检索结果-内蒙古大学图书馆

猪外周血单个核细胞cDNA酵母表达文库的构建及与猪瘟病毒E2蛋白相互作用细胞蛋白的筛选

中国预防兽医学报 2013年第9期35卷 707-710页

作者：廖亚金李素贺番何文瑞董泓冯烁孙元仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为研究猪瘟病毒(CSFV)蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用,本研究通过SMART技术合成猪外周血单个核细胞(PBMC)双链cDNA,以携带与载体pGADT7-Rec重组位点同源序列的特异引物经long-distance PCR扩增双链cDNA。纯化双链cDNA并与载体pGADT7-... 详细信息

为研究猪瘟病毒(CSFV)蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用,本研究通过SMART技术合成猪外周血单个核细胞(PBMC)双链cDNA,以携带与载体pGADT7-Rec重组位点同源序列的特异引物经long-distance PCR扩增双链cDNA。纯化双链cDNA并与载体pGADT7-Rec共转化酵母菌株Y187,经同源重组构建PBMC cDNA酵母表达文库。以CSFV E2蛋白为诱饵进行酵母双杂交筛选,得到阳性克隆根据序列比对分析结果,进一步进行共转化验证。结果显示筛选到17个与CSFV E2蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,基因注释(GO)分析表明这些蛋白分别参与免疫、代谢、细胞生长与增殖、生物调节等过程,为研究它们与CSFV E2的相互作用奠定了基础。

关键词：猪瘟病毒 PBMC cDNA文库酵母双杂交 E2蛋白

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猪圆环病毒2型Cap蛋白与猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白在杆状病毒中共表达及鉴定

引用

中国预防兽医学报 2013年第1期35卷 44-47页

作者：王一平郭龙军唐青海刘丹危艳武李胜斌刘建波黄立平吴洪丽刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为在真核细胞中共表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白与猪O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白,本研究将其各自编码基因克隆于杆状病毒双表达载体(pFastBacTMDual)中构建重组转移质粒(pFBD-Cap-VP1),转化至DH10BacTM感受态细胞中制备重组杆粒(rBacm... 详细信息

为在真核细胞中共表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白与猪O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白,本研究将其各自编码基因克隆于杆状病毒双表达载体(pFastBacTMDual)中构建重组转移质粒(pFBD-Cap-VP1),转化至DH10BacTM感受态细胞中制备重组杆粒(rBacmid-Cap-VP1),并转染Sf21昆虫细胞,拯救出能够共表达PCV2-Cap和FMDV-VP1蛋白的重组杆状病毒(rBac-Cap-VP1)。SDS-PAGE和western blot检测结果表明,共表达的重组PCV2-Cap和FMDV-VP1蛋白产物的分子量分别为28 ku和30 ku,各占总蛋白含量的11.6%和3.4%,能够分别与PCV2和FMDV抗体发生特异性反应,表明共表达蛋白具有良好的反应原性。本研究为PCV2和FMDV基因工程二联亚单位疫苗的研制奠定了基础。

关键词：猪圆环病毒2型猪O型口蹄疫病毒 Cap蛋白 VP1蛋白共表达

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J亚群禽白血病病毒分离株HLJ09SH01株感染性克隆的构建及其致病性研究

引用

中国预防兽医学报 2013年第1期35卷 15-18页

作者：纪晓琳王琦高玉龙王永强秦立廷祁小乐高宏雷王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为构建J亚群禽白血病病毒(ALV-J)分离株的感染性克隆并鉴定其对蛋鸡和肉鸡致病力的差异,本研究从黑龙江地区分离鉴定一株ALV-J分离株HLJ09SH01,以其核酸为模板,采用PCR方法分3段扩增其前病毒cDNA,PCR产物经克隆酶切后依次连接,获得一个... 详细信息

为构建J亚群禽白血病病毒(ALV-J)分离株的感染性克隆并鉴定其对蛋鸡和肉鸡致病力的差异,本研究从黑龙江地区分离鉴定一株ALV-J分离株HLJ09SH01,以其核酸为模板,采用PCR方法分3段扩增其前病毒cDNA,PCR产物经克隆酶切后依次连接,获得一个含有完整ALV-J前病毒cDNA的重组质粒,命名为pBlue-HLJ09SH01。将其转染DF-1细胞,进行病毒拯救。通过间接免疫荧光、禽白血病抗原试剂盒检测及反转录酶活性试剂盒检验,表明拯救的病毒为ALV-J,命名为rHLJ09SH01。将其分别人工接种11日龄蛋鸡和肉鸡鸡胚,孵育出壳后隔离饲养32周。致瘤性试验结果表明,rHLJ09SH01可以导致57.9%的蛋鸡发生肿瘤,83.3%的肉鸡发生肿瘤。表明该感染性克隆具有亲本病毒的致病性。

