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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十三次学术研讨会

作者：倪宏波王聃赫明雷刘思国杜艳芬林靖凯刘慧芳王春来司薇常月红彭玮中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨 150001 黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆 163319 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨 150001

目的：构建用于酵母双杂交系统的诱饵质粒载体pGBKT7-omp(胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白)，并检测其是否具有自身激活及毒性作用。方法：从胸膜肺炎放线杆菌提取基因组DNA，用PCR方法获得omp，克隆pGBKT7载体上，酶切鉴定及序列分析，... 详细信息

目的：构建用于酵母双杂交系统的诱饵质粒载体pGBKT7-omp(胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白)，并检测其是否具有自身激活及毒性作用。方法：从胸膜肺炎放线杆菌提取基因组DNA，用PCR方法获得omp，克隆pGBKT7载体上，酶切鉴定及序列分析，并检测pGBKT7-omp在酵母双杂交系统中的自激活和毒性作用。结果：实验成功构建了诱饵质粒载体pGBKT7-omp，并证明其在酵母双杂交系统中无自激活及毒性作用。结论：PGBKT7-omp可压用在酵母双杂交系统中，寻找猪肺泡上皮细胞cDNA文库中与omp相互作用的蛋白质，为筛选胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白与肺泡上皮细胞相互作用的蛋白奠定了重要基础。

关键词：猪传染性胸膜肺炎胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白诱饵质粒自激活作用毒性检测

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猪细小病毒分离株感染初孕母猪的病毒组织分布和病理学观察

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养猪 2009年第3期 65-68页

作者：苗岚飞胡守萍张超范张卓崔尚金中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学学院哈尔滨150030

本研究旨在研究猪细小病毒分离株感染初孕母猪后母猪和胎猪的病毒组织分布和组织病理学变化情况。试验选用妊娠35d的初孕母猪接种PPV-BQ株第15代细胞毒,以接种RPMI1640的母猪作为对照。攻毒40d后剖杀,采集母猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏... 详细信息

本研究旨在研究猪细小病毒分离株感染初孕母猪后母猪和胎猪的病毒组织分布和组织病理学变化情况。试验选用妊娠35d的初孕母猪接种PPV-BQ株第15代细胞毒,以接种RPMI1640的母猪作为对照。攻毒40d后剖杀,采集母猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、扁桃体、子宫内膜和腹部淋巴结,胎猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑和小肠,进行组织病毒载量测定和组织病理学检测。实时定量PCR检测结果显示,攻毒组母猪的心脏、脾脏、肺脏、肾脏和子宫内膜存在病毒复制,子宫内病毒含量最高;胎猪的心脏、脾脏、肺脏中存在病毒复制。对照组脏器中无病毒复制。病理切片结果显示,攻毒组母猪肺脏出现细支气管性肺炎,脾脏出现淋巴细胞减少,心脏、肝脏、肾脏、扁桃体、子宫内膜和腹部淋巴结未见明显的组织病理学变化;胎猪的脏器未见明显的病理损伤。对照组未发现组织病理学变化。

关键词：猪细小病毒病毒组织分布组织病理学变化

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放线杆菌外膜蛋白酵母双杂交诱饵质粒的构建及自激活与毒性检测

放线杆菌外膜蛋白酵母双杂交诱饵质粒的构建及自激活与毒性检测

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中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会

作者：倪宏波刘思国杜艳芬林靖凯刘慧芳王春来司薇常月红彭玮王聃赫明雷中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江八一农垦大学动物科技学院

目的:构建用于酵母双杂交系统的诱饵质粒载体pGBKT7-omp(胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白),并检测其是否具有自身激活及毒性作用.方法:从胸膜肺炎放线杆菌提取基因组DNA,用PCR方法获得omp,克隆于pGBKT7载体上,酶切鉴定及序列分析,并检测pGBKT7... 详细信息

