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2012年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会学术研讨会

作者：秦永丽孙恩成耿宏伟徐青元杨涛赵晶王文世魏鹏冯瑜菲李俊平李文京吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室中国动物疫病预防控制中心

蓝舌病(Bluetongue,BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的,主要由库蠓传播的反刍动物烈性非接触性传染病。BT血清型众多,目前已发现24个血清型,最近又相继分离到BTV25和26型。BTV基因组由10个线性双链... 详细信息

蓝舌病(Bluetongue,BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的,主要由库蠓传播的反刍动物烈性非接触性传染病。BT血清型众多,目前已发现24个血清型,最近又相继分离到BTV25和26型。BTV基因组由10个线性双链RNA片段组成,共编码11种蛋白,七种结构蛋白(VP1-VP7)和四种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3/NS3a和NS4)。其

关键词：抗原表位 VP2 单克隆抗体制备

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蓝舌病病毒VP7蛋白单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

蓝舌病病毒VP7蛋白单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

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2012年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会学术研讨会

作者：王文世孙恩成刘霓红杨涛徐青元秦永丽赵晶冯瑜菲魏鹏张翠云李文京吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室中国动物疫病预防控制中心

研究目的:蓝舌病(Bluetongue,BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒引起,由库蠓等昆虫传播的反刍动物非接触性传染病;主要侵害绵羊、山羊,牛为隐性感染。由于发病绵羊持续高热、消瘦、口鼻和胃粘膜出现溃疡损伤、口腔粘膜及舌头发蓝... 详细信息

研究目的:蓝舌病(Bluetongue,BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒引起,由库蠓等昆虫传播的反刍动物非接触性传染病;主要侵害绵羊、山羊,牛为隐性感染。由于发病绵羊持续高热、消瘦、口鼻和胃粘膜出现溃疡损伤、口腔粘膜及舌头发蓝,因此命名为蓝舌病。蓝舌病VP7蛋白位于病毒颗粒内衣壳的最外侧,约占病毒成分的36%,是主要的血清群特异性抗原,因此获得针对VP7蛋白的单克隆抗体,就为蓝舌病免疫学检测方法的建立奠定了基础。

关键词：单克隆抗体 BTV 群特异性抗原 VP7 生物学特性杂交瘤细胞株特异性反应

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蓝舌病病毒VP7蛋白单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

蓝舌病病毒VP7蛋白单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第九次学术研讨会

作者：王文世张翠云李文京吴东来孙恩成刘霓红杨涛徐青元秦永丽赵晶冯瑜菲魏鹏中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／农业部兽医公共卫生重点开放实验室，哈尔滨 150001 中国动物疫病预防控制中心，北京 100125

为建立BTV特异性诊断方法和研究VP7蛋白功能，以目前国内流行的优势血清型病毒BTVl6免疫Balb／c鼠，取免疫后的小鼠脾淋巴细胞与SP2／0细胞融合，同时用BTVl6为包被抗原，建立间接ELISA方法进行筛选，并用有限稀释法进行克隆，最终获得... 详细信息

为建立BTV特异性诊断方法和研究VP7蛋白功能，以目前国内流行的优势血清型病毒BTVl6免疫Balb／c鼠，取免疫后的小鼠脾淋巴细胞与SP2／0细胞融合，同时用BTVl6为包被抗原，建立间接ELISA方法进行筛选，并用有限稀释法进行克隆，最终获得两株稳定分泌BTV单克隆抗体的杂交瘤细胞株(IB7、IVA4)。将本实验室保存分别编码BTVl6十个基因片段的真核重组pCI-neo质粒分别转染BHK-21细胞，进行免疫荧光鉴定，免疫荧光和Western Blot结果均显示两株单克隆抗体均与BTVl6 VP7蛋白发生特异性反应。间接免疫荧光(IFA)结果显示，两株单克隆抗体与BTV 24个血清型呈不同反应谱系。

关键词：蓝舌病病毒 VP7蛋白单克隆抗体抗体制备生物学特性

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H5N1亚型禽流感灭活疫苗种毒Re-6株的生物学特性及免疫原性研究

