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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：陈普成李奇蒙姜永萍柳金雄田雨王笑梅胡永浩陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070

为构建表达传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒(rHVT-VP2),本研究利用RT-PCR扩增IBDV的VP2基因,构建了重组真核表达质粒pCAGG-VP2,并将携带Pec复合启动子的VP2基因表达盒(Pec-VP2-PolyA)进行酶切,连接于Gateway系统入门质... 详细信息

为构建表达传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒(rHVT-VP2),本研究利用RT-PCR扩增IBDV的VP2基因,构建了重组真核表达质粒pCAGG-VP2,并将携带Pec复合启动子的VP2基因表达盒(Pec-VP2-PolyA)进行酶切,连接于Gateway系统入门质粒pENTR构建重组质粒pENTR-VP2.采用GatewayLR克隆技术将pENTR-VP2与构建的重组粘粒pFosC-ccdBK+共同参与基因片段进行互换反应,构建重组粘粒pFosC-VP2.通过将pFosC-VP2与其它4个相互重叠并且覆盖HVT全基因组的粘粒酶切线性化后共同转染CEF细胞,拯救重组病毒rHVT-VP2.将重组病毒在CEF细胞中连续传代20次,利用PCR、western blot和间接免疫荧光进行检测,结果表明VP2蛋白均得到稳定地表达.动物试验结果表明通过一次免疫rHVT-VP2即可诱导针对传染性法氏囊的完全保护力.

关键词：火鸡疱疹病毒传染性法氏囊病毒基因重组蛋白表达

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果子狸源H5N1亚型禽流感病毒的分离及生物学特性鉴定

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中国预防兽医学报 2013年第3期35卷 181-184页

作者：吴珊珊王飞慈彦鹏刘丽玲田国彬曾显营陈化兰李雁冰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室/国家禽流感参考实验室黑龙江哈尔滨150001

2011年,对广西自治区进行禽流感流行病学调查时从野生哺乳动物果子狸体内分离到一株H5N1亚型禽流感病毒(AIV),命名为A/palm-civet/Guangxi/26/2011(H5N1)(PC/GX/26/11)。本研究对其全基因组序列进行测定及其对BALB/c鼠的致病性试验。全... 详细信息

2011年,对广西自治区进行禽流感流行病学调查时从野生哺乳动物果子狸体内分离到一株H5N1亚型禽流感病毒(AIV),命名为A/palm-civet/Guangxi/26/2011(H5N1)(PC/GX/26/11)。本研究对其全基因组序列进行测定及其对BALB/c鼠的致病性试验。全基因序列分析表明:该病毒属于Clade 2.3.2分支,其血凝素(HA)蛋白裂解位点存在多个连续的碱性氨基酸(-RRRR-),具有高致病性AIV(HPAIV)的典型分子特征,其HA、NA、PA、NS基因节段与A/muscovy duck/Vietnam/LBM57/2011(MD/VN/LBM57/11)(H5N1)有较高的同源性,为99.2%～99.6%;PB2、PB1、M、NP 4个基因节段与人源AIV A/Hubei/1/2010(HuB/1/10)(H5N1)的同源性最高,为99.0%～99.5%。动物试验显示:该病毒对小鼠的半数致死量为4.9 log EID50,对小鼠具有较高的致病性。在小鼠的肺和鼻甲骨中均能够进行良好的复制。以上结果表明,该分离株未经适应便具备感染哺乳动物并有较高致死的能力。

关键词：果子狸 H5N1亚型HPAIV 进化分析致病性

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7.2分支H5N1亚型禽流感病毒反向遗传疫苗候选株的构建

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中国预防兽医学报 2013年第9期35卷 764-766页

作者：范俊李旭勇王金良郭晶邓国华施建忠陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为应对clade7.2 H5N1亚型禽流感病毒(AIV)持续发生的抗原性改变及其引发的潜在AIV的地方性流行,需要根据流行监测的抗原分析结果挑选合适的供体株制备疫苗候选株。本研究采用反向遗传操作系统,以A/Puerto Rico/8/34(PR8)的内部基因为骨... 详细信息

