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长江大学学报（自科版）（中旬） 2012年第11期9卷 24-29页

作者：张枫李江南尹曼曼郭东伟刘琴芳王朝翁长江熊涛长江大学生命科学学院湖北荆州434025 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

2006年，我国爆发了高致病性猪繁殖与呼吸综合征（HP—PRRSV），给养猪业造成了严重的经济损失，该HP-PRRSV在Nsp2区有30个氨基酸的不连续缺失。分子流行病学调查证实，目前我国流行的PRRSV毒株主要是HP—PRRSV毒株。2011年，从山东某... 详细信息

2006年，我国爆发了高致病性猪繁殖与呼吸综合征（HP—PRRSV），给养猪业造成了严重的经济损失，该HP-PRRSV在Nsp2区有30个氨基酸的不连续缺失。分子流行病学调查证实，目前我国流行的PRRSV毒株主要是HP—PRRSV毒株。2011年，从山东某猪场成功分离到2株PRRSV，分别命名为PRRSV-SDA2和PRRSV—SDA3；基因测序结果显示PRRSV-SDA2全长为15349bp，PRRSV-SDA3全长为15350bp。通过与涵盖欧洲型和北美型的24个毒株全基因比对，发现这2个毒株均属于北美型HP—PRRSV，与HuN4毒株的同源性最高，均高达99．5％，其NSP2蛋白的482和533～561位缺失了30个氨基酸。成功分离的SDA2和SDA32个HP—PRRSV及完成的基因测序，为构建HP—PRRSV毒株的感染性克隆奠定了基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP—PRRSV) 分离与鉴定基因测序 NSP2

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适应无血清培养的HEK293细胞的建立

适应无血清培养的HEK293细胞的建立

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第九次学术研讨会

作者：孟其麟孙元李红梅王楠田大勇仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨 150001 延边大学农学院动物医学系，吉林延吉 130001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨 150001

本研究采用培养液渐进替换的方法获得了一株适应无血清培养的HEK293细胞(29SF)，经检测293SF细胞具有稳定的腺病毒增殖能力与外源蛋白表达能力;平均病变时间为97.00 h，比HEK293细胞缩短12.9％;毒价达到107.48TCIDmL，比HEK293细胞提高4... 详细信息

本研究采用培养液渐进替换的方法获得了一株适应无血清培养的HEK293细胞(29SF)，经检测293SF细胞具有稳定的腺病毒增殖能力与外源蛋白表达能力;平均病变时间为97.00 h，比HEK293细胞缩短12.9％;毒价达到107.48TCIDmL，比HEK293细胞提高43.3％;并且随着代数的提高稳定性良好，连续传16代后293sF细胞状态与易感性没有发生变化。此细胞系为腺病毒的无血清生产奠定材料基础。

关键词：腺病毒无血清培养蛋白表达稳定性

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表达猪圆环病毒2型Rep/Rep'蛋白的重组杆状病毒的构建及其鉴定

表达猪圆环病毒2型Rep/Rep'蛋白的重组杆状病毒的构建及其鉴定

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次人兽共患病学术研讨会暨第六届第十四次教学专业委员会

作者：刘丹陆月华吴洪丽危艳武唐青海王一平李胜斌刘建波魏萍刘长明东北农业大学动物医学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

摘要猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1编码的Rep蛋白与病毒复制相关,其与转录中剪切所得的小Rep'蛋白是病毒复制所必须的。为了构建表达PCV2-Rep和Rep'蛋白的重组杆状病毒,采用PCR法从病毒感染细胞中扩增Rep和Rep'蛋白基因,并克隆... 详细信息

摘要猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1编码的Rep蛋白与病毒复制相关,其与转录中剪切所得的小Rep'蛋白是病毒复制所必须的。为了构建表达PCV2-Rep和Rep'蛋白的重组杆状病毒,采用PCR法从病毒感染细胞中扩增Rep和Rep'蛋白基因,并克隆到杆状病毒转移载体(pBlueBac4.5/V5-His-TOPO)。将重组质粒与线性化杆状病毒DNA共转染昆虫细胞(Sf-21),经同源重组和蚀斑筛选,获得2株高效表达PCV2-Rep和Rep'蛋白的重组杆状病毒。经3次克隆的重组毒株毒价达7.0×10～7和3.0×10～7pfu/mL。蛋白表达分析表明,PCV2-Rep和Rep'蛋白分子量为36.0 ku和20.4ku,占总蛋白含量的6.2%和10.1%;这两种重组蛋白均可与PCV2抗体产生特异性反应,具有良好的免疫活性。用Ni-NTA亲和层析法纯化重组蛋白,其纯度达到92.5%和93.6%。本研究获得的PCV2-Rep和Rep'蛋白,为PCV2疫苗免疫与野毒感染之间鉴别诊断及病毒复制机制的研究奠定了基础。

