检索结果-内蒙古大学图书馆

中国预防兽医学报 2009年第11期31卷 833-837页

作者：田野张维军林燕王群杨涛步志高童光志张守发吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 延边大学农学院吉林龙井133400 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

为构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5重组牛痘病毒,本研究通过RT-PCR获得PRRSVCH-1a株GP5蛋白基因,将其克隆至pMD18-T载体。经测序鉴定正确后,将该片段作为目的基因亚克隆至转移质粒pSC11中,构建重组转移质粒(pSC11-GP5)。将pSC... 详细信息

为构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5重组牛痘病毒,本研究通过RT-PCR获得PRRSVCH-1a株GP5蛋白基因,将其克隆至pMD18-T载体。经测序鉴定正确后,将该片段作为目的基因亚克隆至转移质粒pSC11中,构建重组转移质粒(pSC11-GP5)。将pSC11-GP5转染WR株牛痘病毒感染的TK-143细胞,与牛痘病毒进行同源重组。在含有X-gal的琼脂培养基上进行蓝斑筛选,获得了含有PRRSV GP5基因的重组病毒(rWR-PRRSV-GP5)。IFA及动物试验表明,重组病毒表达了PRRSVGP5蛋白,并在免疫小鼠体内诱生了较强的PRRSV抗体。实验表明,该重组病毒所表达的PRRSV GP5蛋白保持了良好的抗原性,为进一步研究PRRSV GP5蛋白免疫原性提供了基础数据,也为PRRS重组活载体疫苗的研究奠定了基础。

关键词：猪生殖与呼吸综合征病毒 GP5蛋白重组牛痘病毒

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蓝舌病病毒VP7基因的原核表达

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中国预防兽医学报 2009年第12期31卷 925-928页

作者：宋红梅杨涛马健男王群张维军徐青元杨增岐吴东来西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为获得蓝舌病病毒(BTV)VP7基因的原核表达蛋白,本实验采用RT-PCR方法扩增出了血清1型BTV的VP7基因,并克隆到原核表达载体pMAL-c2X中,构建了重组质粒pMAL-VP7。将重组质粒转化TB1感受态细胞,以0.5mmol/L的IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳... 详细信息

为获得蓝舌病病毒(BTV)VP7基因的原核表达蛋白,本实验采用RT-PCR方法扩增出了血清1型BTV的VP7基因,并克隆到原核表达载体pMAL-c2X中,构建了重组质粒pMAL-VP7。将重组质粒转化TB1感受态细胞,以0.5mmol/L的IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白MBP-VP7以可溶形式存在,分子质量约为90ku。以纯化的重组蛋白作为包被抗原,初步建立了检测BTV血清抗体的间接ELISA诊断方法,为今后进一步开展BTV诊断研究奠定了基础。

关键词：蓝舌病病毒 VP7基因原核表达

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表达小反刍兽疫病毒F蛋白的重组山羊痘病毒疫苗的研究

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中国预防兽医学报 2009年第6期31卷 415-420页

作者：曲林茂陈伟业胡倩倩胡森张倩支海兵黄克和步志高南京农业大学动物医学院江苏南京210095 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 中国兽医药品监察所北京100081

本研究利用gpt筛选基因和eGFP报告基因纯化筛选重组小反刍兽疫病毒(PPRV)F基因的重组山羊痘病毒(rGPV-PPRV-F),并经过PCR鉴定。免疫荧光和蛋白印迹试验都证实重组病毒能够感染绵羊羔羊睾丸细胞并表达PPRVF蛋白。以2×106PFU的rGPV-P... 详细信息

本研究利用gpt筛选基因和eGFP报告基因纯化筛选重组小反刍兽疫病毒(PPRV)F基因的重组山羊痘病毒(rGPV-PPRV-F),并经过PCR鉴定。免疫荧光和蛋白印迹试验都证实重组病毒能够感染绵羊羔羊睾丸细胞并表达PPRVF蛋白。以2×106PFU的rGPV-PPRV-F皮内注射免疫山羊3只,并于首次免疫后第28d以相同剂量进行二次免疫。分别于一免后21d和二免后14d采血后分离血清进行病毒中和试验。结果表明,一免后21d山羊痘病毒(GPV)中和抗体效价依次为1∶40、≥1∶80、≥1∶80,PPRV中和抗体效价依次别为1∶20、1∶40、1∶20,全部阳转;二免后14d,GPV中和抗体效价≥1∶80,PPRV中和抗体效价依次为1∶20、1∶80、1∶40。本研究为小反刍兽疫重组山羊痘疫苗的产业化奠定了基础。

