检索结果-内蒙古大学图书馆

第15届世界禽病大会、中国畜牧兽医学会2007年学术年会

作者：刘大飞杨涛刘明刘春国何利昆刘大程桑学波中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室辽宁省动物疫病预防控制中心莱阳市城厢兽医站黑龙江农垦总局畜牧兽医总站哈尔滨分站

为了进一步研究 A 型流感病毒核蛋白功能及在诊断中的应用。本研究采用 RT-PCR 技术分别扩增 A/Swine/Guangdong/LM2/05(H1N1)、A/Chicken/Guangdong/W2/04(H5N1)流感病毒的 NP 基因,分别将其克隆到原核表达载体 pET30(a)上,在大肠杆菌... 详细信息

为了进一步研究 A 型流感病毒核蛋白功能及在诊断中的应用。本研究采用 RT-PCR 技术分别扩增 A/Swine/Guangdong/LM2/05(H1N1)、A/Chicken/Guangdong/W2/04(H5N1)流感病毒的 NP 基因,分别将其克隆到原核表达载体 pET30(a)上,在大肠杆菌中进行诱导表达。SDS-PAGE 和 Western-Blotting 检测表明：H1N1亚型猪流感病毒 NP 蛋白得到表达,并且能分别与 H1N1和 H5N1亚型流感病毒的鼠高免血清发生特异性反应,具有良好的反应活性;而 H5N1亚型禽流感病毒的重组 NP 蛋白未获得表达。结论为以 NP 蛋白为诊断抗原的诊断试剂的开发、ELISA 诊断方法的建立、及蛋白功能的研究奠定了基础;本结果同时说明不同毒株的 NP 蛋白在大肠杆菌中的表达具有一定差异性。

关键词：流感病毒原核表达

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本地毛形线虫49 Ku ES蛋白结构基因的分子克隆及原核表达

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中国预防兽医学报 2007年第7期29卷 510-514页

作者：郑宝亮王秀荣路义鑫李冬梅闫清波宋铭忻郑州牧业工程高等专科学校生物工程系河南郑州450011 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学院预防医学系寄生虫学教研室黑龙江哈尔滨150030

提取Trichinella nativa(***)肌幼虫的总RNA,用RT-PCR方法扩增出了编码*** 49 Ku ES蛋白的结构基因。基因克隆后测序,序列测定结果表明:目的基因TNPG长度为951 bp,核苷酸序列同已发表的Trichinella spiralis(***)相应的序列P49同源性为9... 详细信息

提取Trichinella nativa(***)肌幼虫的总RNA,用RT-PCR方法扩增出了编码*** 49 Ku ES蛋白的结构基因。基因克隆后测序,序列测定结果表明:目的基因TNPG长度为951 bp,核苷酸序列同已发表的Trichinella spiralis(***)相应的序列P49同源性为97.68%,所推导的氨基酸序列同源性为95.24%。将目的基因TNPG插入到原核表达载体pET-30a的BamHⅠ酶切位点处,并转化到感受态表达菌中进行诱导表达。结果显示TNPG在原核表达菌BL-21中获得了高效表达,表达产物为40.8 Ku的融合蛋白,表达量达到菌体总蛋白的22.8%。通过Western blot分析,表达产物可以被小鼠***和***阳性血清以及它们的中国地理株的小鼠血清特异性识别。

关键词：旋毛虫 nativa种旋毛虫 spiralis种 49 Ku ES蛋白基因序列 Westem blot分析

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DNA疫苗制备工艺研究

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新疆农业大学学报 2007年第4期30卷 38-40页

作者：夏俊姜永萍简子健左青山王岳陈化兰新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830052 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

以禽流感DNA疫苗pCAOH5转化大肠杆菌JM109后,利用发酵罐进行发酵培养。将菌体悬浮裂解中和后,经澄清和浓缩处理,利用阴离子交换色谱对其进行纯化。结果表明实验室规模的技术路线完全能够为质粒DNA的工业化制备奠定技术基础。

关键词： DNA疫苗禽流感发酵色谱质粒

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猪源H9N2亚型流感病毒HA基因的序列测定及真核表达

猪源H9N2亚型流感病毒HA基因的序列测定及真核表达

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

作者：韩庆功乔传玲杨焕良陈艳辛晓光丁选亚陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室河南科技学院动物科学学院

利用RT-PCR扩增猪流感病毒A/Swine/Zhejiang/7/2004(H9N2)HA基因,测序后将其克隆到真核表达载体pCAGGS上,经酶切分析、PCR鉴定和测序验证,得到重组表达质粒pCAGGS-HA,之后将其转染293T细胞,48h后收集转染细胞样品,进行SDS-PAGE分析,结... 详细信息