H5N1亚型禽流感灭活疫苗种毒Re-6株的生物学特性及免疫原性研究

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第三届(2012)中国黄羽肉鸡行业发展大会

作者：曾显营 ZENG Xianying TIAN Guobin 田国彬 FENG Huapeng 冯华朋 DENG Guohua 邓国华 SHI Jianzhong 施建忠 ZHANG Pantao 张盼涛 SU Wen 苏文 YANG Jing 杨婧 LIU Jingli 刘景利徐佳 XU Jia CHEN Hualan 陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室国家禽流感参考实验室哈尔滨 150001 State Key Lab of Veterinary Biotechnology/Animal Influenza Laboratory of the Ministry of Agriculture Harbin Weike Biotechnologv Development Company Harbin 150001 哈尔滨维科生物技术开发公司哈尔滨 150001

本研究对经反向遗传方法构建的重组禽流感H5N1亚型变灭活疫苗种毒Re—6株的生物学特性及免疫效力进行研究.将Re—6株接种SPF鸡胚后37℃培养72h,鸡胚存活,且无病变,HA滴度达210;以0.1ml(106.0EID50/0.1ml)的剂量鼻腔感染4周龄SPF鸡10天... 详细信息

本研究对经反向遗传方法构建的重组禽流感H5N1亚型变灭活疫苗种毒Re—6株的生物学特性及免疫效力进行研究.将Re—6株接种SPF鸡胚后37℃培养72h,鸡胚存活,且无病变,HA滴度达210;以0.1ml(106.0EID50/0.1ml)的剂量鼻腔感染4周龄SPF鸡10天后血清HI抗体转阳,无任何症状,也不排毒;SPF鸡静脉致病指数(IVPI)为0;以Re—6重组株为种毒制备灭活疫苗,免疫SPF鸡和SPF鸭后,3周时平均HI抗体效价达8.310g2和8.4 log2;免疫鸡和免疫鸭对亲本强毒株GD1322攻击提供完全保护.以上结果表明禽流感灭活疫苗种毒Re—6株对SPF鸡胚和SPF鸡无致病性、适合鸡胚增殖、抗原针对性强,且该毒株制备的灭活疫苗具有良好的免疫效力,是理想的疫苗种毒株.

关键词：家禽亚型禽流感灭活疫苗生物学特性免疫原性

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抗蓝舌病病毒VP6和VP7蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

抗蓝舌病病毒VP6和VP7蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

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2012年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会学术研讨会

作者：魏鹏孙恩成刘霓红杨涛徐青元秦永丽赵晶冯瑜菲王文世张翠云吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室东北农业大学动物医学学院湖南农业大学动物医学学院

为制备针对蓝舌病病毒(BTV)的单克隆抗体(MAb),本研究利用血清型1型蓝舌病病毒(BTV1)免疫BALB/c鼠,4次免疫后取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0进行融合,并用BTV1包被ELISA板,通过间接ELISA方法筛选出3株稳定分泌抗BTV1的MAb的杂交瘤细胞株(2B10... 详细信息

为制备针对蓝舌病病毒(BTV)的单克隆抗体(MAb),本研究利用血清型1型蓝舌病病毒(BTV1)免疫BALB/c鼠,4次免疫后取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0进行融合,并用BTV1包被ELISA板,通过间接ELISA方法筛选出3株稳定分泌抗BTV1的MAb的杂交瘤细胞株(2B10、3D4、4H8)。利用表达BTV1主要蛋白的真核表达重组质粒转染BHK-21后,对所制备的杂交瘤细胞株上清进行间接免疫荧光(IFA)以及Western blot鉴定,结果显示:2B10和4H8与VP7蛋白反应,而3D4与VP6蛋白反应。进一步利用IFA对3株MAb的反应特异性进行鉴定,结果表明3株MAb与24个血清型的BTV均可反应。本实验室制备所得的MAb为建立BTV免疫学检测方法和相关病毒蛋白的功能研究奠定了基础。

