检索结果-内蒙古大学图书馆

马白细胞介素18成熟蛋白(mEIL-18)基因在大肠埃希氏菌中的高效表达与纯化

畜牧兽医学报 2007年第3期38卷 307-312页

作者：童铁钢刘光亮白宇肖一红王群李少英孟庆文吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

用RT-PCR从经ConA刺激的马外周血单个核细胞(PBMC)中扩增出马白细胞介素18(Equine interleu-kin-18,EIL-18)前体蛋白(precursor EIL-18,pEIL-18)基因的cDNA,然后克隆至载体pCR2.1-TOPO中,鉴定并命名为pCR2.1-pEIL-18。自pCR2.1-pEIL-18中扩增马白细胞介素18成熟蛋白(mature EIL-18,mEIL-18)基因,并将其亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)中。将筛选出的阳性克隆进行测序、诱导表达并纯化其表达产物。结果表明,mEIL-18基因全长474 bp,含1个开放阅读框,编码157个氨基酸的成熟蛋白;表达产物以可溶性和包涵体两种形式存在,经SDS-PAGE和Western-blot分析,重组蛋白相对分子量约为20 ku,且具有免疫生物学活性。mEIL-18基因在大肠杆菌中高效表达并在非变性和变性条件下采用Ni+亲和层析纯化方法获得了高纯度的重组mEIL-18,为探究马白细胞介素18的生物学活性及其应用奠定了基础。

关键词： mEIL-18 克隆表达纯化

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禽流感病毒A/Turkey/Canada/63毒株HA和NA基因的克隆及序列分析

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中国兽医科学 2006年第8期36卷 611-616页

作者：潘蔚绮刘明刘春国张云杨涛中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

用SPF鸡胚增殖禽流感病毒(AIV)A/Turkey/Canada/63毒株,提取病毒基因组总RNA,应用RT-PCR技术分别扩增该病毒分离株的HA和NA基因全片段,并克隆到pMD18-T载体上。测序结果表明,该毒株的HA基因全长为1745bp,含有完整的阅读框架,编码566个... 详细信息

用SPF鸡胚增殖禽流感病毒(AIV)A/Turkey/Canada/63毒株,提取病毒基因组总RNA,应用RT-PCR技术分别扩增该病毒分离株的HA和NA基因全片段,并克隆到pMD18-T载体上。测序结果表明,该毒株的HA基因全长为1745bp,含有完整的阅读框架,编码566个氨基酸；NA基因全长1467bp,编码469个氨基酸。BLAST序列比较结果显示,该毒株HA基因属于H6亚型,NA基因属于N2亚型。将获得的HA和NA基因与AIV数据库中H6和N2基因进行遗传演化分析,表明该毒株HA基因与其他H6基因核苷酸的同源性为80.5%～87.3%,氨基酸的同源性为88.0%～93.1%；NA基因与其他N2基因核苷酸的同源性为86.0%～93.5%,氨基酸的同源性为90.6%～96.3%。

关键词：禽流感病毒 H6N2亚型 HA基因 NA基因序列分析

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基于SemlikiForest病毒RNA复制子的猪瘟RNA疫苗的初步研究

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中国生物工程杂志 2005年第1期25卷 53-58页

作者：李娜仇华吉李国新朱庆虎罗玉子贾洪林童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

将猪瘟病毒E2基因克隆于我们此前构建的衍生于Semliki Forest病毒(semliki forest virus,SFV)RNA复制子的新型真核表达载体pSFV1CS中,获得重组质粒pSFV1CS-E2。用纯化的pSFV1CS-E2分别转染BHK-21细胞和293T细胞,经间接免疫荧光试验检测... 详细信息

将猪瘟病毒E2基因克隆于我们此前构建的衍生于Semliki Forest病毒(semliki forest virus,SFV)RNA复制子的新型真核表达载体pSFV1CS中,获得重组质粒pSFV1CS-E2。用纯化的pSFV1CS-E2分别转染BHK-21细胞和293T细胞,经间接免疫荧光试验检测显示,CSFV E2基因在转染细胞中得到表达。小鼠接种试验结果表明,10μg或100μg pSFV1CS-E2可诱导小鼠产生猪瘟特异性抗体。

