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低碳经济与高效养殖——第六次全国饲料营养学术研讨会暨动物营养学分会成立三十周年大会

作者：蔺丽娟王瑞琴周财源韩宗玺邵昱昊刘胜旺马得莹东北农业大学动科院动物营养研究所中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室

本研究采用RT-PCR法,从80日龄鹌鹑肺脏组织中扩增到一个新的基因,经测序表明,该基因的cDNA片段为207bp,由68个氨基酸残基组成,分子内含有禽β-防御素的特征性氨基酸结构,经同源性分析,该基因与鸡β-防御素10(AvBD10)的氨基酸序列同源性... 详细信息

本研究采用RT-PCR法,从80日龄鹌鹑肺脏组织中扩增到一个新的基因,经测序表明,该基因的cDNA片段为207bp,由68个氨基酸残基组成,分子内含有禽β-防御素的特征性氨基酸结构,经同源性分析,该基因与鸡β-防御素10(AvBD10)的氨基酸序列同源性最高,达83.8%。我们将其命名为鹌鹑AvBD10。<正>本研究采用RT-PCR法,从80日龄鹌鹑肺脏组织中扩增到一个新的基因,经测序表明,该基因的cDNA片段为207bp,由68个氨基酸残基组成,分子内含有禽β-防御素的特征性氨基酸结构,经同源性分析,该基因与鸡β-防御素10(AvBD10)的氨基酸序列同源性最高,达83.8%。我们将其命名为鹌鹑AvBD10。

关键词：鹌鹑AvBD10 重组蛋白抗菌活性

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猪瘟病毒(CSFV)NS2蛋白抑制MG132诱导的细胞凋亡作用

猪瘟病毒(CSFV)NS2蛋白抑制MG132诱导的细胞凋亡作用

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会

作者：唐青海张彦明郭抗抗何雷范丽仝刚代晨西北农林科技大学动物医学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

为研究猪瘟病毒(CSFV)NS2蛋白对宿主细胞凋亡的影响,本研分别将CSFV NS2基因和E2基因与GFP在猪血管内皮细胞中进行融合表达,以MG132为细胞凋亡诱导剂诱导细胞凋亡,并采用流式细胞仪和Hoechst33342染色方法检测细胞凋亡率。结果表明,MG13... 详细信息

为研究猪瘟病毒(CSFV)NS2蛋白对宿主细胞凋亡的影响,本研分别将CSFV NS2基因和E2基因与GFP在猪血管内皮细胞中进行融合表达,以MG132为细胞凋亡诱导剂诱导细胞凋亡,并采用流式细胞仪和Hoechst33342染色方法检测细胞凋亡率。结果表明,MG132能够诱导正常猪血管内皮细胞及稳定表达CSFV E2蛋白和GFP蛋白的细胞株的凋亡,而且,凋亡率呈MG132剂量依赖性增加。而稳定表达CSFV NS2蛋白的细胞株能够对抗MG132诱导的细胞凋亡。深入的研究还显示,表达CSFV NS2蛋白的细胞株能够对抗MG132对宿主细胞NF-κB活性的抑制作用,而且,表达NS2蛋白细胞中的抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量比照组细胞增加了48倍～51倍。该研究表明,CSFV NS2蛋白在抑制宿主细胞凋亡中发挥重要作用。

关键词：猪瘟病毒 NS2蛋白 MG132 凋亡 Bcl-2

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猪瘟病毒NS2蛋白的亚细胞定位及其对细胞增殖和周期的调节作用

猪瘟病毒NS2蛋白的亚细胞定位及其对细胞增殖和周期的调节作用

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会

作者：唐青海张彦明范丽仝刚何雷代晨西北农林科技大学动物医学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

为了探明猪瘟病毒(CSFV)NS2蛋白的亚细胞定位特征及其对宿主细胞增殖与周期的影响,本研究采用RT-PCR方法扩增CSFV NS2基因,采用激光共聚焦技术研究了CSFV NS2蛋白的亚细胞定位特征;采用MTS方法和流式细胞仪分析了细胞的增殖活性和细胞... 详细信息

