述试验结果均显示,KRT2表达下调后病毒滴度和NP蛋白表达均显著提高;激光共聚焦试验结果显示,下调KRT2蛋白表达后,流感病毒在复制早期阶段受到了抑制。本研究结果首次表明,KRT2是一种负调控流感病毒复制的宿主因子。本研究丰富了流感病毒与宿主因子互作的网络,也深化了对宿主因子影响流感病毒复制机制的认知。

关键词：角蛋白2 流感病毒病毒复制

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DBNL蛋白影响A型流感病毒复制机制的研究

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中国预防兽医学报 2023年第11期45卷 1095-1100页

作者：孟德锦李奇兵胡玉珍王一涵王波石文军单智博姜丽陈化兰李呈军中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、兽医生物技术国家重点实验室/农业农村部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

A型流感病毒(IAV)在宿主细胞内复制过程中需要许多宿主因子的参与,同时IAV也能调控多种宿主因子的表达。为寻找调控IAV复制的宿主因子,本研究通过SDS-PAGE电泳检测发现H1N1亚型流感病毒A/WSN/1933株(简写为WSN)感染A549细胞会上调表达55... 详细信息

A型流感病毒(IAV)在宿主细胞内复制过程中需要许多宿主因子的参与,同时IAV也能调控多种宿主因子的表达。为寻找调控IAV复制的宿主因子,本研究通过SDS-PAGE电泳检测发现H1N1亚型流感病毒A/WSN/1933株(简写为WSN)感染A549细胞会上调表达55 ku左右的特异蛋白条带(感染后9 h),将该55 ku左右的蛋白条带切胶回收后进行质谱分析,根据质谱分析的筛选标准选择蛋白得分(Mass score)较高、谱图数(Matches)和序列数(Sequences)较为可信的宿主因子DBNL作为调控IAV复制的潜在研究对象进一步研究。本研究针对DBNL设计特异的siRNA和对照Scrambled siRNA,将其分别转染A549细胞,通过荧光定量PCR确定DBNL siRNA在转录水平的干扰效果显著;利用细胞活力测定试验确定DBNL siRNA的干扰不影响细胞活力。利用DBNL siRNA下调表达A549细胞中的DBNL后,以WSN感染该细胞,在感染后24 h、48 h分别收集细胞上清,利用MDCK细胞进行噬斑滴定试验。试验结果显示,与对照组相比,下调表达DBNL后IAV的滴度极显著降低(P<0.01),表明下调表达DBNL能够抑制A549细胞中的IAV复制。利用siRNA下调表达A549细胞中的DBNL后,以WSN感染A549细胞,采用激光共聚焦试验鉴定IAV NP蛋白的表达与定位情况。结果显示,在病毒感染后6 h,对照组中红色荧光集中分布在细胞质中,而DBNL siRNA组中红色荧光在细胞核与细胞质中均有分布,表明下调表达DBNL能够抑制细胞中IAV NP蛋白的出核。反之,通过转染过表达DBNL的重组质粒,以WSN感染A549细胞,采用激光共聚焦试验鉴定IAV NP蛋白的表达与定位情况。结果显示,在病毒感染后4 h,转染pCAGGS的对照组中红色荧光主要分布在细胞核中,而过表达DBNL组中的红色荧光在细胞核与细胞质中均有分布,表明过表达DBNL能够促进细胞中IAV NP蛋白的出核。以上研究结果证实DBNL正调控IAV的复制与其NP蛋白的出核。本研究丰富了DBNL功能的多样性,为宿主因子调控IAV复制的研究提供参考数据。

关键词：流感病毒 DBNL蛋白 NP蛋白

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H5亚型禽流感DNA疫苗质粒pCAGGoptiHA5对高致病力禽流感病毒攻击的免疫保护

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畜牧兽医学报 2005年第11期36卷 1178-1182页

作者：姜永萍张洪波李呈军步志高于康震陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 农业部畜牧兽医总站北京100026

对H5亚型禽流感DNA疫苗质粒pCAGGoptiHA5的免疫效果进行了研究。pCAGGoptiHA5分别以100和10μg剂量一次或两次免疫3周龄SPF鸡,首次免疫后4周以同样剂量和途径进行第二次免疫,一次免疫后4周、两次免疫后2周分别用100LD50的HPAIV A/Goose/... 详细信息