目的:构建用于酵母双杂交系统的诱饵质粒载体pGBKT7-omp(胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白),并检测其是否具有自身激活及毒性作用.方法:从胸膜肺炎放线杆菌提取基因组DNA,用PCR方法获得omp,克隆于pGBKT7载体上,酶切鉴定及序列分析,并检测pGBKT7-omp在酵母双杂交系统中的自激活和毒性作用.结果:实验成功构建了诱饵质粒载体pGBKT7-omp,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活及毒性作用.结论:pGBKT7-omp可应用在酵母双杂交系统中,寻找猪肺泡上皮细胞cDNA文库中与omp相互作用的蛋白质,为筛选胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白与肺泡上皮细胞相互作用的蛋白奠定了重要基础。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白诱饵质粒自激活作用毒性作用

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哈尔滨市鲜肉中单核细胞增生性李斯特菌的分离鉴定及耐药性分析

哈尔滨市鲜肉中单核细胞增生性李斯特菌的分离鉴定及耐药性分析

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中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会

作者：尹录杜艳芬赫明雷司微刘慧芳王春来彭玮王聃李继昌邵美丽刘思国东北农业大学哈尔滨中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室延边大学东北农业大学

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)是一种人畜共患病原菌,主要能引起人与动物的脑炎、菌血症、流产、无败血症性单核细胞增多症等,尤其是免疫力低下者、婴幼儿、老年人、孕妇等易受感染而发病,是引起食物中毒的重要病... 详细信息

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)是一种人畜共患病原菌,主要能引起人与动物的脑炎、菌血症、流产、无败血症性单核细胞增多症等,尤其是免疫力低下者、婴幼儿、老年人、孕妇等易受感染而发病,是引起食物中毒的重要病原菌。为了解哈尔滨市单核细胞增生性李斯特菌的污染状况及耐药状况,在哈尔滨市市场随机采集158份鲜肉,采用显色培养基分离,API试剂条和PCR鉴定等方法对样品中的单核细胞增生性李斯特菌进行分离鉴定,并通过Kirby-Barer法测定分离菌株对24种抗生素的耐药性。结果从鲜肉中共分离到单核细胞增生性李斯特菌23株,检出率为14.56%,其中鲜猪肉检出率最高,这20.00%(14/70):23株分离菌株中耐药菌株为22株,耐药率高达95.65%.这表明哈尔滨市鲜肉中存在一定程度的单核细胞增生性李斯特菌污染,并且分离菌株存在较严重的耐药现象.应加强控制动物饲料亚治疗抗生素的使用并严格遵守休药期,防止耐药菌株产生进而控制食源性疾病的发生.

关键词：哈尔滨鲜肉单核细胞增生性李斯特菌分离鉴定耐药性

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马传染性贫血病毒N-连接糖基化回复突变的感染性克隆构建

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微生物学报 2008年第3期48卷 287-292页

作者：韩秀娥全滟平高旭相文华周建华中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室大动物病室哈尔滨150001

根据马传贫强毒株EIAV-L和疫苗株EIAV-FDD表面蛋白gp90的N-连接糖基化的变化规律,采用PCR定点突变的方法,对全长感染性克隆pLGFD3-8上的N-连接糖基化的差异区域进行改造后,构建成含有3个N-连接糖基化位点突变的感染性克隆pLGN191N236N24... 详细信息

根据马传贫强毒株EIAV-L和疫苗株EIAV-FDD表面蛋白gp90的N-连接糖基化的变化规律,采用PCR定点突变的方法,对全长感染性克隆pLGFD3-8上的N-连接糖基化的差异区域进行改造后,构建成含有3个N-连接糖基化位点突变的感染性克隆pLGN191N236N246。将其转染驴胎皮肤细胞(FDD),通过用逆转录酶活性、间接免疫荧光和RT-PCR方法检测而确定其感染性。结果表明,在FDD细胞中盲传三代后,在细胞培养物中可检测到逆转录酶活性,RT-PCR和间接免疫荧光检测均呈阳性,电镜下见到典型的EIAV颗粒。这一结果可能对N-连接糖基化在我国马传贫弱毒疫苗致弱机理的作用研究而奠定良好的基础。

