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中国动物传染病学报 2024年第6期32卷 176-181页

作者：王晓刘传霞鲍苗菲李雪雯李婷婷陈欣郑君翁长江中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室基础免疫创新团队哈尔滨150069

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染家猪或野猪而引起的一种高度接触性传染病。ASFV编码超过150种蛋白,其中大多数蛋白的功能有待鉴定。本研究旨在表达ASFV p34蛋白,并制备其单克隆抗体,为p34蛋白的功能研究提供材料。首先构建了... 详细信息

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染家猪或野猪而引起的一种高度接触性传染病。ASFV编码超过150种蛋白,其中大多数蛋白的功能有待鉴定。本研究旨在表达ASFV p34蛋白,并制备其单克隆抗体,为p34蛋白的功能研究提供材料。首先构建了重组原核表达质粒pET-21a-p34,将质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE以及Western blot鉴定,结果显示,得到了可溶性表达的His-p34重组蛋白。将纯化的蛋白免疫小鼠,然后通过细胞融合以及ELISA筛选,获得了1株能够稳定分泌p34蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经Western blot鉴定,该抗体能够特异性识别通过转染质粒过表达的外源p34蛋白以及ASFV感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)表达的内源p34蛋白;免疫荧光试验表明,外源转染以及内源表达的p34蛋白均能被特异性标记;免疫沉淀(IP)试验结果显示,该单克隆抗体能够特异性的结合HEK293T细胞中外源表达的p34蛋白以及ASFV感染PAMs中内源表达的p34蛋白。综上所述,本研究成功制备了p34蛋白的单克隆抗体,该抗体可以用于内源性p34蛋白的鉴定,为该蛋白的功能研究奠定了基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 p34蛋白原核表达单克隆抗体

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非洲猪瘟病毒pK145R蛋白的原核表达及抗血清的制备

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中国动物传染病学报 2023年第1期31卷 174-180页

作者：张涛清张元峰赵改红郑君翁长江中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室基础免疫创新团队哈尔滨150069

为制备兔抗ASFV pK145R蛋白的多克隆抗体,本研究以中国首次分离的ASFV HLJ/18毒株K145R基因的真核表达质粒p CAGGS-Flag-K145R为模板扩增K145R基因,构建重组原核表达质粒p ET-21a-K145R,利用镍亲和层析预装柱纯化p K145R蛋白并免疫新西... 详细信息

为制备兔抗ASFV pK145R蛋白的多克隆抗体,本研究以中国首次分离的ASFV HLJ/18毒株K145R基因的真核表达质粒p CAGGS-Flag-K145R为模板扩增K145R基因,构建重组原核表达质粒p ET-21a-K145R,利用镍亲和层析预装柱纯化p K145R蛋白并免疫新西兰大白兔,制备兔抗ASFV pK145R蛋白多克隆抗体,并通过免疫印迹(WB)、间接免疫荧光(IFA)及免疫沉淀(IP)试验对该抗体进行验证。结果显示:本研究成功构建了原核表达质粒p ET-21a-K145R,将该质粒转化细菌BL21(DE3)获得能够可溶性表达p K145R蛋白的重组菌,分子量约为16.0 kDa;利用高度纯化的ASFV pK145R蛋白,制备了兔抗ASFV pK145R蛋白的多克隆抗体,该抗体能够特异性地识别HEK293T细胞中瞬时表达的Flag-K145R蛋白和ASFV感染猪肺泡巨噬细胞中表达的ASFV K145R蛋白。本实验为深入研究p K145R蛋白的功能及其在ASFV感染致病性中的作用奠定了基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 pK145R蛋白原核表达多克隆抗体

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非洲猪瘟病毒p54蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

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中国动物传染病学报 2023年第1期31卷 166-173页

作者：赵改红张涛清向志达张元峰李江南翁长江中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室基础免疫创新团队哈尔滨150069 长江大学动物科学学院荆州434025

本研究以ASFV Pig/HLJ/18分离株基因组DNA为模板扩增tE183L基因片段,构建重组原核表达质粒pET-21a-tE183L。将其转化BL21(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导表达可溶性p54蛋白,并将采用镍亲和层析柱和分子筛纯化的p54与弗氏佐剂等比混合后免... 详细信息