为应对clade7.2 H5N1亚型禽流感病毒(AIV)持续发生的抗原性改变及其引发的潜在AIV的地方性流行,需要根据流行监测的抗原分析结果挑选合适的供体株制备疫苗候选株。本研究采用反向遗传操作系统,以A/Puerto Rico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以clade7.2 H5N1 AIV A/Chicken/Liao Ning/S4092/2011(CK/LN/S4092)基因组为模板经RT-PCR扩增其HA及NA基因,并对HA基因进行分子修饰,去除与H5亚型AIV致病力有关的HA蛋白裂解位点处的多个连续碱性氨基酸,使其获得低致病性AIV的分子特征(即将-PQIEGRRRKR-突变为-PQRETR-),从而构建出clade7.2 H5N1亚型AIV疫苗候选株rPR8-LN/S4092,为动物免疫试验奠定了基础。

关键词： clade 7 2 H5N1流感病毒反向遗传操作疫苗候选株

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一株类禽型H1N1亚型猪流感病毒的反向遗传系统的建立

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中国预防兽医学报 2013年第2期35卷 91-94页

作者：孟沙沙乔传玲陈艳杨焕良刘丽萍尹航辛晓光陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为建立H1N1亚型猪流感病毒A/swine/Jiangsu/40/2011(JS40)的反向遗传系统,本研究分别构建了JS40株8个基因节段的重组质粒,经转染293T和MDCK混合细胞,拯救出病毒R-JS40。序列测定结果表明,救获病毒与亲本病毒的核苷酸序列一致,无氨基酸变... 详细信息

为建立H1N1亚型猪流感病毒A/swine/Jiangsu/40/2011(JS40)的反向遗传系统,本研究分别构建了JS40株8个基因节段的重组质粒,经转染293T和MDCK混合细胞,拯救出病毒R-JS40。序列测定结果表明,救获病毒与亲本病毒的核苷酸序列一致,无氨基酸变异,可以稳定传代;抗原性未发生变化;对小鼠的致病性结果显示R-JS40与JS40对小鼠的组织嗜性以及在肺脏中复制的病毒滴度基本一致。以上结果表明R-JS40保持了亲本病毒JS40的生物学特性,该病毒反向遗传操作系统的建立,为进一步开展病毒的致病分子基础以及新型疫苗的研制提供有效的技术平台。

关键词：猪流感病毒类禽型 H1N1 反向遗传系统

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两株H6N8亚型禽流感病毒分离株的分离与鉴定

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中国预防兽医学报 2013年第3期35卷 177-180页

作者：张曦崔鹏飞朱占松谭丹李文辉关立峥邓国华陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为了解禽流感病毒(AIV)在我国华南地区的流行情况,我们对活禽市场中分离得到的两株鸭源H6N8亚型AIV[A/duck/Fujian/S2191/2011(H6N8)(FJ/191/11)和A/duck/Guizhou/S4035/2011(H6N8)(GZ/035/11)]进行全基因序列测定,并进行其对SPF鸡和BALB/c小鼠的致病性试验。序列分析显示:HA裂解位点基序为339PQIETR↓GLFG348,为低致病性AIV特征。内部基因分别源于两个国内流行的H6亚型病毒家系(ST339-like和HuN573-like)。序列分析表明FJ/191/11和GZ/035/11为H6亚型病毒与其他亚型AIV的N8NA基因发生重组,呈现明显的异源性。两分离株的感染性试验显示,它们对鸡和小鼠均呈低致病性;而且不能在鸡体内有效复制;对小鼠的感染性实验结果显示,小鼠肺脏和鼻甲病毒分离结果为阳性,其他脏器病毒滴定结果为阴性。