关键词：马传染性贫血病毒 N-连接糖基化定点突变感染性克隆

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牛传染性鼻气管炎病毒重组gD蛋白间接ELISA方法的建立及应用

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中国预防兽医学报 2008年第7期30卷 537-543页

作者：祖立闯朱远茂王延辉辛九庆李娇任宪刚冯军科薛飞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物传染病研究室

用大肠杆菌表达的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)重组gD蛋白纯化后作为包被抗原,建立了检测牛传染性鼻气管炎病毒抗体的间接ELISA方法。交叉反应试验表明,该重组抗原与其它常见的5种牛病阳性血清不发生交叉反应;阻断反应试验表明,IBRV病毒... 详细信息

用大肠杆菌表达的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)重组gD蛋白纯化后作为包被抗原,建立了检测牛传染性鼻气管炎病毒抗体的间接ELISA方法。交叉反应试验表明,该重组抗原与其它常见的5种牛病阳性血清不发生交叉反应;阻断反应试验表明,IBRV病毒悬液能在很大程度上阻断重组抗原与阳性血清的反应,而对阴性血清没有明显影响。在重复性试验中,批内重复的变异系数小于5%,批间重复的变异系数小于15%。与中和试验相比较,符合率、敏感性和特异性分别为84.1%、85.0%和83.4%。应用该诊断方法和本实验室已建立的以IBRV全病毒作为包被抗原的ELISA诊断方法,同时检测了采集于国内11个省份的2012份血清样本,IBRVgD-ELISA检测的平均阳性率为46.0%(926/2012),而且相对于IBRV全病毒ELISA诊断方法的符合率、敏感性和特异性分别为91.9%、94.2%和90.2%。本研究所建立的IBRVgD-ELISA具有良好的敏感性和特异性,为国内IBR流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。

关键词：牛传染性鼻气管炎重组gD蛋白间接ELISA

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牛呼吸道合胞体病毒G蛋白的截短表达与鉴定

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中国生物工程杂志 2008年第12期28卷 24-29页

作者：冯军科薛飞李娇祖立闯朱远茂任宪刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物传染病研究室哈尔滨150001

将牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)G基因截短成2个片段G1和G2,然后以人工合成的牛呼吸道合胞体病毒G基因为模板,利用PCR分别扩增G1和G2基因片段,其大小分别为570 bp和308 bp。将目的片段定向克隆到pET30a... 详细信息

将牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)G基因截短成2个片段G1和G2,然后以人工合成的牛呼吸道合胞体病毒G基因为模板,利用PCR分别扩增G1和G2基因片段,其大小分别为570 bp和308 bp。将目的片段定向克隆到pET30a表达载体,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导后G1和G2基因片段均获得了表达,且为可溶性表达。利用Ni柱亲和层析法在非变性条件下纯化重组蛋白,经免疫印迹试验鉴定证明纯化的重组蛋白G1具有良好的抗原性和特异性,而重组蛋白G2无反应性。应用纯化的重组蛋白G1进行的间接ELISA与免疫印迹试验在国内牛血清中检测到了BRSV血清抗体。对建立BRSVG蛋白的血清学诊断方法和为开展BRSVG蛋白生物学功能的研究奠定了基础。

关键词：牛呼吸道合胞体病毒 G基因克隆表达

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牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

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中国预防兽医学报 2008年第10期30卷 747-750,754页

作者：马文戈于力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室黑龙江哈尔滨150001

从采集于黑龙江、天津的病牛肺组织中分离到2株病原菌,经菌落形态学观察、培养特性、生化反应和小鼠毒力试验,初步鉴定为多杀性巴氏杆菌,分别命名为Pm-HLJ和Pm-TJ。参考多杀性巴氏杆菌种特异性基因kmt1和荚膜血清型特异性基因hyaD-hyaC... 详细信息

