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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第二十次学术研讨会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十九次学术研讨会

作者：王海秀孙恩成徐青元杨涛吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨 150001

目的:蓝舌病(Bluetongue,BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒引起的反刍动物虫媒(如库蠓、伊蚊等)传染病.本研究旨在制备NS1蛋白的MAbs,并对其生物学特性进行鉴定,旨在为蓝舌病病毒诊断与相关基础研究奠定基础. 方法:根据Genb... 详细信息

目的:蓝舌病(Bluetongue,BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒引起的反刍动物虫媒(如库蠓、伊蚊等)传染病.本研究旨在制备NS1蛋白的MAbs,并对其生物学特性进行鉴定,旨在为蓝舌病病毒诊断与相关基础研究奠定基础. 方法:根据Genbank中己登录的BTV12-NS1基因序列，利用Primer 5.0软件选取其ORF在5’端和3’端分别设计上下游引物后构建原核重组质粒pET BTV12-NS1和真核重组质粒pFAST BTV12-NS1，分别进行原核表达及真核表达。表达的重组蛋白经纯化鉴定后，利用原核重组BTV12-NS1蛋白免疫BALB/c小鼠，利用真核重组BTV12-NS1蛋白建立间接ELISA方法，确定检测最佳条件后筛选阳性杂交瘤细胞株并进行WB和IFA鉴定。结果:本实验共筛选出26株阳性杂交瘤细胞株，分别对其进行WB和IFA鉴定，发现26株MAbs均与Bac-to-Bac昆虫细胞表达系统表达的重组BTV12-NS1蛋白呈特异性反应，也能与接种BTV12的BHK-21细胞中表达的NS1蛋白发生特异性反应，而与接种野生杆状病毒和未接毒的BHK-21细胞不发生反应;IFA显示:3 E9,3B6,2B7,4B9四株MAbs无生物学活性，其余有22株MAbs均与感染BTV12的BHK-21细胞呈特异性免疫荧光。与感染BTV1-24的BHK-21细胞结果表明:2G5和3F6为型特异性MAbs;2E8,3C2,,3G6,3E7,4B1,4E5为群特异性MAbs;其余MAbs均有不同的反应谱系。结论:本研究所制备的抗NS1蛋白MAbs为下一步蓝舌病病毒相关研究奠定了基础。

关键词：蓝舌病病毒非结构蛋白单克隆抗体制备工艺生物学特性

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蓝舌病病毒15型NS3蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

蓝舌病病毒15型NS3蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第二十次学术研讨会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十九次学术研讨会

作者：张沁孙恩成徐青元杨涛吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨 150001

蓝舌病是由呼肠孤病毒科环状病毒属的蓝舌病病毒(BTV)引起的,以库蠓为传播媒介在反刍动物间广泛传播的虫媒性传染病.BTV病毒粒子呈二十面体对称,无囊膜,其基因组为分节段的10个片段的双股RNA,分别编码结构蛋白VP1～VP7及非结构蛋白NS1～... 详细信息

蓝舌病是由呼肠孤病毒科环状病毒属的蓝舌病病毒(BTV)引起的,以库蠓为传播媒介在反刍动物间广泛传播的虫媒性传染病.BTV病毒粒子呈二十面体对称,无囊膜,其基因组为分节段的10个片段的双股RNA,分别编码结构蛋白VP1～VP7及非结构蛋白NS1～***3蛋白由S10基因(822bp)编码,含有两个开放阅读框,分别编码229个氨基酸(aa)的NS3和216个aa的NS3a.本研究通过制备NS3的单克隆抗体(mAbs)及鉴定其抗原表位,以期为BTV的释放机制研究奠定基础.将NCBI中BTV 1~24型NS3蛋白序列进行了序列对比，结果表明1B5,2B12, 4H8所识别的抗原表位201QSYNDAVRMSFTEF216aa在BTV 1~24型NS3蛋白序列中完全保守，具有良好的BTV群特异性。

关键词：蓝舌病病毒非结构蛋白蛋白单克隆抗体抗原表位鉴定机理

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蓝舌病病毒群特异性抗原捕获ELISA方法的建立

蓝舌病病毒群特异性抗原捕获ELISA方法的建立

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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第二十次学术研讨会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十九次学术研讨会

作者：孙恩成徐青元杨涛冯瑜菲吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨 150001

目的:蓝舌病(BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒(BTV)引起的反刍动物虫媒传染病.不同流行地区易感动物的死亡率差别很大,一般可达30％,在某些地区绵羊感染后死亡率甚至高达80％.目前为止已有报道证实BT血清型已达26种之多,并且... 详细信息