关键词：小反刍兽疫 F蛋白山羊痘病毒载体重组疫苗中和抗体

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5种人兽共患病病毒多重RT-PCR检测方法的初步建立

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中国预防兽医学报 2009年第10期31卷 785-789页

作者：孙庆歌杨银辉张维军王群康晓平李永强白宇童铁钢杨涛步志高吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物/生物安全国家重点实验室北京100071

为建立可同时检测裂谷热病毒(RVFV)、戊型肝炎病毒(HEV)、狂犬病毒(RV)、水泡性口炎病毒(VSV)及口蹄疫病毒(FMDV)5种人兽共患病病毒的多重RT-PCR快速检测方法,本研究根据GenBank登录的上述5种病毒的全基因组序列,设计了5对多重PCR引物,... 详细信息

为建立可同时检测裂谷热病毒(RVFV)、戊型肝炎病毒(HEV)、狂犬病毒(RV)、水泡性口炎病毒(VSV)及口蹄疫病毒(FMDV)5种人兽共患病病毒的多重RT-PCR快速检测方法,本研究根据GenBank登录的上述5种病毒的全基因组序列,设计了5对多重PCR引物,通过优化反应条件,建立检测以上5种病毒的多重RT-PCR方法。通过对同一种属的其他病毒及相关病毒的检测,确定方法的特异性;通过对体外转录合成的RNA进行定量检测的方法,确定方法的敏感度。实验结果表明:在同一RT-PCR反应体系中可同时检测以上5种病毒,扩增片段长度分别为499bp、137bp、274bp、224bp、389bp;而对新城疫病毒(NDV)、赤羽病病毒(AKAV)、牛流行热病毒(BEFV)和乙型脑炎病毒(JBEV)的检测均为阴性;5种病毒RNA的最低检测拷贝数分别为2.91×104、3.14×103、1.25×103、6.65×103和2.38×104。利用该方法对11份RV已知阳性样本和7份HEV已知阳性样本检测结果均呈阳性。本研究建立了一种快速、可同时检测5种人兽共患病病毒的多重RT-PCR检测方法,该方法具有良好的特异性和较高的敏感性。

关键词：裂谷热病毒戊型肝炎病毒狂犬病毒水泡性口炎病毒口蹄疫病毒多重RT-PCR

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人分化抑制因子Id-2基因在大肠埃希氏菌中的高效表达及其多克隆抗体的制备

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南方医科大学学报 2009年第6期29卷 1094-1097,1110页

作者：童铁钢林燕穆丹梅白宇杨木蕾郑敏吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部兽医公共卫生重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 黑龙江大学生命科学院黑龙江哈尔滨150080 哈尔滨医科大学附属第一医院黑龙江哈尔滨150001 大庆油田总医院腹部超声室黑龙江大庆163001

目的在大肠杆菌中表达人Id-2与谷胱甘肽-S转移酶(GST)的融合蛋白,并制备抗人Id-2的多克隆抗体。方法从乳腺癌组织中提取总RNA,用RT-PCR扩增出Id-2基因的编码序列,克隆至表达载体pGEX-6P-1中,重组质粒经PCR、酶切、测序鉴定后,在大肠杆... 详细信息