对H5亚型禽流感DNA疫苗质粒pCAGGoptiHA5的免疫效果进行了研究。pCAGGoptiHA5分别以100和10μg剂量一次或两次免疫3周龄SPF鸡,首次免疫后4周以同样剂量和途径进行第二次免疫,一次免疫后4周、两次免疫后2周分别用100LD50的HPAIV A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)鼻腔途径进行攻击,观察发病与死亡情况,分别于攻毒后第3、5、7天采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测排毒情况,同时检测免疫后、攻毒前及攻毒后血清HI抗体、NT抗体以及AGP抗体的动态变化。结果,100μg pCAGGoptiHA5一次免疫、100μg pCAGGoptiHA5两次免疫以及10μg pCAGGoptiHA5两次免疫均可对免疫鸡形成100%完全保护(不发病、不致死、不排毒),10μg剂量pCAGGoptiHA5一次免疫可对免疫鸡形成100%的保护(不发病、不致死),结果表明,pCAGGoptiHA5作为疫苗效果良好、成本低廉,有望成为预防H5亚型高致病力禽流感的高效、安全新型基因工程疫苗。

关键词：禽流感 H5亚型 DNA疫苗pCAGGoptiHA5 免疫保护

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密码子的鸡体偏嗜性优化增强H5亚型禽流感HA基因的表达水平和免疫原性

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免疫学杂志 2005年第5期21卷 377-381页

作者：姜永萍张洪波李呈军步志高张芳芳于康震陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 农业部畜牧兽医总站北京100026

目的用鸡偏嗜性密码子替换H5亚型禽流感病毒A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的保护性免疫原HA基因的密码子,优化和构建了基因optiHA5,以提高H5亚型禽流感DNA疫苗的表达水平和免疫保护效果。方法利用寡核苷酸合成、重叠延伸... 详细信息

目的用鸡偏嗜性密码子替换H5亚型禽流感病毒A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的保护性免疫原HA基因的密码子,优化和构建了基因optiHA5,以提高H5亚型禽流感DNA疫苗的表达水平和免疫保护效果。方法利用寡核苷酸合成、重叠延伸PCR法及限制酶切法构建了密码子优化的HA基因(optiHA5),并将其插入表达载体pCI构建了DNA疫苗质粒pCIoptiHA5;将pCIoptiHA5和表达GD/1/96(H5N1)HA基因的质粒pCIHA5通过间接免疫荧光法和Western-blot分析检测转染293T细胞后瞬时表达的HA抗原蛋白;随之将pCIoptiHA5及pCIHA5分别以100μg和10μg剂量一次免疫3周龄SPF鸡,4周后用100LD50的HPAIVGD/1/96(H5N1)鼻腔途径进行攻击。结果间接免疫荧光法和Western-blot分析表明基因optiHA5表达水平显著高于野生型HA基因;免疫SPF鸡后,100μgpCIoptiHA5可形成75%的免疫保护,100μgpCIHA5可形成50%的免疫保护;10μgpCIoptiHA5可形成对免疫鸡75%的部分免疫保护,而10μgpCIHA5则基本不能形成免疫保护;pCIopti-HA5诱导的HI抗体水平远远高于pCIHA5。结论试验结果表明,HA基因密码子的优化可显著提高HA基因体外表达水平和H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平,提高免疫原性,增强免疫保护效果。

关键词：禽流感 H5亚型密码子优化的HA基因 DNA疫苗免疫保护

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7.2分支H5N1亚型禽流感病毒反向遗传疫苗候选株的构建

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中国预防兽医学报 2013年第9期35卷 764-766页

作者：范俊李旭勇王金良郭晶邓国华施建忠陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为应对clade7.2 H5N1亚型禽流感病毒(AIV)持续发生的抗原性改变及其引发的潜在AIV的地方性流行,需要根据流行监测的抗原分析结果挑选合适的供体株制备疫苗候选株。本研究采用反向遗传操作系统,以A/Puerto Rico/8/34(PR8)的内部基因为骨... 详细信息