关键词： Semliki Forest病毒 RNA复制子猪瘟 RNA疫苗猪瘟病毒真核表达载体

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马传染性贫血病病毒L株前病毒全基因组核苷酸序列分析

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中国农业科学 2001年第6期34卷 690-696页

作者：刘红全王柳杨志彪孔宪刚童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

本实验所用的马传染性贫血病毒（ＥＩＡＶ）Ｌ株（ＥＩＡＶ－Ｌ）是我国研制成功的ＥＩＡＶ弱毒疫苗的原始强毒株。以ＥＩＡＶ－Ｌ感染马外周血液白细胞中ＤＮＡ为模板，利用ＰＣＲ技术，分４个片段扩增ＥＩＡＶ－Ｌ前病毒ＤＮＡ，并分... 详细信息

本实验所用的马传染性贫血病毒（ＥＩＡＶ）Ｌ株（ＥＩＡＶ－Ｌ）是我国研制成功的ＥＩＡＶ弱毒疫苗的原始强毒株。以ＥＩＡＶ－Ｌ感染马外周血液白细胞中ＤＮＡ为模板，利用ＰＣＲ技术，分４个片段扩增ＥＩＡＶ－Ｌ前病毒ＤＮＡ，并分别克隆到载体质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ中，得到４个重组质粒ｐ２．８、ｐ２．４、ｐ３．１和ｐ１．２，经酶切鉴定后测序。对测序结果分析、拼接，得到ＥＩＡＶ－Ｌ前病毒基因组全序列。ＥＩＡＶ－Ｌ前病毒基因组全长８２３５ｂｐ，其中Ｇ＋Ｃ含量为３８％。通过使用计算机软件ＤＮＡＳＩＳ分析，ＥＩＡＶ－Ｌ与马传贫驴强毒和马传贫驴白细胞疫苗毒序列同源性分别为９８．４％和９６．９％。同源性如此接近反映了它们之间的亲缘关系，另外ＥＩＡＶ－Ｌ与驴强毒的同源性高于其与驴白细胞弱毒疫苗株的同源性，这符合驴白细胞弱毒疫苗株的衍生过程。基因组两端是长为３１６ｂｐ的ＬＴＲ，其中Ｕ３为１９７ｂｐ，Ｒ为８０ＢＰ，Ｕ５为３９ｂｐ。前病毒基因组有３个较大的开放阅读框架（ＯＲＦ），分别编码ｇａｇ、ｐｏｌ和ｅｎｖ基因。ｇａｇ基因位于７１３～１９１２位碱基之间，全长１２００ｂｐ；ｐｏｌ基因位于１７０８～５１０９位碱基之间，全长

关键词：马传染性贫血病毒 L株前病毒核替酸序列分析

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流感病毒反向遗传学技术研究进展

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生物化学与生物物理进展 2008年第8期35卷 867-874页

作者：刘大飞刘春国刘明刘大程中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室哈尔滨150001 莱阳市城厢兽医站莱阳265200

流感病毒亚型众多,且极易发生变异,给防控带来很大困难,所以当务之急应加强其在致病机理、传播机制等方面的研究和加快新型流感疫苗的开发.近年来,反向遗传学技术的发展为流感病毒基因功能研究和疫苗制备方面开辟了新思路.

关键词：流感病毒反向遗传学技术功能研究标记疫苗

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马传染性贫血病毒弱毒疫苗株感染性分子克隆的构建

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中国农业科学 2003年第12期36卷 1560-1565页

作者：王柳童光志仇华吉谷守林涂亚斌杨志彪中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

采用PCR方法分 3段扩增出马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株 (EIAVDLA)的前病毒DNA ,这 3个片段覆盖马传染性贫血病毒的全部基因组 ,PCR产物经克隆后顺次连接 ,获得 1个含有EIAV全基因 (8.0kb)的重组质粒 ,将其命名为p8.0。将此 8.0kb... 详细信息

