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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会

作者：李印邓国华崔佳莹于洋丁晴微陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室华南农业大学湖南农业大学

本实验利用TRIzol Ls Reagent从感染鸡胚尿囊液中提取流感病毒核酸,经过反转录PCR和常规PCR方法扩增出禽流感毒株A/Duck/Guangxi/35/01(H5N1)的PB1蛋白、PB2蛋白和PA蛋白的cDNA。将PB2扩增基因连接在pCDNATAP载体上,PB1和PA扩增基因连接... 详细信息

本实验利用TRIzol Ls Reagent从感染鸡胚尿囊液中提取流感病毒核酸,经过反转录PCR和常规PCR方法扩增出禽流感毒株A/Duck/Guangxi/35/01(H5N1)的PB1蛋白、PB2蛋白和PA蛋白的cDNA。将PB2扩增基因连接在pCDNATAP载体上,PB1和PA扩增基因连接至pCNDNA3A载体上构建了pCDNA-35PB2TAP、pCDNA-35PB1和pCDNA-35PA质粒。利用构建的真核表达质粒共转染293T细胞,经过串联亲和纯化方法得到了流感病毒依赖RNA的RNA聚合酶复合体(RdRp)。利用RNA体外合成实验证明纯化得到的RdRp具有正常的生物学活性。

关键词： H5亚型禽流感 RNA聚合酶复合体串联亲和纯化

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H5N2亚型禽流感病毒的基因特征及遗传进化分析

H5N2亚型禽流感病毒的基因特征及遗传进化分析

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会

作者：段振华张翼施建忠刘丽玲田国彬曾显营张书霞陆承平华育平陈化兰李雁冰南京农业大学动物医学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室/国家禽流感参考实验室东北林业大学野生动物资源学院

为了解我国野生水禽携带的H5N2亚型禽流感病毒(AIV)的特征。本研究对2005-2006年江西省和黑龙江省正常野鸭体内分离到的11株H5N2亚型AIV进行全基因测定和遗传演化分析。结果表明:2005年分离自江西省的10株H5N2亚型禽流感病毒的HA基因裂... 详细信息

为了解我国野生水禽携带的H5N2亚型禽流感病毒(AIV)的特征。本研究对2005-2006年江西省和黑龙江省正常野鸭体内分离到的11株H5N2亚型AIV进行全基因测定和遗传演化分析。结果表明:2005年分离自江西省的10株H5N2亚型禽流感病毒的HA基因裂解位点均具有4～6个连续的碱性氨基酸,同属于高致病力毒株;2006年分离自黑龙江省的1株H5N2亚型禽流感病毒的HA基因裂解位点为R-E-T-R,属于典型的H5亚型低致病力毒株。遗传进化上,11株病毒同属于欧亚种系,HA、NA、PB1、PA和NS基因进化关系较近,但分别以不同的毒株为祖先进化而来;PB2、NP和M基因在各自的进化关系上距离较远,核苷酸同源率差异较大。并且11株病毒是以多基因型形式存在。

关键词：禽流感病毒 H5N2 遗传分析

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5种脑炎类人兽共患病病毒多重PCR检测方法的建立

5种脑炎类人兽共患病病毒多重PCR检测方法的建立

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会

作者：蔡绪禹康晓平刘洪李裕昌孙恩成王凌凤杨涛刘霓红步志高李文京杨银辉吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物/生物安全国家重点实验室中国动物疫病预防控制中心

本研究建立了能同时检测5种人兽共患脑炎类病毒的多重PCR方法,包括流行性乙型脑炎病毒(JEV)、森林脑炎病毒(TBEV)、东方马脑炎病毒(EEEV)、西方马脑炎病毒(WEEV)和基孔肯雅病毒(CHIKV)。根据GenBank登录的病毒基因组序列设计PCR特异引物... 详细信息

本研究建立了能同时检测5种人兽共患脑炎类病毒的多重PCR方法,包括流行性乙型脑炎病毒(JEV)、森林脑炎病毒(TBEV)、东方马脑炎病毒(EEEV)、西方马脑炎病毒(WEEV)和基孔肯雅病毒(CHIKV)。根据GenBank登录的病毒基因组序列设计PCR特异引物,通过优化引物组合及PCR反应条件,成功建立了针对

关键词：人兽共患病 PCR 检测方法

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H3N2亚型猪流感病毒的拯救及HA与NA基因的替换

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微生物学报 2009年第6期49卷 813-819页

作者：杜金玲刘明刘春国杨涛李洪涛中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室哈尔滨150001

【目的】为研究流感病毒突破种间屏障分子机制,筛选流感基因工程疫苗株。【方法】本试验以猪流感病毒A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)为亲本株,利用反向遗传学操作技术,采用RT-PCR技术对该病毒的8个基因片段分段进行扩增,通过与双向转录载体p... 详细信息

