检索结果-内蒙古大学图书馆

中国农业科学 2024年第24期57卷 4990-5002页

作者：赵伊然单衍可李嘉豪何昭群王欣艺温墩王米拉储蕊赵东明刘斐南京农业大学动物医学院单分子生物化学与生物医学实验室兽医生物技术国家重点实验室/中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

【背景】非洲猪瘟（African swine fever,ASF）作为世界动物卫生组织（world organization for animal health,WOAH）规定必须通报的疫病之一，同时也是我国一类动物疫病，因缺乏有效疫苗和治疗方法，早期、有效、快速和敏感的检测对防... 详细信息

【背景】非洲猪瘟（African swine fever,ASF）作为世界动物卫生组织（world organization for animal health,WOAH）规定必须通报的疫病之一，同时也是我国一类动物疫病，因缺乏有效疫苗和治疗方法，早期、有效、快速和敏感的检测对防控ASF至关重要。目前，非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）常用临床检测方法主要包括荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)、酶联免疫吸附测定试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）等，但这些技术均需要复杂的操作、昂贵的仪器以及较长的检测时间，不适用于现场快速检测。此外，ASFV感染后宿主体内的抗体和核酸含量在不同时间段有明显的差异，因此单独检测ASFV核酸或抗体可能会导致假阴性的存在。【目的】通过研发一种基于量子点微球和重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification,RPA）的ASFV抗体-核酸联检试纸条，实现ASFV抗体和核酸的现场同时检测，以提高检测的灵敏度、特异性，降低检测成本，节约检测时间。【方法】通过结合量子点荧光免疫层析技术及RPA技术建立了同时检测ASFV抗体及核酸的侧向流层析试纸条，配套便携式荧光分析仪可实现ASFV抗体-核酸的快速现场联检。本研究优化了量子点偶联蛋白量及检测线包被浓度等条件。在此基础上，确定了该检测方法的cutoff值、敏感性、特异性及重复性，并将所建立的ASFV联检试纸条与市售ELISA试剂盒、qPCR检测试剂盒对临床样品进行检测，比较检测结果，验证该方法的符合率，评价该试纸条的实用性。【结果】联检试纸条使用方便、快速，整个检测过程可在30 min内完成。且与其他6种常见猪传染性病毒之间不存在交叉反应，特异性良好。核酸检测灵敏度可达10 copies/μL，抗体检测灵敏度可达1:3 200。抗体和核酸检测批内变异系数均小于10%，批间变异系数均小于15%，重复性良好。经市售ELISA试剂盒、qPCR试剂盒分别验证，符合率均为100%。除此之外，在临床样品检测中发现，有2份抗体检测阳性的样品其对应的猪只核酸检测为阴性，且这2头猪无明显临床症状，该结果进一步证明了通过抗体和核酸联检能够提高检测的准确性，减少假阴性的存在。【结论】核酸-抗体联检单次试验成本与病原核酸抗体分别检测总成本相比有所降低，节约了检测成本和时间，对于ASF急性发作、慢性感染检测均敏感，避免了仅检测单个核酸或单个抗体的局限性。此方法对操作环境要求低，使用的荧光分析仪便于携带，易于操作，整个操作过程无需过多昂贵的实验仪器和专业技术人员，降低了对检测设备的精密要求，适用在偏远地区以及基层中开展ASFV检测工作。因此，该方法有望成为未来猪场ASFV即时检测的可靠方法。

关键词：非洲猪瘟核酸检测抗体检测侧向流免疫试纸条

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SPF鸡的主要垂直传播性病原体及其检测标准分析

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实验动物与比较医学 2024年第3期44卷 305-312页

作者：王梦杰马文杰潘喻陈见兴张贺夏长友王玉娥中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069 西南大学动物医学院重庆400715

无特定病原体(specific pathogen-free,SPF)鸡在禽病及疫苗研究中应用广泛。垂直传播性疾病以垂直传播的方式传递给雏鸡,降低雏鸡成活率、增加生产成本、给整个养殖行业带来巨大经济损失的同时,严重影响SPF鸡的培育与使用。因此,需要加... 详细信息

无特定病原体(specific pathogen-free,SPF)鸡在禽病及疫苗研究中应用广泛。垂直传播性疾病以垂直传播的方式传递给雏鸡,降低雏鸡成活率、增加生产成本、给整个养殖行业带来巨大经济损失的同时,严重影响SPF鸡的培育与使用。因此,需要加强研究及管理人员对鸡垂直传播性疫病病原的认识,并制定出行之有效的监测措施。质量监测是保证SPF鸡质量的重要环节,其中病原检测是首要环节。在此基础上,应结合净化方式以及生物安全防控手段来培育合格的SPF鸡群。本文综述了包括病毒性病原、细菌性病原和支原体在内的鸡主要垂直传播性病原和这些病原的检测方法,比较美国企业标准和中国国家标准中有关SPF鸡微生物检测项目及方法的差异。结果分析显示,在两种标准中,垂直传播性病原大肠埃希菌、奇异变形杆菌以及沙门菌、禽白血病等垂直传播性疾病均未被列入SPF鸡微生物检测项目。而这些病原存在混合感染特征,一旦爆发,将严重影响鸡群健康。为生产更高质量的SPF鸡群,有必要将其列入必检项目。本文旨在帮助人们了解SPF鸡微生物监测的相关标准以及垂直传播性病原的危害和防控策略,为SPF鸡病原检测及净化提供参考。