本研究以ASFV Pig/HLJ/18分离株基因组DNA为模板扩增tE183L基因片段,构建重组原核表达质粒pET-21a-tE183L。将其转化BL21(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导表达可溶性p54蛋白,并将采用镍亲和层析柱和分子筛纯化的p54与弗氏佐剂等比混合后免疫新西兰大白兔,采集血清经Protein G亲和层析纯化得到兔抗p54多克隆抗体。研究结果表明,构建的原核表达质粒p ET-21a-t E183L可成功表达p54蛋白且纯度较高。Western blot、间接免疫荧光和免疫沉淀试验结果显示,纯化的抗p54多克隆抗体能特异性识别HEK293T细胞中瞬时表达的Flag-ASFV p54蛋白和ASFV感染肺泡巨噬细胞(PAMs)后表达的ASFV p54蛋白。本研究成功表达和纯化p54可溶性蛋白;制备的多克隆抗体有良好的特异性,这为深入探讨ASFV p54蛋白的生物学功能奠定了基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 p54蛋白多克隆抗体

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非洲猪瘟病毒E184L蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备

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中国动物传染病学报 2023年

作者：李雪雯李婷婷李长尧焦爽郑君荣俊翁长江长江大学生命科学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室基础免疫创新团队黑龙江省兽医免疫学重点实验室

本研究旨在表达非洲猪瘟病毒（ASFV）E184L蛋白（pE184L），并制备单克隆抗体（mAb），为其功能研究提供物质基础。首先，构建出了原核表达质粒pET21a-E184L并表达重组pE184L-His蛋白，使用镍亲和层析的方法对pE184L进行纯化，用纯化后... 详细信息

本研究旨在表达非洲猪瘟病毒（ASFV）E184L蛋白（pE184L），并制备单克隆抗体（mAb），为其功能研究提供物质基础。首先，构建出了原核表达质粒pET21a-E184L并表达重组pE184L-His蛋白，使用镍亲和层析的方法对pE184L进行纯化，用纯化后的蛋白对小鼠进行免疫，随后将阳性小鼠进行迫杀并取其脾细胞与SP2/0细胞进行融合，经间接ELISA方法筛选出能稳定分泌pE184L mAb的杂交瘤细胞。Western blot结果该抗体能够特异性识别过表达的外源pE184蛋白以及ASFV感染猪肺泡巨噬细胞（PAMs）表达的内源pE184蛋白。IFA结果表明该株mAb能特异性标记过表达的pE184L蛋白及在ASFV感染的PAMs细胞中表达的内源pE184L蛋白。Co-IP试验结果表明该株mAb能特异性结合过表达的pE184L蛋白及在ASFV感染的PAMs细胞中表达的内源pE184L蛋白。本研究成功表达并纯化了可溶性E184L蛋白，并制备了一株pE184L mAb，该mAb与pE184L蛋白具有良好的反应性，这为ASFV pE184L的生物学功能研究奠定了基础。

关键词： ASFV E184L 原核表达单克隆抗体

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伪狂犬病毒gB蛋白纯化及单克隆抗体的制备

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中国动物传染病学报 2023年

作者：焦爽李长尧张朝霞翁长江熊涛长江大学生命科学学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/基础免疫创新团队黑龙江省兽医免疫重点实验室

本研究利用昆虫杆状病毒表达系统对伪狂犬病毒（PRV）gB基因中富含抗原表位区段进行融合表达及纯化，并将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠以制备单克隆抗体（mAb）。小鼠经三次免疫后，利用iELISA检测其血清中抗gB蛋白的抗体效价，并将抗... 详细信息

本研究利用昆虫杆状病毒表达系统对伪狂犬病毒（PRV）gB基因中富含抗原表位区段进行融合表达及纯化，并将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠以制备单克隆抗体（mAb）。小鼠经三次免疫后，利用iELISA检测其血清中抗gB蛋白的抗体效价，并将抗体效价达到2×104以上的小鼠进行细胞融合。随后通过iELISA和IFA实验对阳性杂交瘤细胞进行筛选。经3-4次亚克隆筛选后，得到了一株可以稳定分泌gB mAb的杂交瘤细胞株293。同时，对其进行亚类鉴定发现该株细胞分泌的抗体类型为IgM型。本研究为建立新型ELISA检测试剂盒、新型疫苗的开发以及后续中和抗体的研究提供了良好的生物材料。

关键词：伪狂犬病毒 gB基因昆虫杆状病毒单克隆抗体

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非洲猪瘟病毒DP148R蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

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中国预防兽医学报 2022年第3期44卷 301-306页

作者：王永琦郑君翁长江中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/基础免疫创新团队黑龙江哈尔滨150069

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)DP148R蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究构建了重组原核表达质粒pET-28a-DP148R,通过PCR和测序鉴定正确后经原核表达并纯化了重组DP148R蛋白,将其按常规方法免疫BALB/c小鼠,取小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,... 详细信息