关键词：禽流感病毒 H6N8亚型抗原分析致病性

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H3亚型猪流感病毒抗原捕捉ELISA检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2013年第7期35卷 566-569页

作者：陈艳乔传玲杨焕良孔维辛晓光陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为快速检测H3亚型猪流感病毒(SIV),本研究将一株H3N2亚型SIV特异性单克隆抗体(MAb)进行纯化,建立了以多抗作为包被抗体,MAb作为检测抗体的H3亚型SIV抗原捕捉ELISA(AC-ELISA)方法。并对该方法的特异性和敏感性进行了分析,其敏感性是血凝... 详细信息

为快速检测H3亚型猪流感病毒(SIV),本研究将一株H3N2亚型SIV特异性单克隆抗体(MAb)进行纯化,建立了以多抗作为包被抗体,MAb作为检测抗体的H3亚型SIV抗原捕捉ELISA(AC-ELISA)方法。并对该方法的特异性和敏感性进行了分析,其敏感性是血凝试验的4倍,与猪繁殖与综合征病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒以及H1、H5、H9亚型SIV均没有明显的交叉性反应,批间和批内重复试验变异系数均小于10%。应用建立的AC-ELISA方法对84份H3亚型SIV实验室感染样品进行检测与鸡胚滴定病毒结果符合率达90.47%。本实验建立的AC-ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,可用于H3亚型SIV的临床检测。

关键词：猪流感病毒 H3亚型单克隆抗体抗原捕捉ELISA

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H6N2亚型禽流感病毒全基因组的序列分析及其致病性研究

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中国预防兽医学报 2013年第11期35卷 870-873页

作者：刘丽玲胡守萍段振华李雁冰施建忠田国彬曾显营陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

2008年对我国南方活禽市场进行流行病学监测时从鸭体内分离鉴定出1株H6N2亚型禽流感病毒(AIV)。为了解该病毒DK/GD/S6/08(H6N2)的生物学特征,本研究对其全基因序列进行分析并对SPF鸡和SPF鸭进行致病性试验。结果表明DK/GD/S6/08(H6N2)... 详细信息

2008年对我国南方活禽市场进行流行病学监测时从鸭体内分离鉴定出1株H6N2亚型禽流感病毒(AIV)。为了解该病毒DK/GD/S6/08(H6N2)的生物学特征,本研究对其全基因序列进行分析并对SPF鸡和SPF鸭进行致病性试验。结果表明DK/GD/S6/08(H6N2)的HA裂解位点附近的氨基酸序列为340QIETR↓GLF347,符合低致病力AIV的特征。其HA基因与A/duck/Shantou/8365/2005(H6N6)同源性最高;NA基因在颈部无缺失;除M基因外,其他5个内部基因均来源于H6亚型AIV。鸭致病性试验表明DK/GD/S6/08(H6N2)可以感染SPF鸭,并通过泄殖腔排毒,法氏囊等脏器中可以检测到病毒,肺脏、肾脏、法氏囊和脑组织中可见病理变化。鸡致病性试验显示鸡的脑、肺脏、脾脏、法氏囊、肾脏、十二指肠和胰腺均未检测到病毒,咽喉拭子和泄殖腔拭子中未检测到病毒,表明该病毒不能感染SPF鸡。

关键词：禽流感病毒 H6N2亚型序列分析致病性

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表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组腺病毒的构建及鉴定

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中国预防兽医学报 2013年第6期35卷 436-439页

作者：王伟刘春国王寿山张超林刘彦云吕让刘明东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部禽流感参考实验室黑龙江哈尔滨150001

为构建表达H 5N 1亚型clade 2.3.4禽流感病毒(AIV)HA基因的重组腺病毒,本研究通过RT-PCR扩增A/wild duck/Shandong/628/2011(H 5N 1)的H A基因,克隆于腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中,构建重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV-HA。采用A d-Easy技术,制备表达AIVHA基因的复制缺陷型重组腺病毒rAd-H A。将rA d-HA感染Ad293细胞,可产生明显的细胞病变。通过细胞超薄切片观察到完整的腺病毒颗粒。经RT-PCR、间接免疫荧光及western blot证明HA基因在A d293细胞中成功转录和表达,并且表达的蛋白具有良好的生物学活性。本研究为新型H5N1亚型AIV活载体疫苗的研发奠定了基础。