【目的】为研究流感病毒突破种间屏障分子机制,筛选流感基因工程疫苗株。【方法】本试验以猪流感病毒A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)为亲本株,利用反向遗传学操作技术,采用RT-PCR技术对该病毒的8个基因片段分段进行扩增,通过与双向转录载体pHW2000连接,重组质粒转染293T和MDCK共培养细胞,拯救出全部基因均来自于亲本株的猪流感病毒rgH3N2,并分别以人流感病毒A/PR/8/34(H1N1)、禽流感病毒A/Duck/Nanchang/4-165/2000(H4N6)、马流感病毒A/Equine/Fuyun/2008/(H3N8)的HA和NA基因替换A/Swine/Henan/S4/01的相应基因。【结果】生物学试验结果表明rgH3N2在鸡胚半数感染量、组织培养半数感染量、稳定性试验等方面都与亲本株保持一致。rgH3N2经鸡胚多次传代后血凝价最高可达到1∶256,接种MDCK细胞60h后,血凝价可以达到1∶64。基因替换后成功拯救出的重组病毒rgH1N1、rgH4N6和rgH3N8在鸡胚和细胞上均具有较高的增殖能力。【结论】病毒的成功拯救为流感病毒突破种间屏障分子机制,HA、NA基因在流感病毒跨种属传播中所扮演角色的研究和流感基因工程疫苗株的筛选奠定了基础。

关键词：猪流感反向遗传 RT-PCR H3N2亚型病毒拯救

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H7亚型禽流感病毒一步法RT-PCR检测方法的建立

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生物工程学报 2009年第11期25卷 1658-1663页

作者：包红梅王秀荣陶启蒙蔡东东王馥梅陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室侬业部动物流感重点开放实验室哈尔滨150001

通过分析流感数据库45个H7亚型禽流感病毒的HA序列,在保守区内设计并合成引物,建立了一步法RT-PCR检测方法,扩增片段大小为501bp。通过对H7亚型禽流感病毒尿囊液和棉拭子浸出液不同滴度检测,证实病毒尿囊液最低检出量为105.5EID50/mL;... 详细信息

通过分析流感数据库45个H7亚型禽流感病毒的HA序列,在保守区内设计并合成引物,建立了一步法RT-PCR检测方法,扩增片段大小为501bp。通过对H7亚型禽流感病毒尿囊液和棉拭子浸出液不同滴度检测,证实病毒尿囊液最低检出量为105.5EID50/mL;阳性棉拭子最低检出量为103EID50/mL。用该方法检测H1～H15亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他14种禽病病原进行检测,仅有H7亚型AIV有特异性目的条带,与其他均无交叉反应。从脏器及咽喉、泄殖腔棉拭子样品的病毒分离和RT-PCR方法比较,表明在10-1的样品浓度下,两者可以达到相同的检出量。表明该一步法RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高和准确率高的特点。

关键词：禽流感病毒反转录聚合酶链反应 H7N1 亚型鉴别

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H3N2亚型猪流感病毒实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

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中国兽医科学 2009年第10期39卷 894-899页

作者：陈艳张春明乔传玲杨焕良张飞吴运谱辛晓光陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

根据H3N2亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因保守序列,分别设计并合成了特异性引物和TaqMan MGB探针,利用实时荧光定量PCR技术检测SIV。使用含有选定检测序列的重组质粒pMD18-H3HA、pMD18-... 详细信息

根据H3N2亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因保守序列,分别设计并合成了特异性引物和TaqMan MGB探针,利用实时荧光定量PCR技术检测SIV。使用含有选定检测序列的重组质粒pMD18-H3HA、pMD18-N2NA标准品绘制标准曲线,其相关系数分别为0.99015(H3HA)和0.99947(N2NA)。检测结果显示,该方法的敏感性可达100 copies/μL,除H3N2亚型SIV外,对H1亚型、H9亚型SIV以及猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒和猪2型圆环病毒的检测均为阴性,应用该方法对实验室感染样品进行检测,其结果与病毒分离结果的符合率为95.83%。表明,该方法特异性强、重复性好,有望成为H3N2亚型SIV的一种特异、敏感、快速的定量检测方法。

关键词：猪流感病毒 H3N2亚型 Taq Man MGB探针实时荧光定量PCR

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H3N8亚型马流感病毒拯救体系的建立

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中国兽医科学 2009年第5期39卷 377-382页

作者：杜金玲刘明刘春国李洪涛张新涛石薇琳中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

利用反向遗传学操作技术,以马流感病毒(EIV)A/Equine/Fuyun/2008/(H3N8)为亲本株,采用RT-PCR技术对该毒株的8个基因片段分段进行扩增,通过与双向转录载体pHW2000连接,重组质粒转染293T和MDCK共培养细胞,成功拯救出全部基因均来自亲本株... 详细信息

利用反向遗传学操作技术,以马流感病毒(EIV)A/Equine/Fuyun/2008/(H3N8)为亲本株,采用RT-PCR技术对该毒株的8个基因片段分段进行扩增,通过与双向转录载体pHW2000连接,重组质粒转染293T和MDCK共培养细胞,成功拯救出全部基因均来自亲本株的EIVrH3N8,生物学试验结果表明,rH3N8在鸡胚半数感染量、组织培养半数感染量、稳定性试验等方面都与亲本株保持一致。以猪流感病毒(SIV)A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)内部基因的重组阳性质粒替换rH3N8的相应基因,成功拯救出重组病毒rgH3N8。两拯救毒株经鸡胚一次传代的血凝效价分别为1∶32、1∶64,最高可达1∶1024、1∶2048;接种MDCK细胞54h后的血凝效价最高均可达1∶512。rH3N8亚型EIV的成功拯救及基因的成功替换,为流感病毒突破种间屏障分子机制的研究和流感基因工程疫苗株的筛选奠定了基础。

