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养猪 2014年第5期 100-104页

作者：马兴杰仇铮崔宇超王晓玲张晶朱宝孔苗苗罗亚坤崔尚金中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

试验建立了鉴别猪伪狂犬病病毒（PRV）强弱毒高效纳米PCR检测方法，并对相关条件进行优化，组装了试剂盒。根据PRV保守序列设计3对引物分别扩增PRV基因组的gB（431 bp）、gE（316 bp）和gG（202 bp）3个基因，用于区分PRV强毒与基因缺... 详细信息

试验建立了鉴别猪伪狂犬病病毒（PRV）强弱毒高效纳米PCR检测方法，并对相关条件进行优化，组装了试剂盒。根据PRV保守序列设计3对引物分别扩增PRV基因组的gB（431 bp）、gE（316 bp）和gG（202 bp）3个基因，用于区分PRV强毒与基因缺失毒株，优化反应条件后建立了纳米PCR检测PRV强弱毒的方法并组装试剂盒，对试剂盒进行了特异性、敏感性、批内批间可重复性及保存期评估试验，并对临床样品进行检测。特异性试验表明，此试剂盒对于PRV能够扩增出431（gB）、316（gE）和202 bp（gG）的目的片段，对于PRV-Bartha-K61能够扩增出431和202 bp的目的片段，对于猪捷申病毒、非洲猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒及大肠杆菌等DNA或cDNA均未扩增出条带。敏感性试验表明，此试剂盒的方法比常规PCR方法敏感100-1000倍，最低核酸拷贝数检出量可以达到101 copy/μL数量级。试剂盒的批内、批间检测结果无明显差异，稳定性良好。-20℃至少可保存12个月。在对中国黑龙江、吉林等7个省市的临床送检的117份样品进行检测，结果显示，PRV强毒阳性率为51%，阴性率为49%，未发现有弱毒感染。鉴别PRV强弱毒纳米PCR试剂盒的研制，对PRV感染的早期检测、野毒株和疫苗株的鉴别、疾病控制等都有重要意义，而且也可以用于其他动物PRV感染的检测和早期诊断。

关键词：检测猪伪狂犬病病毒

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猪IFN-γ、IL-2及GM-CSF对猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白亚单位疫苗免疫增强作用的研究

猪IFN-γ、IL-2及GM-CSF对猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白亚单位疫苗...

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：王一平刘丹郭龙军危艳武吴红丽刘建波李胜斌黄立平刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原,该病原现已在世界各地广泛流行,给养猪业造成巨大经济损失.PCV2 Cap蛋白是病毒的主要免疫原性蛋白,能诱导产生PCV2特异性中和抗体和保护性免疫力,是研制PCV2基因工... 详细信息

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原,该病原现已在世界各地广泛流行,给养猪业造成巨大经济损失.PCV2 Cap蛋白是病毒的主要免疫原性蛋白,能诱导产生PCV2特异性中和抗体和保护性免疫力,是研制PCV2基因工程疫苗的理想靶抗原.研究表明,IFN-γ、IL-2和GM-CSF等细胞因子佐剂对疫苗具有免疫增强作用,可显著增强疫苗的免疫保护效力.本研究采用细胞因子佐剂与PCV2-Cap蛋白组合的策略来研制预防PCV2感染的新型基因工程亚单位疫苗,目的是验证猪源WN-γ(PoIFN-γ)、IL-2 (PoIL-2)和GM-CSF(PoGM-CSF)这3种细胞因子能否增强PCV2-Cap蛋白亚单位疫苗的免疫效力. 研究表明，用PoIFN-与PCV2-Cap蛋白混合免疫时，PoIFN-能显著增强PCV2-Cap蛋白亚单位疫苗的免疫保护效力，但以Cap-PoIFN-γ融合蛋白免疫时，PoIFN-对PCV2-Cap蛋白无免疫增强作用;用PoIL-2或PoGM-CSF与PCV2-Cap蛋白混合免疫或以Cap-PoGM-CSF融合蛋白免疫时，PoIL-2和PoGM-CSF对PCV2-Cap蛋白亚单位疫苗的抗体应答均无增强作用，但可促进免疫应答向Th1型免疫应答转变，从而增强疫苗的免疫保护效力，然而以Cap-PoIL-2融合蛋白免疫时，PoIL-2对PCV2-Cap蛋白无免疫增强作用。

