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H5N1亚型禽流感病毒A/goose/Guangdong/1/96的NS基因对鸡致病能力的影响

中国预防兽医学报 2007年第3期29卷 170-172页

作者：赵凤菊李泽君王爱琴赵玉军陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室沈阳农业大学辽宁沈阳110161 沈阳农业大学

为了解H5N1亚型禽流感病毒经自然途径感染SPF鸡后,病毒的致病能力与NS基因的关系,本文主要从病理学角度比较了两株利用反向基因操作技术拯救的病毒RGSGD/1/96和RGSGD/1/2NS的致病能力。虽然只有NS基因不同,但是这两株病毒经鼻腔感染4周... 详细信息

为了解H5N1亚型禽流感病毒经自然途径感染SPF鸡后,病毒的致病能力与NS基因的关系,本文主要从病理学角度比较了两株利用反向基因操作技术拯救的病毒RGSGD/1/96和RGSGD/1/2NS的致病能力。虽然只有NS基因不同,但是这两株病毒经鼻腔感染4周龄SPF鸡后表现出完全不同的致病能力,RGSGD/1/96对鸡的致死率为100%,感染鸡只的各组织脏器均可发现严重的病理损伤,该病毒在鸡体内复制能力很强,感染后3d、6d,各组织脏器均可发现大量的病毒抗原;GSGD/1/2NS对鸡的致死率为0,病毒在感染鸡体内只引起肺间质少量淋巴细胞浸润,免疫组织化学检查未发现病毒抗原信号。由于两株病毒只有NS基因不同,说明NS基因决定了H5N1亚型禽流感病毒A/goose/Guangdong/1/96对SPF鸡的致病能力。

关键词： H5N1 禽流感病毒 NS基因致病能力

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猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型多重RT-PCR诊断方法的建立

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中国预防兽医学报 2007年第9期29卷 714-718页

作者：杨焕良乔传玲陈艳辛晓光李一经陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030

对我国分离到的猪流感病毒和GenBank数据库中已有的猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型毒株的HA、NA基因核苷酸序列进行分析,分别选出各个病毒亚型HA和NA基因中高度保守且特异的核苷酸区域,设计扩增猪流感病毒H1和H3、N1和N2亚型的2套多重... 详细信息

对我国分离到的猪流感病毒和GenBank数据库中已有的猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型毒株的HA、NA基因核苷酸序列进行分析,分别选出各个病毒亚型HA和NA基因中高度保守且特异的核苷酸区域,设计扩增猪流感病毒H1和H3、N1和N2亚型的2套多重PCR特异性引物,建立了猪流感H1N1、H1N2和H3N2亚型病毒多重RT-PCR诊断方法。采用该方法对H1N1、H1N2、H3N2亚型猪流感病毒标准参考株进行RT-PCR检测,结果均呈阳性,对扩增得到的片段进行序列测定和BLAST比较,表明为目的基因片段。其它几种常见猪病病毒和其它亚型猪流感病毒的RT-PCR扩增结果都呈阴性。对107EID50/0.1mL病毒进行稀释,提取RNA进行敏感性试验,RT-PCR最少可检测到102EID50的病毒量核酸。对40份阳性临床样品的检测结果是H1N1、H1N2和H3N2亚型分别为16份、1份和20份,其它3份样品同时含有H1N1和H3N2亚型猪流感病毒,和鸡胚分离病毒结果100%一致。试验证明建立的猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型多重RT-PCR诊断方法是一种特异敏感的诊断方法,可用于临床样品的早期快速诊断和分型。

关键词：猪流感病毒 HIN1 HIN2 H3N2 多重RT-PCR

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禽流感H5亚型病毒血凝素基因的表达和抗原性分析

引用

黑龙江畜牧兽医 2007年第7期 23-26页

作者：王昱王秀荣石锐刘丽玲包红梅杨忠萍田丽娜陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 黑龙江民族职业学院黑龙江哈尔滨150081

参考已发表的Guangdong/96/1(H5N1)基因序列设计引物,用鸡胚扩增中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室保存的病毒,收集尿囊液,提取病毒RNA,经RT-PCR扩增HA基因,将PCR产物平端克隆到pMD18-T中,经酶切、PCR及测序鉴定后,... 详细信息

