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2007年中国畜牧兽医学会生物制品学分会中国微生物学会兽医微生物学专业委员会学术研讨会

作者：华荣虹童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室哈尔滨 150001

扩增并克隆了编码SARS-CoV S蛋白中包含多个抗原表位的第539～630氨基酸残基区域的基因片段。基因片段经酶切处理后插入表达载体pGEX-6p-1的Bam HI和XhoI位点之间，构建成融合表达质粒，转化宿主菌BL21经IPTG诱导后融合基因得到了表达... 详细信息

扩增并克隆了编码SARS-CoV S蛋白中包含多个抗原表位的第539～630氨基酸残基区域的基因片段。基因片段经酶切处理后插入表达载体pGEX-6p-1的Bam HI和XhoI位点之间，构建成融合表达质粒，转化宿主菌BL21经IPTG诱导后融合基因得到了表达，表达产物可用谷胱甘肽sepharose 4B RediPack亲和层析柱纯化。用5份SARS患者康复期血清对表达融合蛋白进行ELISA和免疫印迹试验分析融合蛋白的免疫反应性，结果表明重组融合抗原在ELISA和免疫印迹试验中与全部5份SARS患者康复期血清均具有良好的免疫反应性。试验结果提示该SARs-CoV S蛋白第539～630氨基酸残基区域可作为SARS诊断抗原。

关键词：冠状病毒抗原表位免疫反应免疫印迹融合蛋白 SARS病毒

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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR鉴别诊断方法的建立

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR鉴别诊断方法的建立

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第三次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会

作者：郝晓芳周艳君田志军韦天超安同庆彭金美华荣虹童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨 150001

2006年5月以来,我国部分猪场爆发一种以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染性疾病,经病原分离及分子流行病学分析证明是由一种带有nsp2部分缺失的对猪呈高致病性的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的。本实验参考GenBank发表的以... 详细信息

2006年5月以来,我国部分猪场爆发一种以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染性疾病,经病原分离及分子流行病学分析证明是由一种带有nsp2部分缺失的对猪呈高致病性的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的。本实验参考GenBank发表的以及本实验室分离鉴定PRRSV的nsp2基因序列,在紧靠上述nsp2缺失区的两端的保守区设计并合成了一对引物,建立了一种PRRSV的RP-PCR检测方法。该方法扩增高致病性PRRSV基因组获得230bp的片段,扩增经典型PRRSV时则获得320bp的片段,通过RT-PCR产物大小可将二者区分开来。通过大量临床病料的检测,配合PCR产物测序验证,结果表明该方法简便、快速、特异,可以鉴别高致病性PRRSV,为进一步的PRRS流行病学研究提供了重要的技术手段。

关键词：高致病性传染病猪繁殖与呼吸综合征病毒病原分离基因缺失 RT-PCR检测鉴别诊断

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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR鉴别诊断方法的建立

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR鉴别诊断方法的建立

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2007年中国畜牧兽医学会生物制品学分会中国微生物学会兽医微生物学专业委员会学术研讨会

作者：郝晓芳周艳君田志军韦天超安同庆彭金美华荣虹童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨 150001

2006年5月以来，我国部分猪场爆发一种以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染性疾病，经病原分离及分子流行病学分析证明是由一种带有nsp2部分缺失的对猪呈高致病性的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的。本实验参考GenBank发表的... 详细信息

2006年5月以来，我国部分猪场爆发一种以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染性疾病，经病原分离及分子流行病学分析证明是由一种带有nsp2部分缺失的对猪呈高致病性的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的。本实验参考GenBank发表的以及本实验室分离鉴定的PRRSV的nsp2基因序列，在紧靠上述nsp2缺失区的两端的保守区设计并合成了一对引物，建立了一种PRRSV的RT-PCR检测方法。该方法扩增高致病性PRRSV基因组获得230bp的片段，扩增经典型PRRSV时则获得320bp的片段，通过RT-PCR产物大小可将二者区分开来。通过大量临床病料的检测，配合PCR产物测序验证，结果表明该方法简便、快速、特异，可以鉴别高致病性PRRSV，为进一步的PRRS流行病学研究提供了重要的技术手段。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒基因缺失鉴别诊断

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乙型脑炎病毒E蛋白的分段表达与免疫性分析

乙型脑炎病毒E蛋白的分段表达与免疫性分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

作者：闫丽萍华荣虹亓文宝童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室华南农业大学兽医学院

流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)可导致中枢神经系统损伤,且人畜共患,是世界范围内急性病毒型脑炎流行的最主要形式之一。猪患流行性乙型脑炎的主要表现为怀孕母猪流产、产死胎或弱仔,公猪则患睾丸炎,仔猪呈神经症状,常使养... 详细信息