关键词：对猪圆环病毒2型 Cap蛋白亚单位疫苗免疫增强作用

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猪鼻支原体的分离鉴定及其对巴马猪的致病性试验

猪鼻支原体的分离鉴定及其对巴马猪的致病性试验

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：危艳武夏伟刘长明张志慧黄立平刘建波吴洪丽刘丹李胜斌王一平张辉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为了探索猪鼻支原体(Mhr)对仔猪的致病性,本试验从临床呼吸道疾病的患猪肺脏分离到一株Mhr,命名为Mhr-DL株.对该菌株16S rRNA序列分析证实,它与GenBank下载的Mhr(AB680688)、猪肺炎支原体(Mhp:NR_074745)和猪滑液支原体(My:KC512403)的... 详细信息

为了探索猪鼻支原体(Mhr)对仔猪的致病性,本试验从临床呼吸道疾病的患猪肺脏分离到一株Mhr,命名为Mhr-DL株.对该菌株16S rRNA序列分析证实,它与GenBank下载的Mhr(AB680688)、猪肺炎支原体(Mhp:NR_074745)和猪滑液支原体(My:KC512403)的同源性分别为99.3％、92.8％和74.0％.电镜负染观察该菌为多形性,大小为500 nm～600 nm.取Mhr-DL株培养物(1.8×109 ccu/mL)经腹腔和气管途径接种SPF小型巴马猪,临床症状表现为精神沉郁、粪便干燥、食欲不振、结膜炎、体温高达41.6℃;剖检病理表现为肺脏、肝脏、脾脏等器官纤维渗出,淋巴结充血肿胀、胸膜炎、腹膜炎、肺脏呈虾内样病变.菌株核酸检测发现,肺脏和扁桃体检出率最高;组织病理表现为间质性肺炎,淋巴细胞增生、坏死、崩解,肾毛细血管淤血,小肠固有层大量嗜酸性粒细胞浸润、肠绒毛结构不完整,心脏小血管淤血,脾白髓内淋巴细胞增生.本研究获得的Mhr-DL菌株对巴马猪具有显著的致病性,为今后深入开展Mhr的致病机理和防控技术的研究奠定了基础.

关键词：巴马猪猪鼻支原体分离鉴定致病性分析

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猪圆环病毒基因组复制分子机制研究进展

猪圆环病毒基因组复制分子机制研究进展

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：张辉唐青海刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

猪圆环病毒(PCV)基因组为单链、环状***基因组在自身编码蛋白Rep和Rep'及宿主分子的参与下以滚环复制机制(Rolling-circle replication,RCR)进行复制.Rep和Rep'结合到PCV部分复制起点组成的双链DNA片段上,但这2种蛋白的结合位... 详细信息

猪圆环病毒(PCV)基因组为单链、环状***基因组在自身编码蛋白Rep和Rep'及宿主分子的参与下以滚环复制机制(Rolling-circle replication,RCR)进行复制.Rep和Rep'结合到PCV部分复制起点组成的双链DNA片段上,但这2种蛋白的结合位点有细微差别.在DNA合成期间,PCV DNA复制起始区域(含有一对反向重复序列)存在于一个非稳定的四链结构中(熔炉模型),这一结构能使回文链和互补链同时作为DNA合成起始与终止的模板,这一机制对于PCV DNA复制过程中的校对和基因转换非常重要.本文全面综述了近年来有关PCV DNA复制的分子机制研究进展,以期为相关研究者提供参考.

关键词：猪圆环病毒基因组复制脱氧核糖核酸分子机制

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猪圆环病毒2型Cap蛋白保守序列突变可降低其表达量并阻碍Cap与Rep蛋白共定位抑制病毒复制

猪圆环病毒2型Cap蛋白保守序列突变可降低其表达量并阻碍Cap与Rep...

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者： HUANG Li-ping Nicolaas R.C.Van Renne Dipongkor Saha Jan Van Doorsselaere Uladzimir Karniychuk LIU Chang-ming Hans J.Nauwynck Laboratory of Virology Faculty of Veterinary Medicine Ghent University Merelbeke Belgium 中国农业科学院 Laboratory of Virology Faculty of Veterinary Medicine Ghent University Merelbeke Belgium Department of Health Care and Biotechnology KATHO Catholic University College of South-West Flander 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室哈尔滨150001

猪圆环病毒2型(PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原,该病给养猪业带来巨大的经济损失.PCV2 Cap蛋白上保守序列97RIRKVKV103可能是该病毒的受体结合位点,然而Cap蛋白的结构显示该序列位于病毒粒子的内部,因此该序列作为受... 详细信息