目的在大肠杆菌中表达人Id-2与谷胱甘肽-S转移酶(GST)的融合蛋白,并制备抗人Id-2的多克隆抗体。方法从乳腺癌组织中提取总RNA,用RT-PCR扩增出Id-2基因的编码序列,克隆至表达载体pGEX-6P-1中,重组质粒经PCR、酶切、测序鉴定后,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST-Id-2蛋白,SDS-PAGE分析表达产物。通过亲和层析法纯化表达的GST-Id-2融合蛋白,Western-Blot检测重组抗原的免疫原性,并以此为抗原制备多克隆抗体。结果经PCR、酶切、测序鉴定证明,Id-2基因已正确克隆至pGEX-6P-1中,经IPTG诱导后,表达出相对分子质量40000的GST-Id-2融合蛋白。Western-Blot、ELISA和琼脂双向扩散实验鉴定所制备的多克隆抗体可以与GST-Id-2特异性反应。结论Id-2基因在在大肠杆菌中的成功表达及制备的多克隆抗体,为检测Id-2及其在各种组织中的表达提供了一种检测方法,也为分析Id-2分子结构及抗原表位奠定了基础。

关键词：人Id-2基因基因表达多克隆抗体

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狂犬病病毒Vero ERA株G蛋白333位点精氨酸突变株的构建

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中国畜牧兽医 2009年第9期36卷 79-82页

作者：郭利王喜军冯娜葛金英杨松涛夏咸柱步志高吉林农业大学研究生院长春130118 军事医学科学院军事兽医研究所长春130000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部兽医公共卫生重点开放实验室暨兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

狂犬病病毒糖蛋白(G)在病毒的致病性中起着主要作用,其第333位点精氨酸(Arg)是决定病毒神经细胞侵嗜性的重要分子基础之一。为研制更加安全有效的狂犬病减毒活疫苗,本试验采用负链RNA病毒反向遗传学方法,在体外将狂犬病病毒Vero细胞适应... 详细信息

狂犬病病毒糖蛋白(G)在病毒的致病性中起着主要作用,其第333位点精氨酸(Arg)是决定病毒神经细胞侵嗜性的重要分子基础之一。为研制更加安全有效的狂犬病减毒活疫苗,本试验采用负链RNA病毒反向遗传学方法,在体外将狂犬病病毒Vero细胞适应株ERA糖蛋白G333位点精氨酸突变为谷氨酸,构建减毒株ERAGΔ,减弱了其潜在的毒力返强的危险。救获的ERAGΔ突变株在Vero细胞上表现出与ERA株亲本病毒相似的生长动力学特性。本研究成功构建并拯救出了狂犬病病毒ERA减毒疫苗株,为研制开发狂犬病病毒无毒疫苗提供了候选株。

关键词：狂犬病病毒反向遗传操作糖蛋白G 人工突变

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西尼罗病毒NS1基因的原核表达与抗原性鉴定

西尼罗病毒NS1基因的原核表达与抗原性鉴定

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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十六次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十五次学术研讨会

作者：马健男杨涛王群张维军徐青元田野林燕宋红梅步志高吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室

通过PCR方法扩增西尼罗病毒(WNV)NY99株NS1基因,并将其克隆至原核表达载体pMAL-c2X上,构建出重组表达质粒pc2X-NS1,经IPTG诱导得到可溶性的麦芽糖结合蛋白(MBP)-NS1融合蛋白(MBP-NS1),其分子质量约为90 ku,大约占可溶性菌体蛋白的50%。... 详细信息

通过PCR方法扩增西尼罗病毒(WNV)NY99株NS1基因,并将其克隆至原核表达载体pMAL-c2X上,构建出重组表达质粒pc2X-NS1,经IPTG诱导得到可溶性的麦芽糖结合蛋白(MBP)-NS1融合蛋白(MBP-NS1),其分子质量约为90 ku,大约占可溶性菌体蛋白的50%。利用直链淀粉树脂柱对MBP-NS1纯化后的重组蛋白的纯度达到60%,Western-blot和间接ELISA检测证明纯化的MBP-NS1具有良好的抗原性和特异性。

关键词：西尼罗病毒 NS1基因原核表达

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串联表达Ubiquitin基因与PRRSVM基因DNA疫苗的构建及其对小鼠的免疫试验

串联表达Ubiquitin基因与PRRSVM基因DNA疫苗的构建及其对小鼠的免...

