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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十六次、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十五次学术研讨会

作者：马健男吴东来杨涛王群张维军徐青元田野林燕宋红梅步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室哈尔滨 150001

通过PCR方法扩增西尼罗病毒(WNV)NY99株NS1基因,并将其克隆至原核表达载体pMAL-c2X上,构建出重组表达质粒pc2X-NS1,经IPTG诱导得到可溶性的麦芽糖结合蛋白(MBP)-NS1融合蛋白(MBP-NS1),其分子质量约为90 ku,大约占可溶性菌体蛋白的50％... 详细信息

通过PCR方法扩增西尼罗病毒(WNV)NY99株NS1基因,并将其克隆至原核表达载体pMAL-c2X上,构建出重组表达质粒pc2X-NS1,经IPTG诱导得到可溶性的麦芽糖结合蛋白(MBP)-NS1融合蛋白(MBP-NS1),其分子质量约为90 ku,大约占可溶性菌体蛋白的50％。利用直链淀粉树脂柱对MBP-NS1纯化后的重组蛋白的纯度达到60％,Western-blot和间接ELISA检测证明纯化的MBP-NS1具有良好的抗原性和特异性。

关键词：西尼罗病毒原核表达抗原性鉴定融合蛋白

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PRRSV GP5蛋白原核表达载体的构建与鉴定

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畜牧兽医科技信息 2009年第4期25卷 48-49页

作者：田野张维军田志军吴东来张守发中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室哈尔滨150001 延边大学农学院龙井133400

通过RT-PCR获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)CH-1a株GP5蛋白基因,克隆至pMD18-T载体。经测序鉴定正确后,将该片段作为目的基因亚克隆至原核表达质粒pGEX-6p-1,构建原核重组质粒(pGEX-GP5),转化至***21感受态细胞,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳显示重组蛋白以包涵体形式得到了表达,Westernblot与间接ELISA试验分析表明,该蛋白与PRRSV阳性血清具有良好的免疫反应性。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5蛋白免疫原性

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7株H3亚型禽流感病毒HA基因的遗传演化分析

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畜牧与兽医 2013年第12期45卷 6-10页

作者：黄建龙邓国华谭丹王昌建朱春霞范仲鑫何世成汪洪冰张菁邱立新鲁杏华刘道新湖南省动物疫病预防控制中心湖南长沙410007 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 湖南省动物卫生监督所湖南长沙410007

采用RT—PCR技术对近年来洞庭湖区分离的H3亚型禽流感毒株的HA基因进行扩增、克隆和测序，并对所得全序列进行同源性和遗传演化分析。结果显示：本试验分离到的7株H3亚型禽流感病毒的HA裂解位点均没有多个连续的碱性氨基酸插入，属于低... 详细信息

采用RT—PCR技术对近年来洞庭湖区分离的H3亚型禽流感毒株的HA基因进行扩增、克隆和测序，并对所得全序列进行同源性和遗传演化分析。结果显示：本试验分离到的7株H3亚型禽流感病毒的HA裂解位点均没有多个连续的碱性氨基酸插入，属于低致病性病毒；7株H3亚型毒株之间HA基因核苷酸同源性在87．6％～98．4％之间，推导氨基酸序列的同源性在93．7％～99．1％之间；从HA基因遗传演化关系来看，7株病毒毒可分为三大分支，与以往从蒙古、韩国、越南、西伯利亚及我国香港、广西、三江等地分离的H3亚型毒株关系密切，提示其HA基因来源非常复杂。

关键词： H3亚型禽流感 HA基因同源性遗传演化

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串联表达Ubiquitin基因与PRRSVM基因DNA疫苗的构建及其对小鼠的免疫试验

串联表达Ubiquitin基因与PRRSVM基因DNA疫苗的构建及其对小鼠的免...