为了探明猪瘟病毒(CSFV)NS2蛋白的亚细胞定位特征及其对宿主细胞增殖与周期的影响,本研究采用RT-PCR方法扩增CSFV NS2基因,采用激光共聚焦技术研究了CSFV NS2蛋白的亚细胞定位特征;采用MTS方法和流式细胞仪分析了细胞的增殖活性和细胞周期。结果表明:CSFV NS2蛋白质的分子质量约为53 ku,该蛋白定位于细胞内质网上并诱导宿主细胞内质网应激反应,激活核转录因子NF-κB,促进CyclinA蛋白被蛋白酶体所快速降解,进一步引起细胞周期阻滞于S期,最终抑制宿主细胞的增殖活性,但并不诱导细胞凋亡。本研究首次探明了CSFV NS2蛋白的亚细胞定位特点及该蛋白调节细胞周期与增殖的分子机制,为揭示CSFV致病的分子机制提供了科学依据。

关键词：猪瘟病毒 NS2蛋白亚细胞定位增殖周期

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猪细小病毒病国内流行状况以及防治策略

猪细小病毒病国内流行状况以及防治策略

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会

作者：蔺文成胡峰任梅崔玉东钱爱东崔尚金中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江八一农垦大学动物科技学院吉林农业大学

猪细小病毒病是由猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)引起的一种繁殖障碍疾病,与猪渗出性皮炎、断奶仔猪多系统衰弱综合征等疾病有关,对妊娠母猪与仔猪具有极大的威胁,常给养殖业造成巨大经济损失。

关键词：猪细小病毒病 PPV 混合感染新生仔猪生物技术学间接免疫荧光技术防治策略猪瘟病毒弱毒苗流行状况

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5种脑炎类人兽共患病病毒多重PCR检测方法的建立

5种脑炎类人兽共患病病毒多重PCR检测方法的建立

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会

作者：蔡绪禹康晓平刘洪李裕昌孙恩成王凌凤杨涛刘霓红步志高李文京杨银辉吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物/生物安全国家重点实验室中国动物疫病预防控制中心

本研究建立了能同时检测5种人兽共患脑炎类病毒的多重PCR方法,包括流行性乙型脑炎病毒(JEV)、森林脑炎病毒(TBEV)、东方马脑炎病毒(EEEV)、西方马脑炎病毒(WEEV)和基孔肯雅病毒(CHIKV)。根据GenBank登录的病毒基因组序列设计PCR特异引物... 详细信息

本研究建立了能同时检测5种人兽共患脑炎类病毒的多重PCR方法,包括流行性乙型脑炎病毒(JEV)、森林脑炎病毒(TBEV)、东方马脑炎病毒(EEEV)、西方马脑炎病毒(WEEV)和基孔肯雅病毒(CHIKV)。根据GenBank登录的病毒基因组序列设计PCR特异引物,通过优化引物组合及PCR反应条件,成功建立了针对

关键词：人兽共患病 PCR 检测方法

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H3N8型马流感血凝素核酸疫苗的初步研究

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中国医药生物技术 2010年第3期5卷 196-201页

作者：许莹郭巍王世霞黄文强张璐卢山周建华相文华黄祖瑚南京医科大学第一附属医院感染病科江苏省人民医院中美疫苗中心 210029 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室大动物病研究室哈尔滨150001 美国麻省大学医学院内科学系渥斯特01605

目的研发一种具有良好免疫原性的H3N8型马流感血凝素(hemagglutinin,HA)核酸疫苗。方法根据马A型流感病毒A/Equine/Xinjiang/3/08(H3N8)的HA蛋白序列,经密码子优化后化学合成能够表达相应蛋白的基因片段,并将该片段克隆到核酸疫苗载体pJ... 详细信息