关键词：猪圆环病毒2型 Rep/Rep'蛋白杆状病毒表达

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非洲猪瘟快速检测方法的建立及主要免疫原基因P54的原核表达

非洲猪瘟快速检测方法的建立及主要免疫原基因P54的原核表达

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中国畜牧兽医学会信息技术分会2012年学术研讨会

作者：王晓玲蔺文成胡峰王朝刘朝霞周顺毕克东刘业兵崔尚金中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室青岛农业大学动物科技学院中国兽药监察所

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、发热性、高度接触传染性疾病。世界动物卫生组织将其列为A类动物疫病,我国也将其列为一类动物疫病。本研究通过对非洲猪瘟主要免疫原基因P54基因序列进行分析,查找出P54蛋白的跨膜区在34-53氨... 详细信息

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、发热性、高度接触传染性疾病。世界动物卫生组织将其列为A类动物疫病,我国也将其列为一类动物疫病。本研究通过对非洲猪瘟主要免疫原基因P54基因序列进行分析,查找出P54蛋白的跨膜区在34-53氨基酸残基之间。应用PCR技术,扩增出P54基因跨膜信号肽缺失片段,经克隆和测序后构建出重组表达质粒pET-P54q,与P54全长序列的原核表达质粒pET-28b-P54,转化Rostta表达菌。重组菌经IPTG诱导,SDS-PAGE结果表明,pET-28b-P54的表达量较少,而pET-P54q表达量较高。用钴柱亲和层析纯化,得到跨膜信号肽缺失的P54融合蛋白。P54是主要免疫原,可以用于血清学检测,鉴于我国目前不能引进病毒,因此P54蛋白也具备作为亚单位疫苗的可能性。同时基于非洲猪瘟病毒(ASFV)P54基因,建立了纳米PCR检测方法,该方法特异性强,敏感性高,检测下限均达10～1copies/μL,是常规PCR检测技术敏感性的1000倍。对黑龙江、吉林和河南三个省份的8个地区临床送检的69份样品进行检测,检测结果显示均为阴性。

关键词：非洲猪瘟病毒 p54 纳米PCR 原核表达

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猪细小病毒非结构蛋白NS2和NS3基因的克隆与原核表达

猪细小病毒非结构蛋白NS2和NS3基因的克隆与原核表达

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第九次学术研讨会

作者：王晓玲蔺文成胡峰王朝刘朝霞周顺毕克东崔尚金中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨 150001 青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨 150001 青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109

通过重叠延伸PCR(SOE-PcR)方法扩增猪细小病毒BQ-C株的NS2、NS3基因，并将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)上，分别构建出重组表达质粒pEToNS2、pET-NS3。用不同浓度的IPTG进行诱导表达，***分析表明pET-NS2重组蛋白在IPTG浓度为1．2 m... 详细信息

通过重叠延伸PCR(SOE-PcR)方法扩增猪细小病毒BQ-C株的NS2、NS3基因，并将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)上，分别构建出重组表达质粒pEToNS2、pET-NS3。用不同浓度的IPTG进行诱导表达，***分析表明pET-NS2重组蛋白在IPTG浓度为1．2 mM、温度为37℃、诱导4 h时表达量最大，分子量为25 ku;pET-NS3重组蛋白在IPTG浓度为1 mM、温度为37℃、诱导4h时表达量最大，融合蛋白的分子质量为19．4ku。对表达的可溶性蛋白，用钴柱亲和层析纯化得到了NS2、NS3的重组蛋白，western blot鉴定表明，重组蛋白具有反应原性。本研究为猪细小病毒的自然免疫、发病机制、病毒复制、免疫机理等研究工作奠定了基础，未见以前有所报道。