为应对clade7.2 H5N1亚型禽流感病毒(AIV)持续发生的抗原性改变及其引发的潜在AIV的地方性流行,需要根据流行监测的抗原分析结果挑选合适的供体株制备疫苗候选株。本研究采用反向遗传操作系统,以A/Puerto Rico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以clade7.2 H5N1 AIV A/Chicken/Liao Ning/S4092/2011(CK/LN/S4092)基因组为模板经RT-PCR扩增其HA及NA基因,并对HA基因进行分子修饰,去除与H5亚型AIV致病力有关的HA蛋白裂解位点处的多个连续碱性氨基酸,使其获得低致病性AIV的分子特征(即将-PQIEGRRRKR-突变为-PQRETR-),从而构建出clade7.2 H5N1亚型AIV疫苗候选株rPR8-LN/S4092,为动物免疫试验奠定了基础。

关键词： clade 7 2 H5N1流感病毒反向遗传操作疫苗候选株

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表达猪白细胞介素2重组腺病毒的构建

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中国预防兽医学报 2011年第4期33卷 313-315页

作者：张健陈艳乔传玲杨焕良唐续辛晓光陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为构建表达猪白细胞介素2(IL-2)的复制缺陷型重组腺病毒,本研究提取经刀豆球蛋白A(Con A)刺激体外培养的长白猪外周血淋巴细胞总RNA,利用RT-PCR扩增猪IL-2基因,并克隆于质粒pIRES2-EGFP中,将含有IL-2及EGFP的基因片段亚克隆到腺病毒的... 详细信息

为构建表达猪白细胞介素2(IL-2)的复制缺陷型重组腺病毒,本研究提取经刀豆球蛋白A(Con A)刺激体外培养的长白猪外周血淋巴细胞总RNA,利用RT-PCR扩增猪IL-2基因,并克隆于质粒pIRES2-EGFP中,将含有IL-2及EGFP的基因片段亚克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315中,构建重组腺病毒穿梭质粒pDC315-IL-2-EGFP。利用脂质体转染方法将pDC315-IL-2-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3Cre共转染HEK293细胞。根据腺病毒感染后形成的典型细胞病变及EGFP的荧光信号筛选重组腺病毒rAd-IL-2-EGFP。经western blot鉴定,结果表明获得了一株能够表达猪IL-2蛋白的重组腺病毒rAd-IL-2-EGFP。本研究为进一步研究猪IL-2在疫苗免疫中的增强作用及研制新型免疫增强剂奠定了基础。

关键词： IL-2 重组腺病毒基因表达

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禽流感病毒H5亚型HA基因在杆状病毒系统中的表达及生物学活性鉴定

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中国预防兽医学报 2012年第7期34卷 523-526页

作者：赵双成常晓飞田石柳金雄陈普成田国彬邓国华姜永萍陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为研究禽流感病毒(AIV)HA蛋白抗原活性,本研究将A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)的HA基因片段克隆于pFastBacHTA中,构建重组质粒pFastBacHTA-HA,转化至DH10Bac感受态细胞,构建重组杆粒,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。... 详细信息

为研究禽流感病毒(AIV)HA蛋白抗原活性,本研究将A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)的HA基因片段克隆于pFastBacHTA中,构建重组质粒pFastBacHTA-HA,转化至DH10Bac感受态细胞,构建重组杆粒,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。采用间接免疫荧光、western blot和血凝试验对所表达的蛋白进行抗原性和生物学活性分析。结果表明,表达重组蛋白分子量约为64 ku;IFA和western blot试验证明重组HA蛋白能够与H5亚型禽流感阳性血清特异结合,具有良好的抗原性;血凝试验和淋巴细胞增殖试验显示重组蛋白具有良好生物学活性。重组蛋白的正确表达为进一步研究HA基因功能活性和制备禽流感HA基因亚单位疫苗奠定了基础。

关键词：禽流感 HA基因杆状病毒

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一株类禽型H1N1亚型猪流感病毒的反向遗传系统的建立

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中国预防兽医学报 2013年第2期35卷 91-94页

作者：孟沙沙乔传玲陈艳杨焕良刘丽萍尹航辛晓光陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为建立H1N1亚型猪流感病毒A/swine/Jiangsu/40/2011(JS40)的反向遗传系统,本研究分别构建了JS40株8个基因节段的重组质粒,经转染293T和MDCK混合细胞,拯救出病毒R-JS40。序列测定结果表明,救获病毒与亲本病毒的核苷酸序列一致,无氨基酸变... 详细信息