采用PCR方法分 3段扩增出马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株 (EIAVDLA)的前病毒DNA ,这 3个片段覆盖马传染性贫血病毒的全部基因组 ,PCR产物经克隆后顺次连接 ,获得 1个含有EIAV全基因 (8.0kb)的重组质粒 ,将其命名为p8.0。将此 8.0kbEIAV全基因再亚克隆到含有一完整EIAVDLA株长末端重复序列的质粒中 ,获得一含有EIAV驴白细胞弱毒前病毒全基因的重组质粒 ,将其命名为p8.2 ,经核苷酸序列分析 ,证明p8.2含有EIAV前病毒的全基因。用p8.2转染驴白细胞 ,将其作为种毒进行传代 ,于感染该克隆毒的细胞培养上清中检测出了反转录酶活性 ,说明在驴白细胞中由p8.2衍生出了EIA病毒。驴白细胞经该克隆毒感染后 ,第 4天出现病变 ,经透射电镜可观察到典型的马传染性贫血病毒粒子 ,进一步证明p8.2具有感染性 ,笔者获得了马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆 ,为进一步在分子水平上阐明我国EIAV疫苗株的减毒机理和免疫保护机制奠定了基础

关键词：马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株感染性分子克隆

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马γ-干扰素双抗体夹心ELISA检测方法的建立

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细胞与分子免疫学杂志 2008年第5期24卷 464-466页

作者：白宇童铁钢张维军徐树兰王群刘光亮吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

目的:建立检测马γ-干扰素的双抗体夹心ELISA,为马传染病的免疫学研究提供新方法。方法:将识别不同表位的抗马γ-干扰素的2株单克隆抗体(mAb,A5和SB10)纯化后,利用生物素标记试剂盒对其中1株纯化的mAb(SB10)进行标记,通过对重组马IFN-... 详细信息

目的:建立检测马γ-干扰素的双抗体夹心ELISA,为马传染病的免疫学研究提供新方法。方法:将识别不同表位的抗马γ-干扰素的2株单克隆抗体(mAb,A5和SB10)纯化后,利用生物素标记试剂盒对其中1株纯化的mAb(SB10)进行标记,通过对重组马IFN-γ进行ELISA检测来建立马γ-干扰素双抗体夹心ELISA。结果:经过方阵滴定实验确定捕获抗体的最佳浓度为1mg/L,检测抗体的工作效价为1∶1000。利用建立的方法对不同稀释度的重组马γ-干扰素和丝裂原刺激的马外周血单核细胞培养上清进行检测。结论:此方法检测敏感度达到1μg/L,特异性良好,为马的细胞免疫学研究提供了方法,并为建立马γ-干扰素ELISPOT检测方法奠定了基础。

关键词：马γ-干扰素夹心ELISA

来源：评论

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一株鹅源高致病力禽流感病毒分离株血凝素基因的分析

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中国农业科学 1999年第2期32卷 89-94页

作者：陈化兰于康震步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

禽流感病毒（ＡＩＶ）的表面结构蛋白血凝素（ＨＡ）在决定病毒致病力、受体结合特性、宿主范围等方面起着关键作用。本研究对初步鉴定为高致病力毒株的ＡＩＶ鹅体分离株Ａ／Ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／９６（Ｈ５Ｎ１）的Ｈ... 详细信息

禽流感病毒（ＡＩＶ）的表面结构蛋白血凝素（ＨＡ）在决定病毒致病力、受体结合特性、宿主范围等方面起着关键作用。本研究对初步鉴定为高致病力毒株的ＡＩＶ鹅体分离株Ａ／Ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／９６（Ｈ５Ｎ１）的ＨＡ基因进行了克隆并测序。结果表明，这一在无胰酶条件下可在单层鸡胚成纤维细胞培养物上形成蚀斑的毒株在其ＨＡ裂解位点附近有连续６个碱性氨基酸的插入物，从而揭示了其高致病力的分子基础。进一步的序列比较发现这一毒株与１９９７年香港流感病毒Ａ／Ｈｏｎｇｋｏｎｇ／１５６／９７（ＨＫ／９７）的ＨＡ基因核苷酸和氨基酸同源率分别高达９８．０％和９８．２％，且其６个糖基化位点、２个受体结合位点及裂解位点碱性氨基酸插入物的序列均完全一致，提示该毒株与ＨＫ／９７具有相似的生物学特性。