关键词：猪细小病毒非结构蛋白基因克隆原核表达

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腺病毒/日本脑炎病毒复制子嵌合载体的构建

腺病毒/日本脑炎病毒复制子嵌合载体的构建

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第九次学术研讨会

作者：李红梅孙元亓文宝孟其麟田大勇廖明仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨 150001 华南农业大学兽医学院农业部兽用疫苗创制重点实验室，广东广州 510642 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨 150001 华南农业大学兽医学院农业部兽用疫苗创制重点实验室，广东广州 510642

日本脑炎病毒(JEV)复制子被证实是一种有前景的DNA疫苗栽体，但因其不稳定和递送效率低使得免疫效力不理想。本研究的目的是利用人复制缺陷型腺病毒(AdV)这个高效的递送系统来递送JEV复制子从而构建一个嵌合载体。将之前构建的含有增强... 详细信息

日本脑炎病毒(JEV)复制子被证实是一种有前景的DNA疫苗栽体，但因其不稳定和递送效率低使得免疫效力不理想。本研究的目的是利用人复制缺陷型腺病毒(AdV)这个高效的递送系统来递送JEV复制子从而构建一个嵌合载体。将之前构建的含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的J1三V复制子插入到经过改造后带有SwaI位点的的pShuttle-CMV载体中，再将来自pCI载体的嵌合内含子插入JEV复制子中，得到转移载体DSh-JEV-In-EGFP，经SwaI线形化后转化BJ5183感受态细胞，将所得重组腺粒经PacI线形化后转染HEK293细胞。传代直至出现细胞病变，得到含有表达EGFP的JEV复制子的重组腺病毒，命名为rAdV-JEV-In-EGFP。结果表明，pSh-JEV-In-EGFP在细菌中传20代仍然保持稳定，EGFP蛋白在rAdV-JEV—In—EGFP感染的HEK293细胞中稳定、高效地表达。腺病毒／日本脑炎病毒复制子嵌合载体有望用于开发能同时预防日本脑炎和其它传染性疾病的二价疫苗。

关键词：日本脑炎病毒复制子腺病毒嵌合载体内含子稳定性

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猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白与感染细胞核磷蛋白的共定位分析

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微生物学报 2011年第5期51卷 643-647页

作者：吕茂杰陈建飞时洪艳陈小金范秀萍申识川冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室哈尔滨150001

【目的】阐明猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白与病毒感染细胞核仁成分B23.1蛋白的共定位特征。【方法】分别参照GenBank中PEDV CV777株的N基因序列(AF353511)和编码人细胞核仁蛋白B23.1基因序列(BC050628.1),设计、合成扩增N基因和B2... 详细信息

【目的】阐明猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白与病毒感染细胞核仁成分B23.1蛋白的共定位特征。【方法】分别参照GenBank中PEDV CV777株的N基因序列(AF353511)和编码人细胞核仁蛋白B23.1基因序列(BC050628.1),设计、合成扩增N基因和B23.1基因的引物,利用RT-PCR技术扩增了N基因和Vero E6细胞的B23.1基因的cDNA,分别克隆到真核表达载体pAcGFP1-C1和pDsRed2-N1,获得重组质粒pAcGFP1-C1/N和pDsRed2-N1/B23.1,共转染Vero E6细胞。【结果】Western blots分析表明这些融合蛋白在转染的Vero E6细胞中表达;共聚焦显微镜技术分析表明在共转染Vero E6细胞中猪流行性腹泻病毒N蛋白与Vero E6细胞核磷蛋白B23.1发生共定位。【结论】为进一步鉴定PEDV N蛋白中核仁定位信号和N蛋白核仁定位机制提供可靠依据。

关键词：猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白核磷蛋白B23.1 共定位

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猪输血传播病毒(TTV)与猪圆环病毒混合感染的检测及TTV遗传变异分析

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中国预防兽医学报 2011年第1期33卷 6-10页

作者：刘建波郭龙军危艳武黄立平吴洪丽刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室哈尔滨150001

为了解我国猪群中猪输血传播病毒(TTV)与猪圆环病毒(PCV)混合感染情况,本研究采用PCR方法对采自14个省280份病料样品进行检测,结果显示,TTV1和TTV2阳性检出率分别为51.8%和28.2%,TTV1与TTV2混合感染率为18.2%;PCV1和PCV2阳性率分别为41... 详细信息