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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十六次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十五次学术研讨会

作者：张维军林燕王群孙庆歌杨涛童光志吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室中国农业科学院上海兽医研究所

利用SOE技术将PRRSV M基因与小鼠泛素(Ubiquitin,Ub)基因融合,并将融合后的基因克隆至真核表达载体pVAX1中,构建真核表达质粒pVAX1-U-M。利用真核表达质粒DNA免疫小鼠,通过检测体液免疫反应与细胞免疫反应进一步研究pVAX1-U-M的免疫效果... 详细信息

利用SOE技术将PRRSV M基因与小鼠泛素(Ubiquitin,Ub)基因融合,并将融合后的基因克隆至真核表达载体pVAX1中,构建真核表达质粒pVAX1-U-M。利用真核表达质粒DNA免疫小鼠,通过检测体液免疫反应与细胞免疫反应进一步研究pVAX1-U-M的免疫效果。IFA试验结果表明,真核表达质粒pVAX1-U-M能够在BHK-21细胞内成功表达目的基因,小鼠免疫试验结果表明,真核表达质粒pVAX1-U-M能够在小鼠体内诱生PRRSVELISA抗体与细胞免疫反应。但是,ELISA抗体水平比较低,而细胞免疫的水平则相对较高。这说明泛素在一定程度上可以促进PRRSV M基因诱导细胞免疫反应,但对体液免疫未见到同样作用。本研究的结果为进一步探讨PRRSVM蛋白在免疫中的作用、泛素的功能,也为PRRS新型疫苗的研究提供基础数据。

关键词： PRRSV M基因泛素体液免疫细胞免疫 DNA疫苗

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H5N1亚型禽流感核蛋白T细胞表位区的研究

H5N1亚型禽流感核蛋白T细胞表位区的研究

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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十六次、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十五次学术研讨会

作者：王群刘光亮肖一红张维军吴东来农业部兽医公共卫生重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所哈尔滨 150001

细胞免疫反应在病毒感染的清除中起了重要的作用。针对保守表位的记忆性T细胞可以抵抗异源病毒的攻击。在本研究中,通过禽痘病毒表达系统对AIVA/Goose/Guangdon/1/96(H5N1)(GD1/96)株NP进行T细胞表位作图。将全长NP分为互相重叠的6段,... 详细信息

细胞免疫反应在病毒感染的清除中起了重要的作用。针对保守表位的记忆性T细胞可以抵抗异源病毒的攻击。在本研究中,通过禽痘病毒表达系统对AIVA/Goose/Guangdon/1/96(H5N1)(GD1/96)株NP进行T细胞表位作图。将全长NP分为互相重叠的6段,分别构建含有6个节段和全长的重组FPVs(rFPVs),使用构建的重组rFPVs体外刺激经NP重组DNA疫苗免疫的鸡脾淋巴细胞,分别通过流式细胞术、ELISA和real-time RT-PCR监测刺激后细胞增殖、ChIFN-γ表达和转录的情况,结果显示,我们所获得的五株重组毒rFPlV-NP1、rFPV-NP3、rFPV-NP4、rFPV-NP5和rFPV-NP中,rFPV-NP5能明显刺激活化后细胞的增殖及ChIFN-γ表达和转录,从而确定在AIV GD1/96NP(NP277-421)的羧基端存在至少1个T细胞表位。

关键词：禽流感病毒核蛋白细胞免疫 T细胞表位病毒感染鸡脾淋巴细胞流式细胞术

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PRRSV GP5蛋白原核表达载体的构建与鉴定

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畜牧兽医科技信息 2009年第4期25卷 48-49页

作者：田野张维军田志军吴东来张守发中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室哈尔滨150001 延边大学农学院龙井133400

通过RT-PCR获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)CH-1a株GP5蛋白基因,克隆至pMD18-T载体。经测序鉴定正确后,将该片段作为目的基因亚克隆至原核表达质粒pGEX-6p-1,构建原核重组质粒(pGEX-GP5),转化至***21感受态细胞,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳显示重组蛋白以包涵体形式得到了表达,Westernblot与间接ELISA试验分析表明,该蛋白与PRRSV阳性血清具有良好的免疫反应性。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5蛋白免疫原性

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