流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)可导致中枢神经系统损伤,且人畜共患,是世界范围内急性病毒型脑炎流行的最主要形式之一。猪患流行性乙型脑炎的主要表现为怀孕母猪流产、产死胎或弱仔,公猪则患睾丸炎,仔猪呈神经症状,常使养猪业遭受巨大损失。目前尚无简便快速的诊断方法和特效的治疗药物。E蛋白是主要的毒粒抗原,参与病毒复制的许多重要过程,包括受体结合、膜融合、毒粒包装等。E蛋白上有特异性抗体的中和表位,可诱导免疫动物产生中和抗体。E蛋白在体外进行高效表达不仅有利于该蛋白结构与功能的深入研究,而且有利于开发新型疫苗(亚单位疫苗)和诊断试剂的开发。为了对JEV E蛋白的免疫特性进行分析,本试验依据E蛋白的空间结构特点把全长E基因分成3段,成功地在***中高效融合表达EF1、EF2、EF3蛋白,通过Western blot和ELISA鉴定确定EF1、EF2融合蛋白与JEV阳性血清反应。且GST-EF2反应信号最强,而对照GST和GST-EF3没有反应。由于EF1片段长为873bp,所以将其进一步细分(EF1-1、EF1-2、EF1-3、EF1-4),每段间约有20bp的重叠,进行融合表达及检测,结果发现4段均与JEV阳性血清有强的反应性。通过本实验证明了EF1、EF2片段1～402aa是E蛋白中的免疫优势决定区,包括了12个Cys的保守区及域I、域П和域Ⅱ3个主要抗原域。通过Western blot和ELISA鉴定证明了表达的蛋白具有较好的抗原性。本研究结果对进一步进行鉴定E蛋白的抗原表位和基于这些抗原表位序列的应用研究具有重要意义。

关键词：乙型脑炎病毒 ELISA Western 抗原表位阳性血清分段表达免疫性

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乙型脑炎病毒E蛋白结构域Ⅲ的抗原表位鉴定

乙型脑炎病毒E蛋白结构域Ⅲ的抗原表位鉴定

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

作者：闫丽萍华荣虹亓文宝童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室华南农业大学兽医学院

流行性乙型脑炎（Epidemic Encephalitis B;Japanese Encephalitis,JE）简称乙脑,是由乙型脑炎病毒（Epidemic Encephalitis B Virus;Japanese Encephalitis Virus,JEV）引起的中枢神经系统疾病,由蚊虫传播,主要流行于东亚和东南亚各国,近年来其流行分布范围有不断扩大的趋势。感染后死亡率高,愈后患者会留下不同程度的后遗症。JEV的囊膜蛋白（即E蛋白）是乙脑病毒的主要结构蛋白,它在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。1999年Kolaskar等[1]通过对E蛋白抗原表位的三维结构预测,认为E蛋白的三维结构主要由3个结构域组成,其中结构域Ⅱ独立地在病毒表面折叠成为免疫球蛋白样结构,由于这种构象,许多抗原中和表位都集中于此结构域。目前对于E蛋白的结构域Ⅱ（EⅡ）的抗原表位还不清楚,为了对结构域Ⅱ进行抗原表位研究,首先原核克隆表达了EⅡ,结果表明,原核表达产物可被抗JEV阳性血清识别。并且利用一组覆盖该区域的短肽融合蛋白通过蛋白免疫印迹和ELISA反应,进行表位鉴定,同时也对结构域Ⅱ的免疫特性进行了研究。为了对EⅡ（292～402氨基酸残基）这一长111氨基酸残基的片段进行抗原表位作图,设计了一套覆盖整个EⅡ的短肽组,命名为E3750,这些短肽长为16个氨基酸,相互重叠8个氨基酸。为了表达这些短肽,设计合成了14对寡核苷酸链。在编码链的5'端引入BamH I位点,在3'端引入XhoI位点,反义链与编码链互补,且退火后形成的双链DNA正向为BamH I粘性末端,反向为XhoI粘性末端,可直接与酶切线性化处理的载体pGEX-6P-1相连接。重组子经酶切鉴定后命名为pGEX-E37至pGEX-E50,各重组质粒送北京英骏生物技术有限公司测序以验证序列。将重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21,进行诱导表达及SDS-PAGE电泳分析各短肽蛋白表达情况。从分析结果看各融合蛋白均获得了表达,可溶性短肽融合蛋白用谷胱甘肽Sepharose4B RediPack亲和层析柱（Pharmacia Biotech）纯化,不溶性短肽融合蛋白经超声波洗涤纯化.纯化样品与1:100稀释的JEV阳性血清进行蛋白质免疫印迹和ELISA分析,结果表明,表达融合蛋白GST-E39（305～320）,GST-E45（353～368）,GST-E47（369～384）,GST-E48（377～392）,和E49（385～402）能被JEV阳性血清所识别。由于GST-E47、GST-E48、GST-E49是一个连续的氨基酸序列,为了确定抗原表位的主要功能性区域,将该段氨基酸进一步划分,通过蛋白质印迹结果表明该区域含有两个抗原表位,即GST-E48-1（377～384）、GST-E49（385～402）。同时,由于鉴定出的表位E45（353～368）的融合蛋白以包涵体的形式存在对E45进行相应的细分,蛋白质印迹结果发现E45-1（355～366）能被JEV阳性血清所识别。14个相互重叠且覆盖EⅡ全长区域的短肽融合蛋白经JEV阳性血清免疫印迹及ELISA扫描,以及通过免疫印迹进一步精确定位后,最终确定GST-E39、GST-E45-1、GST-E48-1、GST-E494个抗原表位,表位作图如下其结果对进一步分析JEV E蛋白结构与功能以及诊断试剂和基因工程疫苗的研究有重要意义。