从采集于黑龙江、天津的病牛肺组织中分离到2株病原菌,经菌落形态学观察、培养特性、生化反应和小鼠毒力试验,初步鉴定为多杀性巴氏杆菌,分别命名为Pm-HLJ和Pm-TJ。参考多杀性巴氏杆菌种特异性基因kmt1和荚膜血清型特异性基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ和fcbD,合成引物,通过多重PCR扩增2株菌的种特异性基因和荚膜血清型特异性基因。选取Pm-HLJ的目标PCR产物进行克隆、序列测定、Blast搜索同源序列并且比较分析。结果显示,Pm-HLJ的kmt1基因片段全长460bp,与GenBank中各血清型kmt1基因同源性均在96.6%以上;荚膜血清型A菌株特异性基因同源性为99.9%;而与其他荚膜血清型B、D、E、F的型特异性基因的同源性均低于50%。由此确认,分离的2株多杀性巴氏杆菌均为荚膜血清A型,这是我国A型多杀性巴氏杆菌引发牛出血性败血症的首例报道。

关键词：多杀性巴氏杆菌荚膜血清A型分离鉴定

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马传染性贫血病毒LTR在驴胎皮肤细胞中的基因进化及启动子活性比较

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中国预防兽医学报 2008年第7期30卷 510-514页

作者：全滟平沈楠郭巍赵立平周建华沈荣显相文华中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室黑龙江哈尔滨150001

将EIAV驴白细胞弱毒疫苗株在驴胎皮肤细胞中连续传代,分别提取第13代、18代、21代、23代、26代病毒培养物的前病毒DNA,以LTR特异性引物PCR扩增前病毒LTR,并进行克隆及测序分析。与本实验室已测定的驴白细胞毒株LTR的序列比较发现,驴胎... 详细信息

将EIAV驴白细胞弱毒疫苗株在驴胎皮肤细胞中连续传代,分别提取第13代、18代、21代、23代、26代病毒培养物的前病毒DNA,以LTR特异性引物PCR扩增前病毒LTR,并进行克隆及测序分析。与本实验室已测定的驴白细胞毒株LTR的序列比较发现,驴胎皮肤细胞毒株LTR的U3负调节区出现大段的插入、点突变、缺失,U3增强子区变异较小。将LTR片段插入到pCAT-basic载体CAT报告基因前,转染驴胎皮肤细胞,通过检测CAT表达量来评价LTR的启动子活性。驴胎皮肤细胞毒株LTR的启动子活性随着病毒传代次数的增加而逐渐增强,而驴白细胞弱毒株LTR的启动子活性很低。

关键词：马传染性贫血病毒 LTR 基因进化启动子活性

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犊牛腹泻粪样中牛呼肠孤病毒的分离鉴定

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中国预防兽医学报 2008年第9期30卷 711-715页

作者：常继涛李鑫张亚科于力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室黑龙江哈尔滨150001

通过在培养液中添加胰蛋白酶的方法,用MA104细胞从犊牛腹泻粪样中分离并鉴定了1株能稳定产生细胞病变(CPE)的牛呼肠孤病毒,命名为B-19株。RNA聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳可见呼肠孤病毒典型的10条核酸节段,呈3∶3∶4排列。电镜检测结果显... 详细信息

通过在培养液中添加胰蛋白酶的方法,用MA104细胞从犊牛腹泻粪样中分离并鉴定了1株能稳定产生细胞病变(CPE)的牛呼肠孤病毒,命名为B-19株。RNA聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳可见呼肠孤病毒典型的10条核酸节段,呈3∶3∶4排列。电镜检测结果显示,病毒粒子呈典型呼肠孤病毒粒子形态,直径约70nm;病毒L1基因保守区段RT-PCR检测及序列分析表明,扩增出的440bp目的片段符合预期大小,而且其核苷酸序列与GenBank参考毒株L1基因序列具有较高同源性;S1基因序列分析表明,B-19株属于呼肠孤病毒血清1型(ST1)。

关键词：牛呼肠孤病毒分离鉴定

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