为了解我国猪群中猪输血传播病毒(TTV)与猪圆环病毒(PCV)混合感染情况,本研究采用PCR方法对采自14个省280份病料样品进行检测,结果显示,TTV1和TTV2阳性检出率分别为51.8%和28.2%,TTV1与TTV2混合感染率为18.2%;PCV1和PCV2阳性率分别为41.1%和37.5%,PCV1与PCV2混合感染率为19.6%;PCV2阳性样品中TTV1和TTV2混合感染率达75.0%。此外,对2株TTV1基因组进行测序,与GenBank中登录的6个TTV1序列比对,相似性结果为67.3%～95.1%;对4株TTV2基因组测序,与GenBank登录的4条TTV2序列比对,相似性为84.7%～90.4%;将TTV1与TTV2进行序列比对,相似性仅为44.0%。TTV1和TTV2基因高变区分别位于520 nt～2 594 nt和720 nt～2 170 nt;TTV1基因保守区位于1 nt～520 nt和2 595 nt～2 800 nt;而TTV2基因保守区位于1 nt～719 nt和2 171 nt～2 800 nt。以上结果表明,我国猪群中存在TTV与PCV2的混合感染,并且两种病毒混合感染引起的相关疾病可能存在协同致病性;TTV1和TTV2基因型差异较大,具有遗传变异多样性的特点。

关键词：猪输血传播病毒猪圆环病毒混合感染遗传变异分析

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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HBR变异株第125代的毒力试验

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中国兽医科学 2011年第2期41卷 152-158页

作者：危艳武刘长明范培虎吴洪丽温士刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

从临床病例中分离到1株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株HBR,经细胞传代和蚀斑克隆获得了1株增殖性能稳定的传代毒株。为了检测该毒株在Marc-145细胞传代过程中毒力的变化,用PRRSV-HBR株第125代培养物(毒价为107.5 TCID50/... 详细信息

从临床病例中分离到1株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株HBR,经细胞传代和蚀斑克隆获得了1株增殖性能稳定的传代毒株。为了检测该毒株在Marc-145细胞传代过程中毒力的变化,用PRRSV-HBR株第125代培养物(毒价为107.5 TCID50/mL)经肌肉注射和滴鼻途径接种18头35日龄PRRSV抗体阴性猪,同时设未接种对照组。结果试验猪未出现明显的临床症状。用RT-PCR法检测试验猪血清,从第3天开始出现阳性,第7～14天达到高峰,第28天后转为阴性。对同一时间迫杀的试验猪检测各脏器组织中的病毒抗原分布情况,结果表明,感染后第7～14天试验猪多数脏器呈阳性反应,第21～42天病毒集中在脾、腹股沟淋巴结、颌下淋巴结等组织。病理学观察发现,第7～14天试验猪淋巴结及肺出现轻度病变。动物感染试验表明,尽管试验猪未显示明显的临床症状,但从病毒血症、病毒体内分布、病理变化等方面看,该毒株仍然具有一定的毒力,用于弱毒疫苗的研制还有待进一步驯化致弱。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒变异毒株细胞传代毒力试验

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猪轮状病毒Rotavirus A pig/China/NMTL/2009/G9P株的分离与鉴定

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中国预防兽医学报 2011年第9期33卷 681-684页

作者：时洪艳陈建飞王承宝张志榜石达冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

A群轮状病毒(GAR)是引起人类和多种动物腹泻的主要病原体,病原的分离与鉴定是轮状病毒(RV)流行病学、病原学等研究的基础。本研究采用接种MA104细胞的方法,从内蒙古某猪场患病猪腹泻粪便中分离一株病毒,经3次蚀斑克隆纯化后,采用电镜观... 详细信息

A群轮状病毒(GAR)是引起人类和多种动物腹泻的主要病原体,病原的分离与鉴定是轮状病毒(RV)流行病学、病原学等研究的基础。本研究采用接种MA104细胞的方法,从内蒙古某猪场患病猪腹泻粪便中分离一株病毒,经3次蚀斑克隆纯化后,采用电镜观察、PCR鉴定和序列测定进行分析,结果表明该分离株为猪轮状病毒(PoRV)。致病性试验表明该分离株能够引起仔猪急性腹泻,RT-PCR扩增其VP4、VP6和VP7的基因节段并进行序列测定,按照A群RV的最新分类方法,确定该分离株的VP6、VP7和VP4基因型分别为I5型、G9型和P[23]型。因此,将该分离株命名为Rotavirus A pig/China/NMTL/2009/Q9P[23]。

关键词：猪轮状病毒分离鉴定

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