目的:蓝舌病(BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒(BTV)引起的反刍动物虫媒传染病.不同流行地区易感动物的死亡率差别很大,一般可达30％,在某些地区绵羊感染后死亡率甚至高达80％.目前为止已有报道证实BT血清型已达26种之多,并且每种血清型之间没有交叉保护作用,増加了BT防控的难度,因此建立切实有效的抗原检测方法对于BTV的监控闻言是至关重要的.本研究利用实验制备保存的针对于BTV VP7蛋白的单克隆抗体(MAb)建立BTV群特异性抗原捕获ELISA方法,为BTV疫苗定量以及抗原监测奠定基础. 方法:BTV灭活抗原、茨城病毒(IBAV)、赤羽病毒(AKAV)、牛轮状病毒(BRV)、口蹄疫病毒(FMDV)等由哈尔滨兽医研究所提供;采用Protein ASepharoseTM CL-4B亲和层析纯化制备的MAb 1F6与4H7腹水，利用简易过碘酸钠法进行HRP-MAb 4H7标记试验;利用矩阵法确定抗原捕获ELISA术式及反应条件。结果:建立BTV群特异性抗原捕获ELISA方法，对己知抗原BTV,IBAV,AKAV,BRV, FMDV进行检测，发现所建立的抗原捕获ELISA方法仅对BTV灭活病毒液呈阳性反应，对其它相关病毒以及BHK-21细胞裂解液呈阴性反应。敏感性检测最低检出量为400TCIDSO. 结论:本实验所建立的BTV群特异性抗原捕获ELISA方法具有较好的敏感性和特异性，可以用于BTV病原检测以及疫苗定量。

关键词：蓝舌病病毒群特异性抗原捕获方法酶联免疫吸附测定

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表达狂犬病病毒ERA株糖蛋白重组新城疫病毒活载体疫苗的构建及对小鼠的免疫原性研究

表达狂犬病病毒ERA株糖蛋白重组新城疫病毒活载体疫苗的构建及对...

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：马良王琪田美杰王喜军翟洪月于文会葛金英步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨 150001 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨 150001 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

在新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统的基础上,构建表达狂犬病病毒ERA株糖蛋白的重组新城疫病毒rLa-ERA-GP,并探索rLa-ERA-GP对小鼠免疫原性.利用RT-PCR技术,从狂犬病病毒ERA疫苗株上得到狂犬病病毒的糖蛋白(GP)基因,将其克... 详细信息

在新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统的基础上,构建表达狂犬病病毒ERA株糖蛋白的重组新城疫病毒rLa-ERA-GP,并探索rLa-ERA-GP对小鼠免疫原性.利用RT-PCR技术,从狂犬病病毒ERA疫苗株上得到狂犬病病毒的糖蛋白(GP)基因,将其克隆到载体pBRN-FL-Pmel上,构建了表达狂犬病病毒糖蛋白重组新城疫病毒全长cDNA克隆pBRN-FL-ERA-GP.利用磷酸钙转染法,在辅助质粒pBS-NP、pBS-P和pBS-L的共同作用下,拯救重组病毒***-PCR检测证实重组病毒rLa-ERA-GP基因组中含有GP基因;western blot和IFA检测结果均表明GP基因在新城疫载体中得到了正确、稳定的表达;大剂量接种BALB/c小鼠不会引起小鼠发病和生长阻滞,并能诱导出高水平ERA特异中和抗体反应;加强免疫后可有效抵御致死剂量RV街毒对BALB/c小鼠的攻击.重组病毒rLa-ERA-GP有望成为防制狂犬病更加安全、有效的,新型重组基因工程活载体疫苗.

关键词：狂犬病病毒反向遗传操作系统重组新城疫病毒糖蛋白表达活载体疫苗免疫原性

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跨膜丝氨酸蛋白酶-4对2009甲型H1N1流感病毒HA的切割及其融合活性研究

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中国预防兽医学报 2013年第7期35卷 517-520页

作者：吴超温志远陈伟业施建忠葛金英步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

流感病毒血凝素(HA)被宿主蛋白酶切割活化是流感病毒复制和扩散的关键步骤。2009甲型H1N1流感病毒HA的裂解位点为单碱性氨基酸,只能被宿主特定组织部位表达的某些蛋白酶所切割活化。本研究构建了主要存在于人呼吸道和肺脏的跨膜丝氨酸... 详细信息