关键词：抗原表位结构域免疫印迹 ELISA 乙型脑炎病毒阳性血清 JEV

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流行性乙型脑炎病毒E蛋白结构域Ⅲ的抗原表位鉴定与功能研究

流行性乙型脑炎病毒E蛋白结构域Ⅲ的抗原表位鉴定与功能研究

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第三次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会

作者：闫丽萍华荣虹亓文宝童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨 150001 东北农业大学黑龙江哈尔滨 150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨 150001 华南农业大学兽医学院广东广州510642

流行性乙型脑炎病毒(JEV)是一种严重危害人畜健康的虫媒病毒.E蛋白是该病毒的主要结构蛋白.E蛋白在介导病毒与宿主细胞的吸附,融合;决定病毒的血凝活性、细胞嗜性以及决定病毒毒力和诱导宿主产生保护性免疫反应中起重要作用.E蛋白结构域... 详细信息

流行性乙型脑炎病毒(JEV)是一种严重危害人畜健康的虫媒病毒.E蛋白是该病毒的主要结构蛋白.E蛋白在介导病毒与宿主细胞的吸附,融合;决定病毒的血凝活性、细胞嗜性以及决定病毒毒力和诱导宿主产生保护性免疫反应中起重要作用.E蛋白结构域Ⅲ(EⅢ)是诱导中和抗体的重要区域.为确定乙型脑炎EⅢ的抗原表位,本实验首先克隆了JEV疫苗株SA14-14-2的EⅢ区域,并用pGEX-6P-1载体进行融合表达,免疫印迹分析表明,该融合蛋白能被抗JEV血清识别.为了进一步对该结构域进行抗原表位作图,设计了14个覆盖该区域且部分重叠的短肽.将各短肽与GST进行融合表达与纯化.短肽融合蛋白经JEV阳性血清免疫印迹和ELISA免疫反应性扫描分析,结果鉴定出E39(<'305>TEKFSFAKNPVDTGHG<'320>)、E45-1(<'355>VTVNPFVATSSA<'366>)、E48-1(<'377>PFGDSYIV<'384>)和E49(<'385>VGRGDKQINHHWHKAG<'400>)四个线性抗原表位.分别将4个抗原表位融合蛋白免疫小鼠,制备各抗原表位单因子血清,结果经体外病毒中和试验表明E39为具有病毒中和活性的抗原表位.本试验结果为进一步分析JEV E蛋白结构与功能以及诊断试剂和表位疫苗的研究提供了重要工作基础.

关键词：流行性乙型脑炎病毒 E蛋白结构域Ⅲ 抗原表位鉴定免疫印迹表位疫苗

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乙型脑炎病毒E蛋白结构域Ⅲ的抗原表位鉴定

乙型脑炎病毒E蛋白结构域Ⅲ的抗原表位鉴定

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2007年中国畜牧兽医学会生物制品学分会中国微生物学会兽医微生物学专业委员会学术研讨会

作者：闫丽萍华荣虹亓文宝童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨 150001 华南农业大学兽医学院广东广州510642

流行性乙型脑炎是一种由蚊虫传播的病毒性人兽共患病，乙型脑炎病毒是该病毒的病原E蛋白是乙型脑炎病毒的主要结构蛋白，它在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。而E蛋白结构域Ⅲ是诱导中... 详细信息