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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十六次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十五次学术研讨会

作者：张维军林燕王群孙庆歌杨涛童光志吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室中国农业科学院上海兽医研究所

利用SOE技术将PRRSV M基因与小鼠泛素(Ubiquitin,Ub)基因融合,并将融合后的基因克隆至真核表达载体pVAX1中,构建真核表达质粒pVAX1-U-M。利用真核表达质粒DNA免疫小鼠,通过检测体液免疫反应与细胞免疫反应进一步研究pVAX1-U-M的免疫效果... 详细信息

利用SOE技术将PRRSV M基因与小鼠泛素(Ubiquitin,Ub)基因融合,并将融合后的基因克隆至真核表达载体pVAX1中,构建真核表达质粒pVAX1-U-M。利用真核表达质粒DNA免疫小鼠,通过检测体液免疫反应与细胞免疫反应进一步研究pVAX1-U-M的免疫效果。IFA试验结果表明,真核表达质粒pVAX1-U-M能够在BHK-21细胞内成功表达目的基因,小鼠免疫试验结果表明,真核表达质粒pVAX1-U-M能够在小鼠体内诱生PRRSVELISA抗体与细胞免疫反应。但是,ELISA抗体水平比较低,而细胞免疫的水平则相对较高。这说明泛素在一定程度上可以促进PRRSV M基因诱导细胞免疫反应,但对体液免疫未见到同样作用。本研究的结果为进一步探讨PRRSVM蛋白在免疫中的作用、泛素的功能,也为PRRS新型疫苗的研究提供基础数据。

关键词： PRRSV M基因泛素体液免疫细胞免疫 DNA疫苗

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蓝舌病病毒核酸通用检测方法的建立

蓝舌病病毒核酸通用检测方法的建立

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2013年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理学专业委员会学术研讨会

作者：冯瑜菲徐青元杨涛孙恩成李俊平吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室哈尔滨150001 东北农业大学哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室哈尔滨150001

目的：建立具有群特异性的BTV通用核酸检测方法，为有效的防控蓝舌病奠定了基础。方法：利用DNAMAN生物学软件，比对了GenBank中26个不同血清型BTV的共104条S10基因的核酸序列，选取最保守的序列区域设计特异性引物，并利用PubMed中的BL... 详细信息

目的：建立具有群特异性的BTV通用核酸检测方法，为有效的防控蓝舌病奠定了基础。方法：利用DNAMAN生物学软件，比对了GenBank中26个不同血清型BTV的共104条S10基因的核酸序列，选取最保守的序列区域设计特异性引物，并利用PubMed中的BLAST软件将设计的引物与GenBank中病毒的核酸序列进行比对，以分析其特异性。利用设计的特异性引物对BTV1-24共24个血清型毒株的RNA用Quant One Step RT-PCR Kit进行one stepRT-PCR检测，以验证该引物的通用性。同时，以IBAV,CV和AKAV的RNA为模板，进行one step RT-PCR检测，以验证该引物的特异性。并通过已知浓度的BTV-16的RNA样品，按照确定的检测体系进行one step RT-PCR检测，以测定该方法的灵敏度。对人工感染BTV-16的46份羊的抗凝血样品用QIAampRNA Blood Mini Kit进行RNA提取，并进行one step RT-PCR检测。每组实验进行三次重复。结果:通过试验成功设计了BTV核酸特异性通用检测引物，并成功建立了BTV群特异性one step RT-PCR检测方法。该方法可有效检测出不同血清型BTV核酸，而对IBAV,CV和AKAV无交叉反应，特异性好;同时，该方法可成功检测到102 TCID50/mL的BTV核酸;该方法也可有效检测出羊的抗凝血样品中的BTV核酸。结论:通过比对104条26个不同血清型BTV S10基因的核酸序列，其同源性可高达90. 55％，并在不同血清型BTV中存在两段高度保守的核酸区域，这为设计BTV特异性通用检测引物提供了有利的基础。本实验筛选得到的一对特异性引物对BTV1-24型都发生特异性反应，具有良好的群特异性，为建立快速、敏感、特异性的BTV通用核酸诊断方法奠定了基础。

关键词：动物医学蓝舌病病毒群特异性核酸检测

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流行性乙型脑炎病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立

流行性乙型脑炎病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：霍红李业南薛遥郭立平王晓磊步志高华荣虹中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为建立流行性乙型脑炎病毒(JEV)的定量检测方法,本实验根据JEV的E基因保守序列设计一对特异性引物及探针,并以E基因重组质粒作为标准品,建立检测JEV的TqMan荧光定量PCR方法.结果显示,该方法的灵敏度可达到10个拷贝,是常规PCR灵敏度的100... 详细信息