猪圆环病毒2型(PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原,该病给养猪业带来巨大的经济损失.PCV2 Cap蛋白上保守序列97RIRKVKV103可能是该病毒的受体结合位点,然而Cap蛋白的结构显示该序列位于病毒粒子的内部,因此该序列作为受体结合位点的功能受到质疑.该序列在PCV2毒株之间高度保守,可能具有重要功能.本研究旨在阐明该保守序列在PCV2复制过程中的功能. 首次阐明了PCV2 Cap蛋白保守序列37RIRKVKV103在PCV2复制过程中的功能。该保守序列对PCV2的复制至关重要，该序列突变之后导致:(1)Cap蛋白mRNA及其蛋白量明显降低;(2)阻碍Cap和Rep蛋白共定位;(3)最终产生非活性的病毒。本研究为Cap和Rep蛋白相互作用提供新的信息，而且推测这2种蛋白之间的相互作用是病毒组装所必需的。

关键词：猪圆环病毒2型 Cap蛋白保守序列突变表达量病毒复制抑制

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一株新奇的抗副猪嗜血杆菌单克隆抗体识别B细胞表位的鉴定及应用

一株新奇的抗副猪嗜血杆菌单克隆抗体识别B细胞表位的鉴定及应用

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：杨玉菊郑楠符芳柴政姜福成王香玲张雪云王卓李曦哈尔滨学院黑龙江哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 黑龙江八一农垦大学黑龙江大庆163319 哈尔滨师范大学黑龙江哈尔滨150080

为筛选具有临床诊断价值的副猪嗜血杆菌(***)单克隆抗体(MAb),本研究采用***5型强毒株(HPS-5)免疫BALB/c小鼠,利用常规细胞融合技术制备了1株稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株.Western blot 结果表明该MAb能够特异性识别所有***标准菌株;免疫... 详细信息

为筛选具有临床诊断价值的副猪嗜血杆菌(***)单克隆抗体(MAb),本研究采用***5型强毒株(HPS-5)免疫BALB/c小鼠,利用常规细胞融合技术制备了1株稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株.Western blot 结果表明该MAb能够特异性识别所有***标准菌株;免疫沉淀技术与蛋白质谱分析显示该MAb所识别蛋白为ATP结合盒转运蛋白(ABCT)家族的寡肽透过酶(OppA);利用MAb对噬茵体12肽库进行淘选,8个阳性噬菌体克隆展示有"KTPAE-R"保守序列,对应于*** SH29755株和SH0165株的469位～475位的氨基酸残基.对OppA氨基酸序列比对结果表明***与其它10种猪常见细菌病病原序列一致性为9.1％～74.5％,本研究结果为进一步研究***感染的病原学诊断建立了良好的基础.

关键词：副猪嗜血杆菌单克隆抗体 B细胞表位病原学诊断

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与猪圆环病毒2型基因组茎环结构相互作用的宿主细胞蛋白的筛选

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中国兽医科学 2013年第12期43卷 1211-1216页

作者：张辉唐青海危艳武黄立平张志慧刘建波吴洪丽刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

利用酵母单杂交技术对猪圆环病毒2型(PCV2)基因组复制起始处茎环结构序列与PK-15细胞中的互作蛋白进行了筛选和鉴定。首先将合成的PCV2复制起始处的茎环结构序列整合到酵母染色体中构建诱饵酵母菌株;采用SMART技术合成PK-15细胞cDNA文库... 详细信息

利用酵母单杂交技术对猪圆环病毒2型(PCV2)基因组复制起始处茎环结构序列与PK-15细胞中的互作蛋白进行了筛选和鉴定。首先将合成的PCV2复制起始处的茎环结构序列整合到酵母染色体中构建诱饵酵母菌株;采用SMART技术合成PK-15细胞cDNA文库,将总cDNA与pGADT7-Rec表达载体共同转化酵母诱饵菌株,通过同源重组在酵母细胞内同步进行cDNA文库的构建,以药物筛选阳性克隆;通过酵母菌落PCR得到阳性克隆中的cDNA插入片段,通过序列分析对此予以确认。本试验成功地构建了酵母单杂交文库,筛选出1.01×106个酵母克隆,其中196个为阳性克隆。经PCR产物测序,并通过NCBI Blast法进行序列比对,确定有4种蛋白可与PCV2基因组茎环序列发生作用。本研究从宿主细胞cDNA文库中筛选到4种可与PCV2基因组茎环序列发生作用的蛋白,为下一步阐明这些宿主蛋白对PCV2复制的调节作用奠定了基础。

关键词：猪圆环病毒2型茎环结构宿主细胞互作蛋白

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猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白与BCCIP蛋白相互作用的鉴定