关键词：马流感病毒反向遗传反转录聚合酶链式反应 H3N8亚型病毒拯救

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流感病毒聚合酶PA亚单位抗血清的制备

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中国预防兽医学报 2009年第4期31卷 314-317页

作者：葛叶邓国华李雪平高玉伟姚秋成唐艳玲陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

本研究采用RT-PCR方法从H5N1亚型禽流感病毒(AIV)A/Duck/Zhejiang/11/00中分段及全长扩增PA基因片段,将目的基因定向克隆至原核表达载体pET-32a,经测序验证正确后,获得重组阳性质粒,将重组质粒转化BL21细菌后诱导,实现质粒在大肠杆菌中... 详细信息

本研究采用RT-PCR方法从H5N1亚型禽流感病毒(AIV)A/Duck/Zhejiang/11/00中分段及全长扩增PA基因片段,将目的基因定向克隆至原核表达载体pET-32a,经测序验证正确后,获得重组阳性质粒,将重组质粒转化BL21细菌后诱导,实现质粒在大肠杆菌中的表达,重组表达蛋白经Ni+柱纯化后分别与弗氏免疫佐剂乳化成油乳剂苗免疫新西兰大耳白兔,获得抗PA的免疫抗血清。Western blot检测结果表明抗血清与目的蛋白发生特异性反应。同时,将PA全长基因插入真核表达载体pCAGGS,转染293T细胞,通过激光共聚焦显微镜发现,抗血清与PA基因的真核表达产物发生反应,出现特异性荧光,在细胞核与细胞浆中均出现荧光,进一步表明PA亚单位在细胞核与细胞浆均有分布。

关键词：禽流感病毒 PA基因抗血清

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H1N2亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/1/06分离鉴定和对猪致病性研究

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中国预防兽医学报 2009年第1期31卷 46-50页

作者：许传田樊树芳杨焕良乔传玲陈艳辛晓光陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

2006年5月从广东某大型猪场采集具有流感症状保育猪鼻拭子共98份,无菌常规处理猪鼻拭子后接种MDCK细胞,分离到4株流感病毒。用血凝抑制和PCR方法鉴定均为H1N2亚型。挑选其中一株A/Swine/Guangdong/1/06(H1N2),进行全基因组测序,并与GenB... 详细信息

2006年5月从广东某大型猪场采集具有流感症状保育猪鼻拭子共98份,无菌常规处理猪鼻拭子后接种MDCK细胞,分离到4株流感病毒。用血凝抑制和PCR方法鉴定均为H1N2亚型。挑选其中一株A/Swine/Guangdong/1/06(H1N2),进行全基因组测序,并与GenBank中相关序列进行比较。核苷酸同源性分析表明:A/Swine/Guangdong/1/06(H1N2)与A/Swine/Guangxi/13/06不同基因之间同源性为96.6%～98.1%。以106EID50的剂量,将H1N2病毒鼻腔感染35日龄仔猪,结果表明H1N2亚型流感病毒可以感染猪上呼吸道,但不表现临床症状。本研究结果对于揭示H1N2亚型猪流感流行规律和病毒的致病机理具有一定的意义。

关键词： H1N2亚型猪流感病毒分离鉴定致病性

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人源H3N2亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/1/2005的分离鉴定及全基因遗传演化分析

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中国预防兽医学报 2009年第4期31卷 322-324页

作者：许传田董国英杨焕良乔传玲陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

2005年从广东某猪场采集疑似流感病猪的病料(气管和肺脏)样品共40份,通过MDCK细胞培养分离到6株A型流感病毒,经过血凝抑制和PCR扩增方法鉴定均为H3N2亚型。挑选其中一个代表株A/swine/Guangdong/1/05(H3N2)(SwGD1/05)进行全基因组测序并... 详细信息

2005年从广东某猪场采集疑似流感病猪的病料(气管和肺脏)样品共40份,通过MDCK细胞培养分离到6株A型流感病毒,经过血凝抑制和PCR扩增方法鉴定均为H3N2亚型。挑选其中一个代表株A/swine/Guangdong/1/05(H3N2)(SwGD1/05)进行全基因组测序并与GenBank中相关序列比较,结果发现SwGD1/05的8个基因分别与人流感病毒相关基因氨基酸同源性高达98.5%～99.4%;SwGD1/05的8个基因进化树中分别位于北美和欧洲人流感病毒进化谱系位置;由此推测SwGD1/05可能来源于北美或欧洲人源流感病毒株。这一结果为阐明猪作为流感病毒传播的中间宿主作用提供了的理论支持,本研究具有重要的人类公共卫生意义。

关键词：人源猪流感病毒 H3N2亚型分离鉴定遗传演化

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