流感病毒血凝素(HA)被宿主蛋白酶切割活化是流感病毒复制和扩散的关键步骤。2009甲型H1N1流感病毒HA的裂解位点为单碱性氨基酸,只能被宿主特定组织部位表达的某些蛋白酶所切割活化。本研究构建了主要存在于人呼吸道和肺脏的跨膜丝氨酸蛋白酶4(TMPRSS4)的真核表达重组质粒pCA-TMPRSS4-Flag与表达2009甲型H1N1流感病毒中国四川分离株HA的真核重组表达质粒pCA-SCHA共转染293T细胞,利用westernblot证明2009甲型H1N1流感病毒的HA蛋白能够被TMPRSS4切割;通过激光共聚焦确定TMPRSS4和HA在293T细胞膜上共定位;并进一步通过细胞融合试验证明经正确切割的HA具有在低pH条件下介导细胞膜发生融合的生物学功能。本实验为研究自然感染情况下参与活化流感病毒的宿主胰蛋白酶提供了实验依据。

关键词： 2009甲型H1N1流感病毒跨膜丝氨酸蛋白酶-4 血凝素细胞融合

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表达鸡毒支原体TM1蛋白基因重组新城疫病毒的构建及其免疫原性研究

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中国预防兽医学报 2013年第10期35卷 779-782页

作者：冯秋霖刘茂军祁芳陈曦邵国青葛金英步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 江苏省农业科学院兽医研究所江苏南京210095

为研制安全、有效的新型鸡毒支原体(MG)疫苗,本研究利用新城疫病毒(NDV)LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统,构建出表达MG TM1蛋白的重组病毒rLa-TM1,并对其生物学特性进行鉴定,评估其作为MG活载体疫苗的安全性和有效性。通过免疫荧光试... 详细信息

为研制安全、有效的新型鸡毒支原体(MG)疫苗,本研究利用新城疫病毒(NDV)LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统,构建出表达MG TM1蛋白的重组病毒rLa-TM1,并对其生物学特性进行鉴定,评估其作为MG活载体疫苗的安全性和有效性。通过免疫荧光试验表明TM1蛋白获得正确表达;经测定,重组病毒平均鸡胚致死时间(MDT)为132 h,脑内致死指数(ICPI)和静脉内致病指数(IVPI)均为0,保持了LaSota亲本株的低致病性;rLa-TM1接种鸡胚所收集尿囊液中的病毒滴度可高达每毫升109.5EID50以上,证明重组病毒保持了LaSota亲本株高滴度鸡胚生长特性;重组病毒rLa-TM1接种1周龄的雏鸡后,可以诱导显著的MG抗体反应;攻毒保护试验证明其保护率可以达90%,而对照组全部发病(10/10)。本研究表明重组病毒rLa-TM1可以作为MG重组病毒活载体疫苗的候选疫苗。

关键词：鸡毒支原体反向遗传操作系统重组新城疫病毒

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表达扎伊尔型埃博拉病毒囊膜糖蛋白重组水泡性口炎病毒的构建

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中国预防兽医学报 2013年第6期35卷 431-435页

作者：宋坤王喜军温志远葛金英冯娜胡旭乐陈伟业高玉伟夏咸柱步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130062

埃博拉病毒(EBO V)能够引起一种人畜共患急性出血性传染病,即埃博拉出血热。研制安全、有效的抗病毒疫苗具有重要意义。本研究利用水泡性口炎病毒(V SV)印第安纳株反向遗传操作系统,构建并拯救得到表达扎伊尔型埃博拉病毒(ZEBO V)囊膜... 详细信息

埃博拉病毒(EBO V)能够引起一种人畜共患急性出血性传染病,即埃博拉出血热。研制安全、有效的抗病毒疫苗具有重要意义。本研究利用水泡性口炎病毒(V SV)印第安纳株反向遗传操作系统,构建并拯救得到表达扎伊尔型埃博拉病毒(ZEBO V)囊膜糖蛋白G P的重组V SV(rV SV-ZEBO V-G P),通过w estern blot和免疫荧光试验证明在重组病毒中ZEBO V G P蛋白获得正确表达;动物试验显示重组病毒对小鼠高度安全;中和试验结果表明重组病毒能诱导小鼠产生针对ZEBO V囊膜糖蛋白G P嵌合V SV假病毒粒的特异性中和抗体。本研究表明rV SV-ZEBO V-G P作为防控ZEBO V的储备性疫苗具有潜在的应用价值。

关键词：扎伊尔型埃博拉病毒囊膜糖蛋白重组水泡性口炎病毒

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布鲁氏菌Cu/Zn-SOD基因的原核表达及其免疫原性分析

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中国预防兽医学报 2013年第4期35卷 317-320页