关键词：禽流感病毒 H5亚型高致病力血凝素基因

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猪瘟甲病毒复制子载体DNA疫苗与重组腺病毒活载体疫苗联合免疫效果评价

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生物工程学报 2009年第5期25卷 679-685页

作者：孙元刘大飞王宇飞李娜李宏宇梁冰冰仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室哈尔滨150001

本实验室先前分别将构建的猪瘟病毒E2基因重组腺病毒疫苗(rAdV-E2)和猪瘟甲病毒复制子载体DNA疫苗(pSFV1CS-E2)在猪体上进行了免疫效力评价,结果显示,rAdV-E2免疫组所有猪虽然在加强免疫后产生了比较高的猪瘟特异性中和抗体,但攻毒后个... 详细信息

本实验室先前分别将构建的猪瘟病毒E2基因重组腺病毒疫苗(rAdV-E2)和猪瘟甲病毒复制子载体DNA疫苗(pSFV1CS-E2)在猪体上进行了免疫效力评价,结果显示,rAdV-E2免疫组所有猪虽然在加强免疫后产生了比较高的猪瘟特异性中和抗体,但攻毒后个别猪表现短期体温升高和轻微病变;而pSFV1CS-E2免疫组猪只虽然在攻毒后得到了保护,但产生的抗体水平较低。为了增强猪瘟甲病毒复制子载体疫苗和猪瘟重组腺病毒活载体疫苗的免疫效果,本研究应用了复制子载体DNA疫苗初免和重组腺病毒疫苗加强免疫的初免-加强(Prime-boost)免疫策略,并在猪体上进行了评价。结果显示,所有免疫猪均产生了高水平的猪瘟特异性的中和抗体,用猪瘟强毒攻击后,pSFV1CS-E2初免组所有猪(n=5)均没有出现任何猪瘟的临床症状和病理变化,攻毒后在猪血液中也没有检测到猪瘟病毒RNA,而重组腺病毒初免组(n=5)有一头猪出现短期发热和病毒血症及轻微病理变化。这表明初免-加强免疫策略能显著提高重组疫苗的免疫效力。

关键词：猪瘟甲病毒复制子载体 DNA疫苗重组腺病毒联合免疫

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泛素基因介导下的猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因对小鼠的免疫试验

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微生物学报 2009年第6期49卷 799-806页

作者：张维军童铁钢白宇王群徐树兰孙庆歌田野杨涛童光志吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室哈尔滨150001 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

【目的】获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus,PRRSV)M蛋白基因及其与泛素(Ubiquitin,Ub)基因融合的真核表达质粒,并进一步研究Ub对M基因免疫效果的影响。【方法】利用RT-PCR技术以PRRSV C... 详细信息

【目的】获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus,PRRSV)M蛋白基因及其与泛素(Ubiquitin,Ub)基因融合的真核表达质粒,并进一步研究Ub对M基因免疫效果的影响。【方法】利用RT-PCR技术以PRRSV CH-1a株和BALB/c小鼠脾脏组织总RNA为模板,分别扩增出PRRSVM蛋白基因与小鼠的Ub基因,利用SOE技术将PRRSVM基因与小鼠Ub基因进行融合,最终构建真核表达质粒pVAX1-M与pVAX1-U-M。以两种真核表达质粒DNA肌肉免疫BALB/c小鼠后,分别检测体液免疫反应与细胞免疫反应,比较M单基因与Ub-M融合基因DNA免疫所诱生的免疫应答强度【结果】IFA试验表明,pVAX1-M与pVAX1-U-M均能BHK-21细胞内成功表达目的基因;两种重组质粒免疫小鼠后均可诱生PRRSVELISA抗体与细胞免疫反应,但是pVAX1-U-M诱导的细胞免疫反应明显高于pVAX1-M,差异显著(P<0.05);而其诱导的抗体水平明显低于pVAX1-M,二者差异也显著(P<0.05)。【结论】泛素在一定程度上可以促进PRRSVM基因诱导细胞免疫反应,但对体液免疫未见到同样作用。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 M基因泛素体液免疫细胞免疫 DNA疫苗

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