为建立流行性乙型脑炎病毒(JEV)的定量检测方法,本实验根据JEV的E基因保守序列设计一对特异性引物及探针,并以E基因重组质粒作为标准品,建立检测JEV的TqMan荧光定量PCR方法.结果显示,该方法的灵敏度可达到10个拷贝,是常规PCR灵敏度的100倍.该方法对其它相关猪病病毒的检测显示均为阴性,特异性好.重复性试验表明该方法的组间和组内的变异系数均小于2％.通过检测未免疫猪和免疫减毒活疫苗猪在感染JEV后的病毒血症及内脏病毒载量,将该方法与JEV传统病毒分离方法进行比较,结果表明该方法与乳鼠脑内接种方法灵敏度相同,比细胞分离方法灵敏度高.本研究可以作为临床检测JEV病毒及评价疫苗保护效力的检测方法.

关键词：猪乙型脑炎病毒基因检测荧光定量聚合酶链反应效果评估

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蓝舌病病毒12型NS1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

蓝舌病病毒12型NS1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第二十次学术研讨会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十九次学术研讨会

作者：王海秀孙恩成徐青元杨涛吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨 150001

目的:蓝舌病(Bluetongue,BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒引起的反刍动物虫媒(如库蠓、伊蚊等)传染病.本研究旨在制备NS1蛋白的MAbs,并对其生物学特性进行鉴定,旨在为蓝舌病病毒诊断与相关基础研究奠定基础. 方法:根据Genb... 详细信息

目的:蓝舌病(Bluetongue,BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒引起的反刍动物虫媒(如库蠓、伊蚊等)传染病.本研究旨在制备NS1蛋白的MAbs,并对其生物学特性进行鉴定,旨在为蓝舌病病毒诊断与相关基础研究奠定基础. 方法:根据Genbank中己登录的BTV12-NS1基因序列，利用Primer 5.0软件选取其ORF在5’端和3’端分别设计上下游引物后构建原核重组质粒pET BTV12-NS1和真核重组质粒pFAST BTV12-NS1，分别进行原核表达及真核表达。表达的重组蛋白经纯化鉴定后，利用原核重组BTV12-NS1蛋白免疫BALB/c小鼠，利用真核重组BTV12-NS1蛋白建立间接ELISA方法，确定检测最佳条件后筛选阳性杂交瘤细胞株并进行WB和IFA鉴定。结果:本实验共筛选出26株阳性杂交瘤细胞株，分别对其进行WB和IFA鉴定，发现26株MAbs均与Bac-to-Bac昆虫细胞表达系统表达的重组BTV12-NS1蛋白呈特异性反应，也能与接种BTV12的BHK-21细胞中表达的NS1蛋白发生特异性反应，而与接种野生杆状病毒和未接毒的BHK-21细胞不发生反应;IFA显示:3 E9,3B6,2B7,4B9四株MAbs无生物学活性，其余有22株MAbs均与感染BTV12的BHK-21细胞呈特异性免疫荧光。与感染BTV1-24的BHK-21细胞结果表明:2G5和3F6为型特异性MAbs;2E8,3C2,,3G6,3E7,4B1,4E5为群特异性MAbs;其余MAbs均有不同的反应谱系。结论:本研究所制备的抗NS1蛋白MAbs为下一步蓝舌病病毒相关研究奠定了基础。

关键词：蓝舌病病毒非结构蛋白单克隆抗体制备工艺生物学特性

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蓝舌病病毒群特异性抗原捕获ELISA方法的建立

蓝舌病病毒群特异性抗原捕获ELISA方法的建立

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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第二十次学术研讨会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十九次学术研讨会

作者：孙恩成徐青元杨涛冯瑜菲吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨 150001

目的:蓝舌病(BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒(BTV)引起的反刍动物虫媒传染病.不同流行地区易感动物的死亡率差别很大,一般可达30％,在某些地区绵羊感染后死亡率甚至高达80％.目前为止已有报道证实BT血清型已达26种之多,并且... 详细信息