流行性乙型脑炎是一种由蚊虫传播的病毒性人兽共患病，乙型脑炎病毒是该病毒的病原E蛋白是乙型脑炎病毒的主要结构蛋白，它在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。而E蛋白结构域Ⅲ是诱导中和抗体的重要区域。为了分析鉴定乙型脑炎E蛋白结构域Ⅲ的抗原表位，首先克隆并用pGEX-6P-1载体融合表达了乙型脑炎病毒疫苗株sA14-14-2的该区域，通过免疫印迹分析表明，该区域融合蛋白能被JEV阳性血清所识别。为了对这一区域进行抗原表位作图，进一步设计了一套14个覆盖该区域的部分重叠短肽，并进行了GST融合表达，用JEV阳性血清对14个融合蛋白进行免疫印迹和ELISA免疫反应性分析，鉴定出4个线性抗原表位E39(305TEKFSFAKNPVDTGHG320)、FA5-1(355VTVNPFVATSSA 366)、E48-l(377PFGDSYIV384)、E49(385VGRGDKQINHHWHKAG400)。本试验结果对进一步分析乙脑病毒E蛋白结构与功能以及诊断试剂和表位疫苗的研究有重要意义。

关键词：乙型脑炎病毒抗原表位人兽共患病免疫反应

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猪γ干扰素基因真核重组表达质粒的构建及活性测定

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北京林业大学学报 2006年第S2期28卷 101-104页

作者：张立娜刘培欣曹殿军闫丽辉贾竞波危艳武东北林业大学野生动物资源学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室

以含有全长猪γ干扰素基因的质粒为模板,通过PCR方法扩增猪γ干扰素并引入酶切位点,酶切后与PCI真核表达载体连接在一起,测序后经比较,所扩增序列同Genebank报道的IFN-γ序列同源性为99·8%.将重组质粒转染PK细胞,检测所转染的pIFN... 详细信息

以含有全长猪γ干扰素基因的质粒为模板,通过PCR方法扩增猪γ干扰素并引入酶切位点,酶切后与PCI真核表达载体连接在一起,测序后经比较,所扩增序列同Genebank报道的IFN-γ序列同源性为99·8%.将重组质粒转染PK细胞,检测所转染的pIFN-γ的抗病毒活性.试验结果表明,转染pIFN-γ试验组与正常细胞接毒对照组比较有显著差异,说明所构建的重组质粒转染后具有抗病毒作用.

关键词：猪γ干扰素真核表达活性测定

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PRRSV-IPMA抗体检测试剂盒的研制及其应用

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中国兽医科学 2006年第11期36卷 880-884页

作者：谭斌刘长明危艳武张超范刘永刚冉多良中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 新疆农业大学动物医学院新疆乌鲁木齐830052

建立了一种检测猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验法（IPMA），并组装成PRRSV-IPMA抗体检测试剂盒。对该试剂盒的敏感性、特异性、重复性及保存期等进行了试验，并与国外IDEXX ELISA试剂盒进行了比... 详细信息

建立了一种检测猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验法（IPMA），并组装成PRRSV-IPMA抗体检测试剂盒。对该试剂盒的敏感性、特异性、重复性及保存期等进行了试验，并与国外IDEXX ELISA试剂盒进行了比较。结果显示，用该试剂盒检测PRRSV人工接种猪血清样品，第1周抗体阳性检出率为50％，从第2周起抗体阳性检出率均为100％，而对照组猪血清抗体检测均为阴性。该试剂盒重复性好，-20℃保存18个月稳定，与其他病毒参考血清无交叉反应，与国外IDEXX ELISA试剂盒的符合率为83．3%。用该试剂盒对采自黑龙江、吉林、辽宁、河北、上海等地13个猪场的520份正常猪血清样品进行了抗体检测，结果，4个猪场阳性率高达90％以上，仅有2个猪场为阴性，其余猪场阳性率为10％～57%。

关键词：猪生殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒免疫过氧化物酶单层细胞试验

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猪流行性腹泻病毒分子生物学研究进展

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动物医学进展 2006年第10期27卷 11-14页

作者：孙东波冯力时洪艳陈建飞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

猪流行性腹泻病毒在Vero细胞上培养成功后,病毒全基因组的序列和分子结构特征,结构蛋白和非结构蛋白的生物学特性和功能,病原学、血清学和分子生物学的诊断技术,体液免疫、细胞免疫和局部黏膜免疫的机理,疫苗和病毒的细胞受体等方面得... 详细信息

猪流行性腹泻病毒在Vero细胞上培养成功后,病毒全基因组的序列和分子结构特征,结构蛋白和非结构蛋白的生物学特性和功能,病原学、血清学和分子生物学的诊断技术,体液免疫、细胞免疫和局部黏膜免疫的机理,疫苗和病毒的细胞受体等方面得到了广泛的研究。但是,与其他冠状病毒相比,猪流行腹泻病毒的研究还比较滞后,许多研究还没有开展或不够深入,为了能加快对猪流行性腹泻病毒研究进程,对其最近的分子生物学研究进展做了综述,为猪流行性腹泻病毒的深入研究提供参考。

关键词：猪流行性腹泻病毒分子生物学分子结构特征病原学血清学诊断技术体液免疫

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