关键词： J亚群禽白血病病毒感染性分子克隆致病性

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东北地区野生鸟类J亚群禽白血病分子流行病学调查及部分基因组序列分析

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畜牧兽医学报 2013年第3期44卷 488-494页

作者：李德龙高玉龙曾祥伟杨波刘婉思高奇秦立廷高宏雷王笑梅刘思当山东农业大学动物科技学院泰安271000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室哈尔滨150001 东北林业大学野生动物资源学院哈尔滨150040

为了解野生鸟类感染禽白血病(AL)的情况,于2010—2011年采集300份野生鸟类样品进行试验。用PCR方法先后检测到7株ALV-J阳性样品。分别扩增了env基因和3′UTR区段,并对其进行了序列测定和比较分析。结果显示,7株ALV-J阳性样品的env基因... 详细信息

为了解野生鸟类感染禽白血病(AL)的情况,于2010—2011年采集300份野生鸟类样品进行试验。用PCR方法先后检测到7株ALV-J阳性样品。分别扩增了env基因和3′UTR区段,并对其进行了序列测定和比较分析。结果显示,7株ALV-J阳性样品的env基因遗传进化与原型毒株HPRS-103和代表株不在同一个分支上,在3′UTR区段没有太大差异,与原型毒株HPRS-103相比,E元件部分位点存在变异。以上结果表明,目前中国野生鸟类已存在禽白血病的感染,虽然检出率较低,但是由于野生鸟类活动范围比较大,给AL的防控增加了难度。通过对J亚群阳性样品进行序列分析和比对,发现env基因和3′UTR区段部分位点发生变异。这些都提醒注意防控白血病在野生鸟类中进一步传播。

关键词：野生鸟类禽白血病流行病学调查序列分析

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猪Cdk2基因的克隆及其功能研究

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畜牧兽医学报 2013年第10期44卷 1522-1531页

作者：唐青海张辉危艳武刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室哈尔滨150001 南阳师范学院河南省伏牛山昆虫生物学重点实验室南阳473061

本研究旨在克隆猪Cdk2基因,并研究其编码蛋白CDK2的生物学功能。采用RT-PCR扩增猪Cdk2基因,运用生物信息学软件分析其核苷酸和编码氨基酸特征,并预测编码蛋白的生物学功能;利用半定量RT-PCR方法分析该基因在猪各个脏器和组织中的表达情... 详细信息

本研究旨在克隆猪Cdk2基因,并研究其编码蛋白CDK2的生物学功能。采用RT-PCR扩增猪Cdk2基因,运用生物信息学软件分析其核苷酸和编码氨基酸特征,并预测编码蛋白的生物学功能;利用半定量RT-PCR方法分析该基因在猪各个脏器和组织中的表达情况;共聚焦显微镜观察CDK2的亚细胞定位,采用过表达和shRNA干扰技术研究CDK2在细胞周期和细胞增殖中的调控作用。结果表明,猪Cdk2基因开放阅读框(ORF)为897bp(GenBank:JX967576),该基因与绵羊、牛、山羊、人、金仓鼠、小鼠、仓鼠和沟鼠Cdk2的核苷酸相似性依次为94.2%、94.0%、93.8%、93.4%、91.8%、91.0%、90.6%和89.9%,与牛、山羊和绵羊的亲缘关系最近;Cdk2编码298aa,CDK2分子质量为34ku。Cdk2mRNA在猪10个不同脏器和组织中均有表达。CDK2定位于细胞质和细胞核中,并通过蛋白酶体途径降解。猪CDK2在PK-15细胞中过表达引起S期细胞比例显著减少及G2/M期细胞比例显著增加(P<0.05),而G0/G1期无显著变化;相反,CDK2表达量降低引起S期细胞比例显著减少及G0/G1期细胞比例显著增加,而G2/M期无显著变化。本研究成功克隆了猪Cdk2基因并对其编码蛋白生物学功能进行了初步研究。