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中国预防兽医学报 2013年第5期35卷 341-345页

作者：尹曼曼郭东伟刘琴芳张枫张利杰李江南翁长江中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核衣壳(N)蛋白在病毒粒子组装和释放过程中发挥重要的作用。为筛选N蛋白与宿主细胞相互作用的蛋白,本研究分离健康猪肺泡巨噬细胞(PAM),构建了PAM的酵母cDNA文库,利用酵母双杂交方法筛选其中与PRRSV N蛋... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核衣壳(N)蛋白在病毒粒子组装和释放过程中发挥重要的作用。为筛选N蛋白与宿主细胞相互作用的蛋白,本研究分离健康猪肺泡巨噬细胞(PAM),构建了PAM的酵母cDNA文库,利用酵母双杂交方法筛选其中与PRRSV N蛋白相互作用的蛋白,结果获得3个阳性克隆。经测序并利用Blast方法比对GenBank数据库,筛选得到克隆插入的cDNA均与BCCIP(BRCA2 and CDKN1A interactingprotein)基因的1 bp～396 bp核酸序列一致。经酵母回返验证试验、GST-pulldown和免疫共沉淀试验验证了N蛋白与BCCIP之间的特异性相互作用,共定位试验显示N蛋白与BCCIP共定位于细胞核和细胞浆中。本研究鉴定了新的与PRRSV N蛋白相互作用的宿主蛋白BCCIP,BCCIP是否通过与N蛋白的相互作用参与PRRSV复制还有待深入研究。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 N蛋白 BCCIP 相互作用

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猪外周血单个核细胞cDNA酵母表达文库的构建及与猪瘟病毒E2蛋白相互作用细胞蛋白的筛选

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中国预防兽医学报 2013年第9期35卷 707-710页

作者：廖亚金李素贺番何文瑞董泓冯烁孙元仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为研究猪瘟病毒(CSFV)蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用,本研究通过SMART技术合成猪外周血单个核细胞(PBMC)双链cDNA,以携带与载体pGADT7-Rec重组位点同源序列的特异引物经long-distance PCR扩增双链cDNA。纯化双链cDNA并与载体pGADT7-... 详细信息

为研究猪瘟病毒(CSFV)蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用,本研究通过SMART技术合成猪外周血单个核细胞(PBMC)双链cDNA,以携带与载体pGADT7-Rec重组位点同源序列的特异引物经long-distance PCR扩增双链cDNA。纯化双链cDNA并与载体pGADT7-Rec共转化酵母菌株Y187,经同源重组构建PBMC cDNA酵母表达文库。以CSFV E2蛋白为诱饵进行酵母双杂交筛选,得到阳性克隆根据序列比对分析结果,进一步进行共转化验证。结果显示筛选到17个与CSFV E2蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,基因注释(GO)分析表明这些蛋白分别参与免疫、代谢、细胞生长与增殖、生物调节等过程,为研究它们与CSFV E2的相互作用奠定了基础。

关键词：猪瘟病毒 PBMC cDNA文库酵母双杂交 E2蛋白

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猪源抗体基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

猪源抗体基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

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2014年中国畜牧兽医学会养猪学分会学术研讨会

作者：王香玲柴政田华彬符芳姜福成郑楠张雪云郭佃磊李昆鹏李曦中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨 150001 哈尔滨师范大学生命科学与技术学院黑龙江哈尔滨 150025 黑龙江八一农垦大学黑龙江大庆 163319

为了制备原核表达猪源单链重组抗体,本实验利用FITC-山羊抗猪IgG标记猪外周血淋巴细胞,通过FACS的方法筛选出IgG+B细胞.以IgG+B细胞为模板,利用RT-PCR技术扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL).测序之后,将扩增的可变区与本实验室保... 详细信息

为了制备原核表达猪源单链重组抗体,本实验利用FITC-山羊抗猪IgG标记猪外周血淋巴细胞,通过FACS的方法筛选出IgG+B细胞.以IgG+B细胞为模板,利用RT-PCR技术扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL).测序之后,将扩增的可变区与本实验室保存的猪源抗体恒定区连接.通过Linker序列[(Gly4Ser)3],最终将重链和轻链连接,构成H-linker-L.将该序列连接到原核表达载体pET-28a进行原核表达,纯化.Western-blot鉴定结果表明,该重组蛋白能够与兔抗猪IgG二抗反应.这说明构建的重组抗体确实为猪源抗体.

关键词：猪源抗体基因克隆大肠杆菌 B淋巴细胞

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