关键词：蓝舌病病毒单克隆抗体 VP6蛋白 VP7蛋白

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西尼罗病毒E蛋白重组腺病毒的构建

西尼罗病毒E蛋白重组腺病毒的构建

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2012年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会学术研讨会

作者：张翠云孙恩成刘霓红杨涛徐青元赵晶秦永丽冯瑜菲魏鹏王文世吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室湖南农业大学动物医学学院东北农业大学动物医学学院

西尼罗热是由西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)引起的,通过蚊子传播的一种急性人畜共患传染病。此病毒可对人和动物构成严重威胁,并可导致严重的公共卫生问题。因此迫切需要研制一种高效、安全、廉价的新型疫苗来控制该病的流行。腺病... 详细信息

西尼罗热是由西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)引起的,通过蚊子传播的一种急性人畜共患传染病。此病毒可对人和动物构成严重威胁,并可导致严重的公共卫生问题。因此迫切需要研制一种高效、安全、廉价的新型疫苗来控制该病的流行。腺病毒载体以其安全高效,宿主范围广的特点,成为一种广泛应用的病毒载体,近年来在活载体疫苗的研制中得到了广泛的应用,并已获得良好的免疫效果。WNV膜蛋白(Envelope,E)是WNV主要的抗原结构蛋白,能诱导机体产生中和抗体,是决定病毒毒力的主要因素。为构建表达西尼罗病毒E蛋白的重组腺病毒,本实验将WNV-E基因克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,PmeⅠ酶切线性化后转化到含有人5型缺陷腺病毒骨架的BJ5183感受态细胞中,通过细菌内同源重组构建含有WNV-E基因pAD-WNV-E质粒的重组腺病毒,经PacⅠ酶切线性化后通过脂质体介导转染入人胚肾细胞AD-293细胞,获得重组腺病毒rpAD-WNV-E经PCR、Western blot及IFA鉴定,WNV-E蛋白在AD-293细胞中成功表达。经病毒滴度测定、一步生长曲线等实验发现该重组腺病毒与野生型腺病毒复制能力相近,但病毒滴度略低。本实验成功构建了表达WNV-E蛋白的重组腺病毒,可为后续研制WNV-E重组腺病毒疫苗奠定基础。

关键词：西尼罗病毒 E蛋白重组腺病毒

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抗猪甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备与特性分析

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畜牧兽医学报 2011年第5期42卷 711-716页

作者：张健陈艳乔传玲杨焕良唐续辛晓光陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室哈尔滨150001

本研究旨在制备猪甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)蛋白的特异性单克隆抗体。采用RT-PCR方法扩增猪甲型H1N1流感病毒的HA基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGS上,获得重组质粒pCAGGS-HA,转染293T细胞,通过间接免疫荧光(IFA)检测表明HA蛋白在293... 详细信息

本研究旨在制备猪甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)蛋白的特异性单克隆抗体。采用RT-PCR方法扩增猪甲型H1N1流感病毒的HA基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGS上,获得重组质粒pCAGGS-HA,转染293T细胞,通过间接免疫荧光(IFA)检测表明HA蛋白在293T细胞中得到表达。将pCAGGS-HA以100μg.只-1剂量免疫5周龄BALB/c小鼠,获得4株稳定分泌抗HA蛋白单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株,分别命名为11G7、3C10、3G3和2B11。其中11G7诱导小鼠产生的腹水HI效价为14log2,中和效价为1∶8 192,HI试验结果进一步表明11G7只与甲型H1N1流感病毒发生反应,而不与其他H1N1、H1N2、H3N2、H5N1及H9N2亚型流感病毒反应。该MAb的制备将为建立猪甲型H1N1流感病毒与传统亚型SIV的鉴别诊断方法奠定基础。

关键词：甲型H1N1猪流感病毒 HA MAb

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表达猪白细胞介素2重组腺病毒的构建

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中国预防兽医学报 2011年第4期33卷 313-315页