关键词：猪Cdk2 基因克隆细胞周期细胞增殖

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猪流行性腹泻病毒N蛋白核仁定位信号对宿主细胞周期的影响

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中国预防兽医学报 2013年第3期35卷 173-176页

作者：刘随新石达陈建飞张鑫时洪艳刘孝珍张莎王璐冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学黑龙江哈尔滨150030

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白(N)与宿主细胞相互作用,本研究根据前期已经鉴定的PEDV N蛋白核仁定位信号序列,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法扩增出核仁定位信号序列缺失的PEDV N基因(dN),并将其与真核表达载体pAc-GFP-C1连接... 详细信息

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白(N)与宿主细胞相互作用,本研究根据前期已经鉴定的PEDV N蛋白核仁定位信号序列,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法扩增出核仁定位信号序列缺失的PEDV N基因(dN),并将其与真核表达载体pAc-GFP-C1连接,构建重组质粒pAc-GFP-dN。将pAc-GFP-dN转染于Vero E6细胞中,利用激光共聚焦显微镜分析重组质粒pAc-GFP-dN表达蛋白的定位情况,并利用流式细胞仪检测转染细胞的周期变化。实验结果表明:与完整的N蛋白相比,缺失核仁定位信号的N蛋白不能定位于细胞核仁,同时丧失了使宿主细胞周期在G2/M期停滞的能力,从而揭示了N蛋白核仁定位信号对宿主细胞具有重要的影响。

关键词：猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白核仁定位信号流式细胞术宿主细胞周期

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牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

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中国生物工程杂志 2013年第4期33卷 40-45页

作者：王姝朱远茂蔡红马磊史鸿飞吕闯董秀梅高欲燃薛飞东北农业大学动物医学学院哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物传染病研究室哈尔滨150001

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)糖蛋白E2单克隆抗体(MAb),利用原核表达并且纯化的重组糖蛋白E2(rE2)免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。采用以BVDV为检测抗原的间接ELISA筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得2... 详细信息

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)糖蛋白E2单克隆抗体(MAb),利用原核表达并且纯化的重组糖蛋白E2(rE2)免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。采用以BVDV为检测抗原的间接ELISA筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得2株稳定分泌抗E2特异性MAb的杂交瘤细胞株,分别命名为4E3与1G11。用4E3与1G11杂交瘤细胞株接种BALB/c小鼠制备腹水,采用rE2及BVDV包被的ELISA测得的效价分别是6.21×106和6.83×105及6.83×105和7.5×104。间接ELISA、Western blot、IFA试验表明两株杂交瘤细胞所分泌的MAb具有良好的反应性和特异性。经抗体亚类鉴定4E3与1G11均为IgM/κ。特异性试验表明4E3与1G11这2株MAb均不与牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛腺病毒3型反应;其中4E3不与猪瘟病毒反应,而1G11则可与猪瘟病毒发生交叉反应,这种反应特性可试用于BVDV与猪瘟病毒的鉴别诊断。所制备的4E3与1G11 MAb可以用于BVDV抗原的检测,为建立检测BVDV E2蛋白血清抗体的ELISA奠定了基础。

关键词：牛病毒性腹泻病毒 E2 单克隆抗体 IgM

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抗猪PD-L1分子的单克隆抗体制备及免疫学特性分析

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中国预防兽医学报 2013年第7期35卷 578-581页

作者：彭金美李登云郭娟娟安同庆孙艳吴玉全陈家锃冷超粮田志军童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100 中国农业科学院上海兽医研究所猪传染病研究室上海200241

为制备抗猪程序性死亡因子配体1(PD-L1)的单克隆抗体(MAb)并鉴定其免疫学特性,本研究将猪PD-L1基因的外膜区利用原核表达载体pET32a进行表达,以纯化的表达蛋白免疫BALB/c小鼠,利用常规淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,以表达PD-L1-Fc蛋... 详细信息