为建立H1N1亚型猪流感病毒A/swine/Jiangsu/40/2011(JS40)的反向遗传系统,本研究分别构建了JS40株8个基因节段的重组质粒,经转染293T和MDCK混合细胞,拯救出病毒R-JS40。序列测定结果表明,救获病毒与亲本病毒的核苷酸序列一致,无氨基酸变异,可以稳定传代;抗原性未发生变化;对小鼠的致病性结果显示R-JS40与JS40对小鼠的组织嗜性以及在肺脏中复制的病毒滴度基本一致。以上结果表明R-JS40保持了亲本病毒JS40的生物学特性,该病毒反向遗传操作系统的建立,为进一步开展病毒的致病分子基础以及新型疫苗的研制提供有效的技术平台。

关键词：猪流感病毒类禽型 H1N1 反向遗传系统

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重组H5N3禽流感疫苗株在MDCK细胞中大规模增殖条件研究

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中国预防兽医学报 2007年第3期29卷 199-203页

作者：杨涛刘明张云刘春国王洪峰蔡雪辉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为研究通过反义遗传学技术构建的重组禽流感病毒rH5N3疫苗株在MDCK细胞中大规模增殖规律,确定最佳增殖条件,将rH5N3疫苗株分别在500mL和10L转瓶培养的MDCK细胞中进行增殖试验,检测不同接毒量以及接毒后不同时间里的血凝价,以确定病毒的... 详细信息

为研究通过反义遗传学技术构建的重组禽流感病毒rH5N3疫苗株在MDCK细胞中大规模增殖规律,确定最佳增殖条件,将rH5N3疫苗株分别在500mL和10L转瓶培养的MDCK细胞中进行增殖试验,检测不同接毒量以及接毒后不同时间里的血凝价,以确定病毒的增殖情况。结果表明,在确定的最佳病毒增殖条件下,该重组rH5N3疫苗株在500mL转瓶和10L转瓶中可获得大量增殖,病毒的最高血凝价均可达到1∶1024。rH5N3疫苗株可以在MDCK细胞中大规模增殖,操作方法简便,成本低廉,该方法为禽流感细胞培养型疫苗的大规模生产奠定了基础。

关键词：禽流感细胞培养 MDCK细胞

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H5亚型禽流感病毒A/Duck/Anhui/1/2006(Clade 2.3)密码子优化HA基因DNA疫苗的免疫保护效力研究

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中国预防兽医学报 2010年第2期32卷 116-120页

作者：王国俊熊杰李俊平曾显营田国彬李雁冰施建忠姜永萍陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为了进一步评价基于HA基因的DNA疫苗的开发应用前景,本研究将表达H5亚型禽流感水禽群代表株A/Duck/Anhui/1/2006(H5N1)[DKAH/1/06(H5N1)]HA基因的DNA疫苗pCAGGoAHHA的免疫保护效力进行了评估,以5μg、10μg、20μg、50μg和100μg剂量免... 详细信息

为了进一步评价基于HA基因的DNA疫苗的开发应用前景,本研究将表达H5亚型禽流感水禽群代表株A/Duck/Anhui/1/2006(H5N1)[DKAH/1/06(H5N1)]HA基因的DNA疫苗pCAGGoAHHA的免疫保护效力进行了评估,以5μg、10μg、20μg、50μg和100μg剂量免疫3周龄SPF鸡,首次免疫后3周再加强免疫一次,加强免疫后2周用106EID50的高致病力禽流感病毒(HPAIV)A/Duck/Fujian/31/2007(H5N1)[DKFJ/31/07(H5N1)]鼻腔途径进行攻毒,观察发病与死亡情况。分别于攻毒后第3d、5d、7d天采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测攻毒鸡排毒情况,同时检测免疫及攻毒后血清HI抗体、NT抗体的动态变化。结果,20μg、50μg、100μg组的pCAGGoAHHA均可对免疫鸡产生100%完全保护(不发病、不致死、不排毒),而5μg和10μg剂量组则可对免疫鸡分别形成25%和75%的保护。结果表明,H5亚型禽流感水禽群DNA疫苗质粒pCAGGoAHHA具有良好的免疫保护性,有望成为预防H5亚型HPAIV的技术储备候选疫苗。

关键词：禽流感 H5亚型水禽群 DNA疫苗保护效力

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