利用RT-PCR扩增猪流感病毒A/Swine/Zhejiang/7/2004(H9N2)HA基因,测序后将其克隆到真核表达载体pCAGGS上,经酶切分析、PCR鉴定和测序验证,得到重组表达质粒pCAGGS-HA,之后将其转染293T细胞,48h后收集转染细胞样品,进行SDS-PAGE分析,结果显示HA蛋白获得了表达,经Western-blot检测,结果表明pCAGG-HA能够在体外瞬时表达具有免疫学活性的HA蛋白,通过免疫小鼠,对其免疫效果进行了初步研究。

关键词：猪流感病毒 HA基因序列测定真核表达

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4株不同亚型流感病毒NP基因的原核表达

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动物医学进展 2007年第12期28卷 12-18页

作者：刘大飞杨涛刘明刘春国何利昆桑学波刘大程中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 辽宁省动物疫病预防控制中心辽宁沈阳110161 黑龙江农垦总局畜牧兽医总站哈尔滨分站黑龙江哈尔滨150038 莱阳市城厢兽医站山东莱阳265200

为了进一步研究A型流感病毒核蛋白功能及在诊断中的应用,采用RT-PCR技术分别扩增H1N1、H3N2、H5N1、H9N2等4株不同亚型流感病毒的NP基因,分别将其克隆到原核表达载体pET30(a)上,在大肠埃希菌中进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blot检... 详细信息

为了进一步研究A型流感病毒核蛋白功能及在诊断中的应用,采用RT-PCR技术分别扩增H1N1、H3N2、H5N1、H9N2等4株不同亚型流感病毒的NP基因,分别将其克隆到原核表达载体pET30(a)上,在大肠埃希菌中进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,H1N1亚型流感病毒NP蛋白得到表达,并且能分别与H1N1和H5N1亚型流感病毒的鼠高免血清发生特异性反应,具有良好的反应活性;而H3N2、H5N1、H9N2亚型流感病毒的重组NP蛋白未获得表达。本研究结果表明,不同毒株的NP蛋白在大肠埃希菌中的表达具有一定差异性,为把NP蛋白作为诊断抗原的开发、ELISA诊断方法的建立以及蛋白功能的研究奠定了基础。

关键词：流感病毒 NP基因原核表达

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H3N2亚型猪流感病毒HA基因序列测定及抗原性分析

H3N2亚型猪流感病毒HA基因序列测定及抗原性分析

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第七届全国病毒学学术研讨会暨第二届武汉现代病毒学国际研讨会

作者：刘大飞杨涛刘明刘春国何利昆桑学波刘大程中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室辽宁省动物疫病预防控制中心黑龙江农垦总局畜牧兽医总站哈尔滨分站莱阳市城厢兽医站

采用 RT-PCR 技术对4株 H3N2亚型猪流感病毒的 HA 基因进行了扩增,将获得的 PCR 产物分别与 pMD18-T 克隆载体连接,进行序列测定。测序结果显示:4 个毒株均含有完整的开放阅读框,并且均未发现核苷酸插入或缺失现象;分离毒

关键词：

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H5N1亚型AIV NS1基因在大肠杆菌中的表达

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畜牧与饲料科学 2007年第4期28卷 21-23页

作者：刘畅焦培荣刘威龙侯勇跃陈化兰内蒙古农业大学动物科学与医学学院内蒙古呼和浩特010018 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 内蒙古农牧业科学院动物医学研究所内蒙古呼和浩特010030

根据已测得的H5N1亚型禽流感病毒的NS基因序列,设计并合成一对特异性引物NS1U/NS1L,利用RT-PCR方法扩增出该毒株的NS1基因。将酶切处理后的基因片段定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)上,通过酶切分析及序列测定,鉴定出了NS1基因片段的... 详细信息

根据已测得的H5N1亚型禽流感病毒的NS基因序列,设计并合成一对特异性引物NS1U/NS1L,利用RT-PCR方法扩增出该毒株的NS1基因。将酶切处理后的基因片段定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)上,通过酶切分析及序列测定,鉴定出了NS1基因片段的阳性重组子。转化BL21大肠杆菌感受态细胞后,经IPTG诱导和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,成功表达出大小约45.0kD的NS1融合蛋白,表达产物主要存在于包涵体中。用West-ern-Blotting证实重组融合蛋白可以特异性地被标准阳性血清所识别。

关键词： H5N1亚型禽流感病毒非结构蛋白克隆表达

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表达载体pCAGGS显著增强禽流感DNA疫苗的免疫保护效果

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中国农业科学 2006年第4期39卷 825-830页

作者：姜永萍张洪波步志高李呈军赵有淑王秀荣于康震陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部畜牧兽医总站