目的:蓝舌病(BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒(BTV)引起的反刍动物虫媒传染病.不同流行地区易感动物的死亡率差别很大,一般可达30％,在某些地区绵羊感染后死亡率甚至高达80％.目前为止已有报道证实BT血清型已达26种之多,并且每种血清型之间没有交叉保护作用,増加了BT防控的难度,因此建立切实有效的抗原检测方法对于BTV的监控闻言是至关重要的.本研究利用实验制备保存的针对于BTV VP7蛋白的单克隆抗体(MAb)建立BTV群特异性抗原捕获ELISA方法,为BTV疫苗定量以及抗原监测奠定基础. 方法:BTV灭活抗原、茨城病毒(IBAV)、赤羽病毒(AKAV)、牛轮状病毒(BRV)、口蹄疫病毒(FMDV)等由哈尔滨兽医研究所提供;采用Protein ASepharoseTM CL-4B亲和层析纯化制备的MAb 1F6与4H7腹水，利用简易过碘酸钠法进行HRP-MAb 4H7标记试验;利用矩阵法确定抗原捕获ELISA术式及反应条件。结果:建立BTV群特异性抗原捕获ELISA方法，对己知抗原BTV,IBAV,AKAV,BRV, FMDV进行检测，发现所建立的抗原捕获ELISA方法仅对BTV灭活病毒液呈阳性反应，对其它相关病毒以及BHK-21细胞裂解液呈阴性反应。敏感性检测最低检出量为400TCIDSO. 结论:本实验所建立的BTV群特异性抗原捕获ELISA方法具有较好的敏感性和特异性，可以用于BTV病原检测以及疫苗定量。

关键词：蓝舌病病毒群特异性抗原捕获方法酶联免疫吸附测定

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蓝舌病病毒15型NS3蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

蓝舌病病毒15型NS3蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第二十次学术研讨会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十九次学术研讨会

作者：张沁孙恩成徐青元杨涛吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨 150001

蓝舌病是由呼肠孤病毒科环状病毒属的蓝舌病病毒(BTV)引起的,以库蠓为传播媒介在反刍动物间广泛传播的虫媒性传染病.BTV病毒粒子呈二十面体对称,无囊膜,其基因组为分节段的10个片段的双股RNA,分别编码结构蛋白VP1～VP7及非结构蛋白NS1～... 详细信息

蓝舌病是由呼肠孤病毒科环状病毒属的蓝舌病病毒(BTV)引起的,以库蠓为传播媒介在反刍动物间广泛传播的虫媒性传染病.BTV病毒粒子呈二十面体对称,无囊膜,其基因组为分节段的10个片段的双股RNA,分别编码结构蛋白VP1～VP7及非结构蛋白NS1～***3蛋白由S10基因(822bp)编码,含有两个开放阅读框,分别编码229个氨基酸(aa)的NS3和216个aa的NS3a.本研究通过制备NS3的单克隆抗体(mAbs)及鉴定其抗原表位,以期为BTV的释放机制研究奠定基础.将NCBI中BTV 1~24型NS3蛋白序列进行了序列对比，结果表明1B5,2B12, 4H8所识别的抗原表位201QSYNDAVRMSFTEF216aa在BTV 1~24型NS3蛋白序列中完全保守，具有良好的BTV群特异性。

关键词：蓝舌病病毒非结构蛋白蛋白单克隆抗体抗原表位鉴定机理

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流行性乙型脑炎病毒E蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

流行性乙型脑炎病毒E蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第四次猪病防控学术研讨会

作者：赵付荣周东辉华荣虹王斌陈娜莎阿合买提·买买提步志高华南农业大学兽医学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部兽医公共卫生重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室

流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是一种严重危害人畜健康的虫媒病毒。表面囊膜蛋白(E蛋白)是该病毒的主要结构蛋白。本研究利用原核表达的乙型脑炎病毒SA14-14-2株结构蛋白E蛋白作为免疫原,免疫6周龄BALB/c小鼠,... 详细信息

流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是一种严重危害人畜健康的虫媒病毒。表面囊膜蛋白(E蛋白)是该病毒的主要结构蛋白。本研究利用原核表达的乙型脑炎病毒SA14-14-2株结构蛋白E蛋白作为免疫原,免疫6周龄BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术进行融合,经有限稀释法获得1株特异性针对JEVE蛋白的杂交瘤细胞,命名为5D4,经测定5D4单抗亚类属于IgG2a,轻链为κ链。经Westernblot证实所得杂交瘤细胞分泌的抗体可特异地与JEVE蛋白结合。结果表明,所制备的抗JEVE蛋白的单抗对病原检测具有很高的特异性,为JEV准确快速的病原诊断和JEV感染相关的基础性研究提供了物质基础。

关键词：乙型脑炎病毒 E蛋白单克隆抗体

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