为制备抗猪程序性死亡因子配体1(PD-L1)的单克隆抗体(MAb)并鉴定其免疫学特性,本研究将猪PD-L1基因的外膜区利用原核表达载体pET32a进行表达,以纯化的表达蛋白免疫BALB/c小鼠,利用常规淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,以表达PD-L1-Fc蛋白的293T细胞作为抗原,采用间接免疫荧光试验筛选杂交瘤培养上清,获得两株稳定分泌抗猪PD-L1 MAb的杂交瘤细胞系。MAb亚型鉴定均为IgG1型,轻链为κ链。Western blot试验表明这两株MAb均可以特异性识别PD-L1蛋白。流式细胞检测结果显示这两株MAb可以识别表达于293T细胞膜表面的PD-L1分子,但不能阻断PD-L1分子与其受体PD-1的结合。这两株MAb的获得为研究PD-1/PD-L1通路与猪的某些感染性疾病发展进程的关系提供了必要的检测工具。

关键词： PPD-L1分子 PD-1 PD-L1通路单克隆抗体

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腺病毒/日本脑炎病毒复制子嵌合载体的构建

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中国预防兽医学报 2013年第10期35卷 804-808页

作者：李红梅孙元亓文宝孟其麟田大勇廖明仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 华南农业大学兽医学院农业部兽用疫苗创制重点实验室广东广州510642

为解决日本脑炎病毒(JEV)复制子DNA疫苗载体不稳定和递送效率低的缺点,本研究利用具有高效递送效率的人5型复制缺陷性腺病毒(AdV)来递送JEV复制子,构建嵌合载体。本研究将已构建的含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的JEV复制子克隆至经... 详细信息

为解决日本脑炎病毒(JEV)复制子DNA疫苗载体不稳定和递送效率低的缺点,本研究利用具有高效递送效率的人5型复制缺陷性腺病毒(AdV)来递送JEV复制子,构建嵌合载体。本研究将已构建的含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的JEV复制子克隆至经过改造的带有SwaⅠ酶切位点的pShuttle-CMV载体中,再将来自pCI载体的嵌合内含子插入JEV复制子中,得到转移载体pSh-JEV-In-EGFP,经SwaⅠ线性化后电转化至含有腺病毒骨架载体AdEasy-1的BJ5183感受态细胞,将所得重组腺粒经PacⅠ线性化后转染HEK293细胞,传代直至出现细胞病变,得到含有表达EGFP的JEV复制子的重组腺病毒,命名为rAdV-JEV-In-EGFP。结果表明,pSh-JEV-In-EGFP在细菌中传20代仍然保持稳定,而且在rAdV-JEV-In-EGFP感染的HEK293细胞中,JEV复制子能够自我复制,并启动EGFP蛋白稳定、高效地表达。本研究为进一步研发以腺病毒递送的JEV复制子为基础的二价新型疫苗奠定基础。

关键词：日本脑炎病毒复制子腺病毒内含子嵌合载体

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猪圆环病毒2型Rep'蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

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中国预防兽医学报 2013年第5期35卷 405-409页

作者：刘丹刘建波吴洪丽王一平危艳武唐青海李胜斌魏萍刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨1500301

为制备猪圆环病毒2型Rep'蛋白单克隆抗体(MAb),本研究采用淋巴细胞瘤杂交技术制备其MAb,获得了1株能够稳定分泌抗PCV2-Rep'蛋白的杂交瘤细胞株,命名为3D1株。MAb亚类鉴定为IgG1/κ型,腹水效价达1∶819 200。Western blot分析表... 详细信息

为制备猪圆环病毒2型Rep'蛋白单克隆抗体(MAb),本研究采用淋巴细胞瘤杂交技术制备其MAb,获得了1株能够稳定分泌抗PCV2-Rep'蛋白的杂交瘤细胞株,命名为3D1株。MAb亚类鉴定为IgG1/κ型,腹水效价达1∶819 200。Western blot分析表明,该MAb可与重组杆状病毒表达的PCV2-rRep'和PCV2-rRep蛋白发生特异性反应,具有良好的特异性和反应原性。采用MAb对PCV2感染细胞中Rep'蛋白抗原性进行了鉴定,证明该MAb能够与病毒Rep'蛋白产生特异性反应。采用合成肽扫描法对MAb对应的抗原表位鉴定,其核心序列为61FANFVKKQTFNKV73,位于PCV2-Rep'蛋白的N末端。制备的MAb及其抗原表位鉴定,为该病毒分子生物学及诊断技术的研究奠定了基础。

关键词：猪圆环病毒2型重组Rep’蛋白单克隆抗体抗原表位

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