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)DP148R蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究构建了重组原核表达质粒pET-28a-DP148R,通过PCR和测序鉴定正确后经原核表达并纯化了重组DP148R蛋白,将其按常规方法免疫BALB/c小鼠,取小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过ELISA方法筛选,获得一株能稳定分泌DP148R蛋白MAb的杂交瘤细胞株7D6。采用间接ELISA方法检测了该MAb的抗体效价,利用DP148R截短表达的各重组蛋白为抗原,采用western blot方法鉴定了该MAb识别的抗原表位,通过western blot和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定了该MAb的反应原性。鉴定结果显示,纯化的MAb效价高于1:105,MAb 7D6为IgG2b亚型,该MAb识别的线性抗原表位为29LYWVFRAIHI38;分别采用western blot和IFA两种方法鉴定,结果均显示,纯化的MAb既能够特异性识别HEK293T细胞中表达的Flag-DP148R蛋白,也能够识别ASFV感染的PAMs细胞中表达的DP148R蛋白,反应原性较强。本研究制备的ASFV DP148R蛋白MAb可以为ASF诊断方法的建立以及DP148R蛋白的生物学功能研究提供参考依据。

关键词：非洲猪瘟病毒 DP148R蛋白原核表达单克隆抗体

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非洲猪瘟病毒E301R蛋白单克隆抗体的制备及其初步应用

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中国预防兽医学报 2022年第9期44卷 963-969页

作者：刘学敏张元峰王永琦康力黄丽翁长江中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/基础免疫创新团队黑龙江哈尔滨150069

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)E301R蛋白单克隆抗体(MAb),本研究通过原核表达系统表达并纯化了重组E301R蛋白(r E301R)。将其免疫BALB/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到1株能够稳定分泌E301R蛋白MAb的杂交瘤细胞株8B3,亚类鉴定结果显示8B3 MA... 详细信息

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)E301R蛋白单克隆抗体(MAb),本研究通过原核表达系统表达并纯化了重组E301R蛋白(r E301R)。将其免疫BALB/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到1株能够稳定分泌E301R蛋白MAb的杂交瘤细胞株8B3,亚类鉴定结果显示8B3 MAb为IgG1型。利用一系列表达部分重叠的重组E301R片段并经western blot鉴定8B3 MAb识别的抗原表位,结果显示,8B3 MAb识别的抗原表位为^(1)MSEDIRRGPGRPPKKRVVPN。采用western blot检测制备的8B3 MAb与HEK293T细胞中过表达的E301R蛋白(不同剂量)及ASFV感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)后(感染后不同时间)天然表达的E301R蛋白的反应性;采用间接免疫荧光试验(IFA)检测8B3 MAb与293T细胞中过表达的E301R蛋白的反应性及E301R蛋白在细胞中的定位。Western blot结果显示,过表达E301R蛋白的293T细胞出现了36 ku左右的特异性条带,且随着转染质粒量的增加,蛋白表达量增加;感染ASFV的PAM中(感染后8 h)出现了36 ku左右的特异性条带,且随着感染时间的延长,蛋白表达量增加。IFA结果显示,在过表达E301R蛋白的293T细胞中出现绿色荧光,且其定位于细胞质中。以上结果表明,制备的8B3MAb既能够与过表达的E301R蛋白,也能够与天然表达的E301R蛋白反应,反应性较强。将8B3 MAb用于免疫共沉淀(Co-IP)试验检测293T细胞中过表达的E301R蛋白和Flag-Agarose结合后与8B3 MAb的反应性。结果显示,8B3 MAb可以检测到结合在Flag-Agarose上的E301R蛋白,出现约36 ku的特异性条带。表明8B3 MAb可以用于Co-IP试验。这些研究结果为进一步研究E301R蛋白的功能奠定实验基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 E301R蛋白单克隆抗体抗原表位

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一种检测蛋白酶活性的荧光素酶报告基因系统的构建及应用

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中国预防兽医学报 2023年第5期45卷 535-539页

作者：周仕君宋洁李帅刘佳李江南翁长江中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/基础免疫创新团队黑龙江哈尔滨150069 黑龙江省免疫学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为建立一种检测蛋白酶活性的方法,本研究将IL-1β前体基因和荧光素酶基因融合,克隆至p CAGGS真核载体,构建了基于荧光素酶的报告基因系统(iGLuc),同时构建GLuc真核表达质粒作为对照。以PRRSV nsp4和ASFV S273R蛋白酶为检测对象,利用该... 详细信息