作者：覃晓琳乔祖健胡森刘文兴赵云李继昌步志高东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为分析布鲁氏菌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)蛋白的免疫原性,本研究将布鲁氏菌强毒株M28的Cu/Zn-SOD基因经PCR扩增并克隆至pET-32a(+)中进行重组表达和纯化。经western blot分析表明,重组蛋白SOD(rSOD)可以与布鲁氏菌自然感染血清发生特... 详细信息

为分析布鲁氏菌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)蛋白的免疫原性,本研究将布鲁氏菌强毒株M28的Cu/Zn-SOD基因经PCR扩增并克隆至pET-32a(+)中进行重组表达和纯化。经western blot分析表明,重组蛋白SOD(rSOD)可以与布鲁氏菌自然感染血清发生特异性反应。同时,以rSOD免疫BALB/c小鼠制备的多抗血清可以与布鲁氏菌疫苗株M5-90发生特异性反应;以rSOD为包被抗原进行间接ELISA检测,结果显示rSOD能够区分布鲁氏菌阳性血清和阴性血清。因此,rSOD蛋白具有良好的免疫原性和ELISA反应原性,为利用rSOD蛋白建立布鲁氏菌检测方法奠定基础。

关键词：布鲁氏菌 Cu Zn SOD基因原核表达免疫原性

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布鲁氏菌M28强毒株O抗原聚合酶基因缺失株的构建及其毒力评价

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中国预防兽医学报 2013年第3期35卷 197-201页

作者：赵云胡森乔祖建刘文兴覃晓琳步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

为构建布鲁氏菌O抗原聚合酶缺失突变株,本研究以布鲁氏菌M28株为亲本株,利用同源重组方法,以编码O抗原聚合酶靶基因M28_B0107基因ORF外侧序列作为同源臂构建重组质粒pSP-B0107-K,将其电转化至M28感受态细胞中,以卡那霉素抗性基因(Kanr)... 详细信息

为构建布鲁氏菌O抗原聚合酶缺失突变株,本研究以布鲁氏菌M28株为亲本株,利用同源重组方法,以编码O抗原聚合酶靶基因M28_B0107基因ORF外侧序列作为同源臂构建重组质粒pSP-B0107-K,将其电转化至M28感受态细胞中,以卡那霉素抗性基因(Kanr)作为标记,筛选缺失突变株(M28-ΔB0107)。M28-ΔB0107经过20余代传代培养,Kanr表达稳定。将M28-ΔB0107与M28以106cfu剂量腹腔接种小鼠,进行体内致病性试验。结果显示,M28-ΔB0107感染组小鼠脾脏荷菌量显著低于亲本M28株感染组,感染6周时,前者低于后者近10倍(p<0.05);而且M28-ΔB0107感染组脾脏重量也显著低于M28强毒株组(p<0.05);小鼠腹腔巨噬细胞系(RAW264.7)感染能力试验结果表明,突变株与亲本株无明显差异(p>0.05)。

关键词：布鲁氏菌 O抗原聚合酶 B0107

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表达西尼罗病毒E蛋白重组腺病毒的构建及鉴定

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中国预防兽医学报 2013年第4期35卷 267-270页

作者：张翠云赵晶陈韬孙恩成刘霓红杨涛徐青元王文世魏鹏吴东来湖南农业大学动物医学学院湖南长沙410128 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为构建表达西尼罗病毒(WNV)E蛋白的重组腺病毒,本实验将WNV的E基因克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,经PmeⅠ酶切线性化后电转化于含有人5型缺陷腺病毒的骨架的BJ5183感受态大肠杆菌中进行同源重组,构建重组质粒pAd-WNV-E;将其经Pac... 详细信息

为构建表达西尼罗病毒(WNV)E蛋白的重组腺病毒,本实验将WNV的E基因克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,经PmeⅠ酶切线性化后电转化于含有人5型缺陷腺病毒的骨架的BJ5183感受态大肠杆菌中进行同源重组,构建重组质粒pAd-WNV-E;将其经PacⅠ酶切线性化后通过脂质体介导转染于人胚肾细胞Ad-293细胞,制备重组腺病毒rAd-WNV-E;经western blot以及间接免疫荧光鉴定表明WNV E蛋白在Ad-293细胞中获得有效表达。病毒滴度测定试验结果显示,该重组腺病毒与野毒型腺病毒复制能力相近。该重组腺病毒的构建为进一步研制表达WNV E蛋白的重组腺病毒的疫苗奠定了基础。

关键词：西尼罗病毒 E蛋白重组腺病毒

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