作者：张健陈艳乔传玲杨焕良唐续辛晓光陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为构建表达猪白细胞介素2(IL-2)的复制缺陷型重组腺病毒,本研究提取经刀豆球蛋白A(Con A)刺激体外培养的长白猪外周血淋巴细胞总RNA,利用RT-PCR扩增猪IL-2基因,并克隆于质粒pIRES2-EGFP中,将含有IL-2及EGFP的基因片段亚克隆到腺病毒的... 详细信息

为构建表达猪白细胞介素2(IL-2)的复制缺陷型重组腺病毒,本研究提取经刀豆球蛋白A(Con A)刺激体外培养的长白猪外周血淋巴细胞总RNA,利用RT-PCR扩增猪IL-2基因,并克隆于质粒pIRES2-EGFP中,将含有IL-2及EGFP的基因片段亚克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315中,构建重组腺病毒穿梭质粒pDC315-IL-2-EGFP。利用脂质体转染方法将pDC315-IL-2-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3Cre共转染HEK293细胞。根据腺病毒感染后形成的典型细胞病变及EGFP的荧光信号筛选重组腺病毒rAd-IL-2-EGFP。经western blot鉴定,结果表明获得了一株能够表达猪IL-2蛋白的重组腺病毒rAd-IL-2-EGFP。本研究为进一步研究猪IL-2在疫苗免疫中的增强作用及研制新型免疫增强剂奠定了基础。

关键词： IL-2 重组腺病毒基因表达

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甲型H1N1流感病毒株的分离鉴定以及PR8株的相关基因对重组病毒增殖能力的影响

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中国预防兽医学报 2011年第7期33卷 517-520页

作者：李建辉刘春国张云刘明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为分离流感病毒,本研究将疑似甲型流感患者的咽喉拭子接种SPF鸡胚尿囊腔,经检测收获的鸡胚尿囊液具有血凝活性。采用流感病毒通用引物进行PCR扩增出8个基因节段,经测序与GenBank中登录的序列比对后确定该病毒株为2009年爆发的甲型H1N1... 详细信息

为分离流感病毒,本研究将疑似甲型流感患者的咽喉拭子接种SPF鸡胚尿囊腔,经检测收获的鸡胚尿囊液具有血凝活性。采用流感病毒通用引物进行PCR扩增出8个基因节段,经测序与GenBank中登录的序列比对后确定该病毒株为2009年爆发的甲型H1N1流感病毒,并命名为A/Harbin/LM/2009(H1N1),简称LM株。由于LM分离株在鸡胚中增殖能力比较弱,为提高其在鸡胚中的增殖能力,我们利用反向遗传技术将LM株的HA和NA基因与高增殖特性的人流感病毒细胞高产株PR8的另外6个节段进行"6+2"重配,获得拯救病毒,但该重配病毒血凝价并未显著提高。为进一步鉴定影响病毒增殖能力的基因,本研究将LM株所有节段以"7+1"的方式逐一与PR8的7个片段搭配构成完整的流感病毒基因组,分别得到8个重配病毒。结果显示分离株的PB1、PA、HA基因显著降低了重配病毒在鸡胚细胞中的增殖能力。

关键词：甲型H1N1流感病毒反向遗传重配增殖能力

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H5N1亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

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中国预防兽医学报 2011年第6期33卷 476-478页

作者：崔佳莹李印于扬张文亮邓国华陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为制备抗H5N1禽流感病毒(AIV)的单克隆抗体(MAb),本研究以灭活的H5N1亚型A/Chicken/Guangdong/S2261/2009(H5N1GD261)株免疫4周龄～6周龄BALB/c雌鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA及HI筛选获得了3株能稳定分泌抗HA的MAb杂交瘤细胞,分别命名为1A4、2F5和3D3。MAb亚类鉴定表明,2F5为IgM类,其它为IgG2a亚类,轻链均为κ链。经血凝抑制检测,3株MAb均能与H5亚型的AIV结合,并具有较好的型广谱性。

关键词：禽流感病毒血凝素单克隆抗体血凝抑制

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