为建立一种检测蛋白酶活性的方法,本研究将IL-1β前体基因和荧光素酶基因融合,克隆至p CAGGS真核载体,构建了基于荧光素酶的报告基因系统(iGLuc),同时构建GLuc真核表达质粒作为对照。以PRRSV nsp4和ASFV S273R蛋白酶为检测对象,利用该报告基因系统对病毒蛋白酶活性进行检测,将iGLuc中蛋白酶酶切位点(FVCDAN)相对应的基因序列替换为Kpn I酶切位点,构建重组质粒Kpn I-iGLuc,然后分别将PRRSV nsp4和ASFV S273R蛋白酶切割位点对应的核酸序列插入至报告基因Kpn I-iGLuc中的Kpn I位点,构建重组质粒nsp4-iGLuc和S273R-i GLuc。分别将报告基因质粒(iGLuc、GLuc、Kpn I-i GLuc、nsp4-i GLuc和S273R-iGLuc)与不同剂量的相应蛋白酶真核表达质粒共转染HEK293T细胞,24 h后检测上清中荧光素酶GLuc的活性。结果显示,转染i GLuc、nsp4-iGLuc或S273R-iGLuc质粒的上清中荧光信号随着相应蛋白酶的剂量增加而升高,呈现剂量依赖性,而缺失蛋白酶切位点的对照质粒无该现象,表明构建的荧光素酶报告基因能够特异性地检测细胞蛋白酶和病毒蛋白酶的活性。本研究首次建立了一种检测蛋白酶活性的方法,并以PRRSV nsp4和ASFV S273R蛋白酶验证了该方法的应用价值,为后续开展高通量化筛选抗PRRSV、ASFV等药物的研究奠定了基础。

关键词：蛋白酶活性荧光素酶报告基因病毒蛋白酶检测方法

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Annexin蛋白家族调控病毒复制和抗病毒天然免疫反应的研究进展

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中国预防兽医学报 2022年第9期44卷 1014-1019页

作者：薛梦迪黄丽翁长江中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室基础免疫创新团队/黑龙江省兽医免疫学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

病毒复制一般包括吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配与释放5个阶段,Annexin蛋白能够与流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等病毒编码的蛋白相互作用进而影响病毒吸附、穿入及脱壳等复制过程。天然免疫是机体针对各种病原微生物和... 详细信息

病毒复制一般包括吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配与释放5个阶段,Annexin蛋白能够与流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等病毒编码的蛋白相互作用进而影响病毒吸附、穿入及脱壳等复制过程。天然免疫是机体针对各种病原微生物和异物的侵袭而介导抗病毒免疫反应的第一道防线,其激活依赖于模式识别受体(Pattern-recognition receptors,PRRs)识别病原体保守的分子结构称病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),以激活下游相关信号通路,发挥抵御病原体侵入的功能。

关键词：病毒吸附模式识别受体病毒复制复制过程病原相关分子模式第一道防线病原微生物流感病毒

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表达荧光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因重组非洲猪瘟病毒的构建

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病毒学报 2021年第5期37卷 1128-1134页

作者：康力周仕君宋洁李江南翁长江中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室基础免疫创新团队哈尔滨150069

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染家猪和野猪引起的一种高致病性传染病,家猪感染ASFV强毒株后死亡率接近100%。为了研究ASFV的致病机制,利用绿色荧光蛋白(EGFP)作为报告基因构... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染家猪和野猪引起的一种高致病性传染病,家猪感染ASFV强毒株后死亡率接近100%。为了研究ASFV的致病机制,利用绿色荧光蛋白(EGFP)作为报告基因构建重组病毒已经广泛应用,但易于定量检测且适用于高通量筛选的重组ASFV目前没有报道。本研究以ASFV HLJ/18分离株为亲本病毒,采用CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组技术将表达Gaussia荧光素酶(Gluc)和EGFP的报告基因表达盒插入到ASFV的K145R基因的位置,构建可以同时表达Gluc和EGFP的重组ASFV(rASFV⁃Gluc⁃EGFP)。通过PCR鉴定、Gluc和EGFP表达的检测,确定获得的重组ASFV能够感染猪肺泡巨噬细胞且表达Gluc和EGFP。对构建的重组病毒和亲本病毒进行生长曲线比较,结果表明插入的报告基因不影响病毒在猪肺泡巨噬细胞中的复制。F5、F10和F15代重组病毒基因鉴定和报告基因表达检测结果表明,重组病毒能稳定表达插入的双报告基因。本研究成功构建了表达Gluc和EGFP的重组ASFV,可以针对报告基因进行定量检测和高通量筛选,为ASFV的感染和致病机制研究奠定坚实的基础。

关键词：非洲猪瘟病毒(ASFV) 重组病毒报告基因荧光素酶

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