关键词：禽流感病毒 H5N1亚型 HA基因重组腺病毒

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一株鸭源H5N2禽流感病毒全基因组序列分析及对鸡的致病性研究

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中国预防兽医学报 2013年第10期35卷 783-786页

作者：朱占松张曦崔鹏飞谭丹关立峥李文辉邓国华陈化兰东北农业大学黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点实验室黑龙江哈尔滨150001

2012年在我国重庆市活禽交易市场进行流行病学调查时,从鸭体内分离到1株H5N2亚型禽流感病毒(AIV),DK/CQ036/12(H5N2)。为了解该株H5N2亚型AIV的生物学特性,本研究对其进行了全基因组分析及对SPF鸡和BALB/c小鼠的致病性试验。序列分析显... 详细信息

2012年在我国重庆市活禽交易市场进行流行病学调查时,从鸭体内分离到1株H5N2亚型禽流感病毒(AIV),DK/CQ036/12(H5N2)。为了解该株H5N2亚型AIV的生物学特性,本研究对其进行了全基因组分析及对SPF鸡和BALB/c小鼠的致病性试验。序列分析显示:HA裂解位点序列为341R-----346TRGLF350,为低致病性AIV特征。内部基因来源较复杂,与KD/CQ/036/12分离株的M基因NP基因同源性最高的病毒株均来自H4、H7等亚型分离株,呈明显的异源性。分离株的感染性试验显示,该分离株在鸡体内可以通过呼吸道和消化道向外排毒,但并不能在鸡体内有效的复制。对小鼠的感染性试验结果显示,仅在鼻甲和肺能检测到病毒存在,其他脏器病毒滴定结果为阴性,表明病毒对鸡和小鼠均呈低致病性。

关键词：禽流感病毒 H5亚型基因组分析致病性

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跨膜丝氨酸蛋白酶-4对2009甲型H1N1流感病毒HA的切割及其融合活性研究

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中国预防兽医学报 2013年第7期35卷 517-520页

作者：吴超温志远陈伟业施建忠葛金英步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

流感病毒血凝素(HA)被宿主蛋白酶切割活化是流感病毒复制和扩散的关键步骤。2009甲型H1N1流感病毒HA的裂解位点为单碱性氨基酸,只能被宿主特定组织部位表达的某些蛋白酶所切割活化。本研究构建了主要存在于人呼吸道和肺脏的跨膜丝氨酸... 详细信息

流感病毒血凝素(HA)被宿主蛋白酶切割活化是流感病毒复制和扩散的关键步骤。2009甲型H1N1流感病毒HA的裂解位点为单碱性氨基酸,只能被宿主特定组织部位表达的某些蛋白酶所切割活化。本研究构建了主要存在于人呼吸道和肺脏的跨膜丝氨酸蛋白酶4(TMPRSS4)的真核表达重组质粒pCA-TMPRSS4-Flag与表达2009甲型H1N1流感病毒中国四川分离株HA的真核重组表达质粒pCA-SCHA共转染293T细胞,利用westernblot证明2009甲型H1N1流感病毒的HA蛋白能够被TMPRSS4切割;通过激光共聚焦确定TMPRSS4和HA在293T细胞膜上共定位;并进一步通过细胞融合试验证明经正确切割的HA具有在低pH条件下介导细胞膜发生融合的生物学功能。本实验为研究自然感染情况下参与活化流感病毒的宿主胰蛋白酶提供了实验依据。

关键词： 2009甲型H1N1流感病毒跨膜丝氨酸蛋白酶-4 血凝素细胞融合

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