目的研发一种具有良好免疫原性的H3N8型马流感血凝素(hemagglutinin,HA)核酸疫苗。方法根据马A型流感病毒A/Equine/Xinjiang/3/08(H3N8)的HA蛋白序列,经密码子优化后化学合成能够表达相应蛋白的基因片段,并将该片段克隆到核酸疫苗载体pJW4303中,构建带有天然信号肽的H3HA核酸疫苗,命名为H3HA/XJ3-08-wt;进一步对HA基因进行修饰,以人组织纤维蛋白酶原激活剂(human tissue plasminogen activator,tPA)取代H3HA天然信号肽,命名为H3HA/XJ3-08-tPA,或切除部分HA的基因片段使之只表达HA蛋白的胞外域,命名为H3HA/XJ3-08-dTM。用这3种重组质粒分别转染293T细胞,蛋白表达经蛋白质印迹检测得到确认。采用电转录法免疫新西兰白兔。ELISA方法检测免疫后兔血清中抗H3HA抗体滴度,血凝抑制实验(hemagglutination inhibition,HI)检测保护性抗体水平。结果 3种H3HA核酸疫苗均可在293T细胞中高效表达,并能够在新西兰白兔体内诱导产生特异性抗H3HA抗体,HI检测到不同水平的保护性抗体。其中以H3HA/XJ3-08-tPA的免疫原性最强。结论新构建的H3N8型马流感血凝素核酸疫苗具有良好的免疫原性,为此类疫苗的进一步研发奠定了基础。

关键词：流感病毒A型,H3N8亚型血凝素类疫苗,DNA

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表达O型口蹄疫病毒VP1基因的重组病毒BHV-1的构建与鉴定

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微生物学报 2009年第5期49卷 677-682页

作者：任宪刚薛飞朱远茂童光志王延辉冯军科祖立闯李娇史鸿飞高欲燃中国农业科学院哈尔滨兽医研究所大动物传染病研究室兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

【目的】为了构建表达口蹄疫病毒(O/China/99)VP1基因的牛疱疹病毒1型,将人工合成的口蹄疫病毒VP1基因插入到巨细胞病毒(CMV)启动子之下构建gE基因缺失转移载体。【方法】利用磷酸钙介导转染法将该转移载体与亲本病毒BHV-1/gE-/LacZ+的... 详细信息

【目的】为了构建表达口蹄疫病毒(O/China/99)VP1基因的牛疱疹病毒1型,将人工合成的口蹄疫病毒VP1基因插入到巨细胞病毒(CMV)启动子之下构建gE基因缺失转移载体。【方法】利用磷酸钙介导转染法将该转移载体与亲本病毒BHV-1/gE-/LacZ+的基因组DNA共转染牛鼻甲细胞后收获增殖的病毒。通过筛选白色病毒蚀斑,得到重组病毒BHV-1/gE-/VP1。【结果】PCR检测结果表明VP1基因已经插入到了重组病毒BHV-1/gE-的基因组中,间接免疫荧光试验和Western blot证实了BHV-1/gE-/VP1中的VP1基因在感染的细胞中获得了表达。【结论】本研究成功地构建了表达口蹄疫病毒VP1基因的重组病毒BHV-1/gE-/VP1,为研制口蹄疫及其他重要牛传染病的BHV-1病毒载体疫苗奠定了基础。

关键词：口蹄疫病毒 VP1基因牛疱疹病毒1型磷酸钙介导转染

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猪肺炎支原体p97 C末端基因重组腺病毒的构建及其免疫效果

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微生物学报 2009年第4期49卷 465-470页

作者：陈超李媛郭丹曹培丽张美晶姜海芳乔祖建王亮辛九庆中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室哈尔滨150001

【目的】构建携猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)黏附因子p97C末端基因的重组腺病毒并研究其诱导小鼠产生的免疫反应,为研制新型Mhp疫苗奠定基础。【方法】从Mhp基因组中扩增p97C末端基因,并将其克隆到穿梭载体pShuttle-CMV... 详细信息

【目的】构建携猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)黏附因子p97C末端基因的重组腺病毒并研究其诱导小鼠产生的免疫反应,为研制新型Mhp疫苗奠定基础。【方法】从Mhp基因组中扩增p97C末端基因,并将其克隆到穿梭载体pShuttle-CMV中,该重组穿梭质粒经PmeI线性化后电转化到BJ5183-AD-1细胞中进行同源重组获得重组腺病毒DNA,纯化后的重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切线性化后转染AD293细胞以获得重组腺病毒。对该重组腺病毒进行RT-PCR、间接免疫荧光和Western blot鉴定,用氯化铯密度梯度离心纯化试剂盒对该重组腺病毒进行纯化并确定其滴度。重组病毒经肌注、滴鼻两种途径免疫小鼠并从体液免疫、粘膜免疫和细胞免疫3个方面对其免疫结果进行分析。【结果】PacⅠ酶切证实同源重组成功,RT-PCR、间接免疫荧光和Western blot鉴定证明了该重组腺病毒成功转录并表达了p97C末端蛋白,将该重组病毒进行纯化后滴度可达到5×1011TCID50/mL,重组病毒可诱导小鼠产生血清、肺匀浆液特异性IgG,通过滴鼻免疫方式还可诱导肺匀浆液SIgA的产生,但不能诱导特异的淋巴细胞增值。【结论】成功构建了表达p97末端基因的重组腺病毒,该病毒可诱发小鼠产生特异的的体液免疫和粘膜免疫,但不产生细胞免疫应答。