参考已发表的Guangdong/96/1(H5N1)基因序列设计引物,用鸡胚扩增中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室保存的病毒,收集尿囊液,提取病毒RNA,经RT-PCR扩增HA基因,将PCR产物平端克隆到pMD18-T中,经酶切、PCR及测序鉴定后,定向亚克隆到pET-30a表达载体中。重组子经酶切和测序鉴定为正确后,用IPTG诱导表达,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和薄层扫描分析重组蛋白的表达情况。重组蛋白r5HA经Ni-NTA *** Resins纯化,并复性,用Western Blotting分析重组蛋白的抗原性。结果表明:表达产物大小约为65 ku,主要存在于包涵体中,表达量约占总蛋白的30%;同时,表达的重组蛋白具有较好的抗原性和特异性,可以用作检测H5亚型禽流感病毒抗血清的捕获抗原。

关键词：禽流感病毒 H5亚型血凝素表达抗原性分析

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H7亚型禽流感病毒HA基因在杆状病毒系统中的表达

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中国预防兽医学报 2007年第4期29卷 268-271页

作者：郝婧邓国华姜永萍曲站红王桂芹郝永清陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 内蒙古农业大学动物科学与医学学院内蒙古呼和浩特010018

利用PCR反应,以特异性引物扩增禽流感病毒去除信号肽的H7亚型HA密码子优化基因,克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-HTB中,转座DH10感受态细胞,通过蓝白斑筛选、PCR鉴定获得阳性克隆,然后提取基因组Bacmid,转染Sf9昆虫细胞,得到含H7亚型流... 详细信息

利用PCR反应,以特异性引物扩增禽流感病毒去除信号肽的H7亚型HA密码子优化基因,克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-HTB中,转座DH10感受态细胞,通过蓝白斑筛选、PCR鉴定获得阳性克隆,然后提取基因组Bacmid,转染Sf9昆虫细胞,得到含H7亚型流感病毒HA基因的重组杆状病毒opti-H7HA-Bac。重组杆状病毒接种Sf9昆虫细胞,待绝大部分细胞产生细胞病变后收获细胞,细胞裂解产物经血凝试验、SDS-PAGE及Western blot分析证实。密码子优化的H7 HA基因在重组杆状病毒opti-H7HA-Bac感染Sf9细胞后获得高效表达,且具有良好的蛋白活性及特异免疫反应原性。

关键词：禽流感 H7亚型 HA基因重组杆状病毒

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A型流感病毒M2蛋白研究进展

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动物医学进展 2007年第7期28卷 56-60页

作者：万春和刘明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

M2蛋白是A型流感病毒所特有的一种结构保守的非糖基化的跨膜蛋白,主要在病毒脱壳时酸化病毒粒子的内部环境,在表面血凝素糖蛋白合成过程中作为质子通道调节高尔基体跨膜转移通道的pH。其核苷酸序列高度保守,几乎不发生变异。其25位~43... 详细信息

M2蛋白是A型流感病毒所特有的一种结构保守的非糖基化的跨膜蛋白,主要在病毒脱壳时酸化病毒粒子的内部环境,在表面血凝素糖蛋白合成过程中作为质子通道调节高尔基体跨膜转移通道的pH。其核苷酸序列高度保守,几乎不发生变异。其25位~43位氨基酸多肽是金刚烷胺类抗流感病毒药物的作用靶位,氨基酸极小变异都可能导致流感病毒抗药性的产生。M2蛋白胞外区域的氨基酸残基多肽（M2e）的特异性抗体可以在感染流感病毒的动物血清中检测出来,将M2e与相关佐剂联合使用可极大的提高机体对流感病毒的免疫力,在病毒感染中起重要作用,是一种潜在的交叉保护性抗原,常被用来探索具有广谱性和持久性的流感＂通用疫苗＂。

关键词： A型流感病毒 M2蛋白疫苗

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H1亚型猪流感病毒血凝素基因在昆虫细胞中的表达及其间接ELISA方法的初步建立

H1亚型猪流感病毒血凝素基因在昆虫细胞中的表达及其间接ELISA方...

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第七届全国病毒学学术研讨会暨第二届武汉现代病毒学国际研讨会

作者：万春和刘明刘春国张晓霁杨涛张云郭东春中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室

根据 GenBank 发表的 H1亚型猪流感 HA 基因序列设计引物,扩增出 HA 基因片段,将其克隆到 pFastBacGP67B 杆状病毒载体上,筛选阳性重组转座载体 pFastBacGP67B-H1,转化含有杆状病毒穿梭载体(bacmid)的 DH10Bac 感受态细