目的将A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的HA基因插入鸡β-actin启动子高效真核表达载体pCAGGS,构建了DNA疫苗质粒pCAGGHA5,以提高H5亚型禽流感DNA疫苗的表达水平和免疫保护效果。方法将pCAGGHA5和表达GD/1/96(H5N1)HA基因的质粒pCIHA5通过间接免疫荧光法和Western-blot分析检测转染293T细胞后瞬时表达的HA抗原蛋白,随之将pCAGGHA5及pCIHA5分别以100μg和10μg剂量一次免疫3周龄SPF鸡,4周后用100LD50的HPAIVGD/1/96(H5N1)鼻腔途径进行攻击。结果间接免疫荧光法和Western-blot分析表明2种表达质粒均可正确表达H5亚型HA抗原蛋白,载体pCAGGS表达水平显著高于载体pCI;免疫SPF鸡后,100μgpCAGGHA5可形成5/5的免疫保护,100μgpCIHA5可形成2/4的免疫保护,10μgpCAGGHA5可形成对免疫鸡5/5的免疫保护,而10μgpCIHA5则基本不能形成免疫保护,pCAGGHA5诱导的HI抗体水平远远高于pCIHA5。结论鸡β-actin启动子表达载体pCAGGS可显著提高HA基因体外表达水平和H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平,增强免疫保护效果。

关键词：禽流感 H5亚型鸡β-actin启动子 DNA疫苗免疫保护

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HA基因密码子及表达载体优化的H5亚型禽流感DNA疫苗免疫保护效果比较

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农业生物技术学报 2006年第3期14卷 301-306页

作者：姜永萍张洪波李呈军步志高邓国华于康震陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部畜牧兽医总站

为评估HA基因密码子优化及不同表达载体对H5亚型禽流感DNA疫苗免疫效果的影响,pCIHA5、pCAGGHA5、pCIoptiHA5和pCAGGoptiHA5分别以100和10μg剂量一次免疫3周龄SPF鸡,4周后分别用100LD50的高致病力禽流感病毒(HPAIV)A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]鼻腔途径进行攻击,观察发病与死亡情况,分别于攻毒后第3、5和7无采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测排毒情况,同时检测免疫后、攻毒前及攻毒后血清HI抗体、AGP抗体的动态变化,对4种疫苗单次免疫的免疫保护效果进行比较评估。结果表明,100μg剂量组中,pCAGGoptiHA5和pCAGGHA5均可对免疫鸡形成100%完全保护(不发病、不致死和不排毒),pCIoptHA5(75%)和pCIHA5(50%)仅可形成部分免疫保护;10μg剂量免疫组中,pCAGGoptiHA5和pCAGGHA5可对免疫鸡形成100%的保护(不发病和不致死),pCIoptiHA5可形成对免疫鸡的部分免疫保护(75%),而pCIHA5则基本不能形成免疫保护。结果表明,HA基因密码子的优化以及鸡β-actin启动子表达载体pCAGGS可显著提高H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平,增强免疫保护效果同时证明,通过密码子和载体的优化,可使H5亚型禽流感DNA疫苗有效免疫保护剂量降低至10μg,其推广应用已具备充分的经济可行性。pCAGGoptiHA5作为免疫效果良好、成本低廉的优化DNA疫苗,有望成为预防H5亚型高致病力禽流感的高效、安全新型基因工程疫苗。

关键词：禽流感 H5亚型 DNA疫苗免疫保护

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SYBR Green I荧光RT-PCR方法检测禽流感病毒

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畜牧兽医学报 2006年第11期37卷 1189-1193页

作者：刘丽玲姜永萍王秀荣陈化兰魏萍中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 东北农业大学哈尔滨150030

为建立检测禽流感病毒(AIV)的SYBR Green I荧光RT-PCR方法,根据AIV的M基因保守区的核苷酸序列设计引物。用4株不同亚型的AIV感染MDCK细胞,收集感染6、12、24、48、72 h的病毒。另外采取169份鸡的泄殖腔拭子和咽喉拭子。对上述样品的M基... 详细信息

为建立检测禽流感病毒(AIV)的SYBR Green I荧光RT-PCR方法,根据AIV的M基因保守区的核苷酸序列设计引物。用4株不同亚型的AIV感染MDCK细胞,收集感染6、12、24、48、72 h的病毒。另外采取169份鸡的泄殖腔拭子和咽喉拭子。对上述样品的M基因进行检测,试图建立快速检测AIV的SYBR Green I荧光RT-PCR方法,并与普通RT-PCR方法和传统的病毒滴定方法进行比较。结果表明:此次建立的检测AIV的SYBRGreen I荧光RT-PCR方法能检测到感染MDCK细胞后72 h的AIV,对169份泄殖腔拭子和咽喉拭子中的AIV检出率为5.33%(9/169),而普通RT-PCR方法检出率为6.51%(11/169),病毒滴定检出率为5.62(9/160)。对其他病毒(NDVI、BDVI、BV、VA)则未检测到,且整个检测过程只需4 h,表明该方法特异、准确、快速。

关键词：禽流感病毒 SYBR Green Ⅰ RT—PCR RT—PCR 病毒滴定检测

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