关键词：猪肺炎支原体猪支原体肺炎 p97基因重组腺病毒免疫效果

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O型泛亚谱系口蹄疫病毒cDNA感染性克隆的建立

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中国预防兽医学报 2009年第1期31卷 1-5,15页

作者：杨德成涂亚斌王海伟周国辉于力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室黑龙江哈尔滨150001

本研究采用RT-PCR技术将O型口蹄疫病毒(FMDV)O/YS/CHA/05株全长基因组分4个cDNA片段进行克隆、拼接,构建了具有感染性的FMDV cDNA克隆pOKT7-O/YS/CHA/05。将线性化的pOKT7-O/YS/CHA/05在细胞外转录获得的病毒RNA转染BHK-21细胞,经培养... 详细信息

本研究采用RT-PCR技术将O型口蹄疫病毒(FMDV)O/YS/CHA/05株全长基因组分4个cDNA片段进行克隆、拼接,构建了具有感染性的FMDV cDNA克隆pOKT7-O/YS/CHA/05。将线性化的pOKT7-O/YS/CHA/05在细胞外转录获得的病毒RNA转染BHK-21细胞,经培养可见典型的细胞病变(CPE)。同时,将线性化的pOKT7-O/YS/CHA/05与含有编码T7 RNA聚合酶的真核表达重组质粒共转染BHK-21细胞,同样也观察到典型的CPE。对拯救的病毒进行RT-PCR扩增、酶切和序列分析鉴定表明,拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记,即在病毒核酸的3510位人工消除了XbaⅠ酶切位点。免疫电镜观察和间接免疫荧光试验进一步表明,拯救出了FMDV。病毒生长比较试验表明,拯救病毒与亲本病毒具有相似的增殖特性。本研究构建了O型口蹄疫病毒的感染性克隆并获得了拯救病毒,为深入研究FMDV的致病机理以及开发新型疫苗提供了有效的反向遗传操作平台。

关键词：口蹄疫病毒全长cDNA 转录和转染病毒拯救

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猪肺炎霉形体p52基因重组腺病毒的构建及其免疫特性

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中国兽医科学 2009年第8期39卷 712-717页

作者：曹培丽李媛陈超郭丹王亮乔祖建辛九庆中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

为构建携带猪肺炎霉形体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)p52基因的重组腺病毒,从Mhp J株扩增p52基因,克隆到穿梭载体pShuttle-CMV中,经PmeⅠ线性化后,电转化入BJ5183菌内,与其含有的骨架载体pAdEasy-1同源重组,再与脂质体混合转染AD-29... 详细信息

为构建携带猪肺炎霉形体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)p52基因的重组腺病毒,从Mhp J株扩增p52基因,克隆到穿梭载体pShuttle-CMV中,经PmeⅠ线性化后,电转化入BJ5183菌内,与其含有的骨架载体pAdEasy-1同源重组,再与脂质体混合转染AD-293细胞,包装成完整的腺病毒,经RT-PCR、间接免疫荧光鉴定后扩增,收集病毒液,免疫BALB/c小鼠,并分析了体液免疫、黏膜免疫和细胞免疫效果。结果表明,重组质粒pShuttle-CMV-P52插入片段为1 202 bp;同源重组成功;重组腺病毒可以正确表达目的蛋白,效价达1×106TCID50/mL。重组病毒经肌肉注射和滴鼻均可诱导小鼠产生血清和肺匀浆液特异性IgG、SIgA,但不能诱导特异的淋巴细胞增殖。证实,成功构建了表达p52基因的重组腺病毒,该病毒可诱发小鼠产生特异的体液免疫和黏膜免疫,但不产生细胞免疫应答。

关键词：猪肺炎霉形体 p52基因重组腺病毒免疫应答

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