关键词：昆虫细胞猪流感流感病毒血凝素基因 ELISA

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流感病毒M2蛋白研究进展

流感病毒M2蛋白研究进展

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

作者：万春和刘明刘春国张晓霁杨涛中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室

目前,每年的流感流行都会造成世界范围内约有10%～20%的人感染流感病毒,其中约有300～500万人会产生严重症状,并可导致大约25～50万人的死亡,给整个人类社会带来很大的经济负担。目前的禽流感疫情更是引起全世界的关注和恐慌,截至2007年... 详细信息

目前,每年的流感流行都会造成世界范围内约有10%～20%的人感染流感病毒,其中约有300～500万人会产生严重症状,并可导致大约25～50万人的死亡,给整个人类社会带来很大的经济负担。目前的禽流感疫情更是引起全世界的关注和恐慌,截至2007年4月2日,世界卫生组织(WHO)证实已经有288人感染禽流感,其中170人死亡。全世界已有超过218亿只的家禽染病死亡或遭扑杀,造成的经济损失高达400亿美元[1-2]。

关键词：流感病毒氨基酸序列胞外区金刚烷胺金刚乙胺

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重组细胞高产型H3N2猪流感病毒株的拯救

重组细胞高产型H3N2猪流感病毒株的拯救

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第七届全国病毒学学术研讨会暨第二届武汉现代病毒学国际研讨会

作者：杨涛刘明刘春国张云刘大飞陈浩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室

为拯救出一株能够在动物传代细胞中高水平复制的 H3N2亚型猪流感疫苗株, 本研究利用反向遗传操作技术,将 A/Goose/Dalian/3/01(H9N2)毒株的 PB1、PA、 NP、M、NS 基因和 A/PR/8毒株的 PB2基因作为内部基因与猪流感病毒

关键词：猪流感病毒

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H3N2亚型猪流感病毒进化分析及重组HA1蛋白间接ELISA诊断方法的建立

H3N2亚型猪流感病毒进化分析及重组HA1蛋白间接ELISA诊断方法的建...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

作者：丁选亚乔传玲杨焕良陈艳辛晓光韩庆功陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室

对2004～2005年中国某些省市猪群进行猪流感血清学和病原学调查研究,从1238份猪鼻棉拭子样品和死亡猪肺、气管样品中分离到5株H3N2亚型猪流感病毒。通过比较发现这5株病毒的HA基因同源性较高,达99%以上。对其中的一株病毒A/Swine/Guangd... 详细信息

对2004～2005年中国某些省市猪群进行猪流感血清学和病原学调查研究,从1238份猪鼻棉拭子样品和死亡猪肺、气管样品中分离到5株H3N2亚型猪流感病毒。通过比较发现这5株病毒的HA基因同源性较高,达99%以上。对其中的一株病毒A/Swine/Guangdong/9/05(H3N2)(缩写SW/GD/9/05)的8个基因片段进行了序列测定与分析,基于HA、PB2及NP基因绘制了系统进化树。结果表明分离株属于近期人流感病毒分支,其某些氨基酸位点发生了突变。将RT-PCR扩增的全长HA基因克隆到pMD-18T载体,

关键词：猪流感病毒 HA1 ELISA

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H1亚型猪流感病毒血凝素基因在昆虫细胞中的表达及生物活性鉴定

H1亚型猪流感病毒血凝素基因在昆虫细胞中的表达及生物活性鉴定

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

作者：万春和刘明刘春国张云张晓霁杨涛郭东春中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

将H1亚型猪流感病毒的血凝素(HA)基因克隆到pFastBacGP67A载体上,经酶切鉴定及测序筛选出阳性重组质粒后,转化DH10Bac感受态细胞与杆状病毒转移载体(bacmid)进行转座,通过蓝白斑筛选获得重组杆状病毒穿梭载体,在脂质体介导下转染sf9昆... 详细信息

将H1亚型猪流感病毒的血凝素(HA)基因克隆到pFastBacGP67A载体上,经酶切鉴定及测序筛选出阳性重组质粒后,转化DH10Bac感受态细胞与杆状病毒转移载体(bacmid)进行转座,通过蓝白斑筛选获得重组杆状病毒穿梭载体,在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,经过三轮蚀斑纯化,获得重组杆状病毒rHA,再感染细胞,超声收获HA蛋白。通过血凝和血凝抑制、免疫印迹法、ELISA分析表明该蛋白得到表达,且具有与天然蛋白相似的生物活性,为研制猪流感病毒基因工程亚单位疫苗奠定基础,也可通过所表达的蛋白来研制猪流感ELISA检测试剂盒来做猪流感血清流行病学调查,为防控流感大流行提供参考。

关键词：猪流感病毒血凝素基因杆状病毒表达生物活性昆虫细胞

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