关键词： SPF鸡垂直传播病原检测

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基于16S rDNA分析饲喂唾液乳杆菌XP132对白羽肉种鸡肠道菌群的影响

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畜牧兽医学报 2024年第9期55卷 4091-4099页

作者：何塔娜胡馨匀米洁兰高立张艳萍祁小乐崔红玉杨桂连高玉龙中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069 吉林农业大学动物医学院长春130118

旨在评估1株替抗专利菌株唾液乳杆菌XP132对健康白羽肉种鸡肠道菌群的影响。选取12只6月龄白羽肉种鸡,随机平均分为试验组和对照组,每组6只。试验组白羽肉种鸡每日饲喂活菌数为1×10^(9)CFU的唾液乳杆菌XP132发酵液,对照组饲喂PBS,... 详细信息

旨在评估1株替抗专利菌株唾液乳杆菌XP132对健康白羽肉种鸡肠道菌群的影响。选取12只6月龄白羽肉种鸡,随机平均分为试验组和对照组,每组6只。试验组白羽肉种鸡每日饲喂活菌数为1×10^(9)CFU的唾液乳杆菌XP132发酵液,对照组饲喂PBS,连续饲喂4周后,基于16S rDNA测序方法,比较两组鸡肠道菌群发生的相对改变。结果表明,在饲喂唾液乳杆菌XP132后,通过α多样性分析物种丰富度,试验组菌群丰富程度高于对照组。在菌群组成的属水平上,饲喂唾液乳杆菌XP132的肉种鸡肠道菌群中,螺旋体科NK4A136属、梭状芽胞杆菌属、副拟杆菌属、罗氏菌属等有益物种丰度增加;在种水平上,饲喂唾液乳杆菌XP132组的肉种鸡肠道菌群中乳杆菌、拟杆菌、鼠李糖乳杆菌类等有益物种丰度增加。结果提示,本试验条件下,饲喂唾液乳杆菌XP132改变了白羽肉种鸡肠道菌群的丰富度,增加了有益菌菌群的物种丰度。

关键词：肠道菌群唾液乳杆菌 16S rDNA 白羽肉种鸡

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嗜神经性疱疹病毒:神经科学研究的有力工具

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生物工程学报 2023年第1期39卷 7-18页

作者：李明智潘力吴红霞仇华吉王异民孙元河南科技学院动物科技学院河南新乡453003 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

病毒是研究现代神经科学的有力工具。对神经元的连接方式及功能研究大都是利用重组病毒完成的,嗜神经性疱疹病毒便是其中一种重要工具。随着基因工程学以及分子生物学技术的不断发展,多种嗜神经性疱疹病毒被改造为不同的重组病毒工具应... 详细信息

病毒是研究现代神经科学的有力工具。对神经元的连接方式及功能研究大都是利用重组病毒完成的,嗜神经性疱疹病毒便是其中一种重要工具。随着基因工程学以及分子生物学技术的不断发展,多种嗜神经性疱疹病毒被改造为不同的重组病毒工具应用于神经科学研究。本文基于几种常见且应用较为广泛的嗜神经性疱疹病毒作为神经传导示踪工具、治疗神经性疾病的病毒载体和溶瘤病毒治疗神经肿瘤等应用进行阐述及讨论,为进一步开发嗜神经性疱疹病毒的功能提供参考。

关键词：嗜神经性疱疹病毒病毒示踪神经环路神经性疾病治疗

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流感病毒先天免疫应答和先天免疫逃逸的机制

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生物化学与生物物理进展 2022年第4期49卷 690-698页

作者：张乃心许程志吴运谱乔传玲陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069 辽宁中医药大学实验动物中心沈阳110847

流感病毒引起人类和动物的呼吸道感染已是全世界严重的经济和公共卫生问题。在感染早期,流感病毒会导致机体的先天免疫信号被激活,起到防御、清除病毒以及辅助适应性免疫应答的作用。但在与宿主共进化的过程中,流感病毒形成了多种逃逸策... 详细信息

流感病毒引起人类和动物的呼吸道感染已是全世界严重的经济和公共卫生问题。在感染早期,流感病毒会导致机体的先天免疫信号被激活,起到防御、清除病毒以及辅助适应性免疫应答的作用。但在与宿主共进化的过程中,流感病毒形成了多种逃逸策略,主要是通过病毒自身蛋白质阻断宿主天然免疫通路,抑制干扰素和炎性因子的生成。基于现有的研究成果,本文针对流感病毒先天免疫应答和先天免疫逃逸的机制做一扼要综述,这有助于加强流感病毒抗原进化的监测、探索疫苗和抗病毒药物的合理靶标,为更好地预防和控制该病提供有效的策略。

关键词：流感病毒病毒蛋白天然免疫免疫逃逸

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一株猫疱疹病毒Ⅰ型的分离与鉴定

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畜牧兽医学报 2023年第4期54卷 1713-1720页

作者：许鑫燕郑亚婷刘迪马波刘家森曲连东东北农业大学动物医学学院哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069

采集哈尔滨某猫舍中表现为上呼吸道感染的患病猫眼、鼻拭子,PCR初步确诊为猫杯状病毒(FCV)和猫疱疹病毒(FHV-1)混合感染。利用猫肾细胞(CRFK)对样本进行病毒分离,前两代细胞培养物的核酸检测结果为FHV-1和FCV阳性,第三代开始只有FCV阳性... 详细信息

采集哈尔滨某猫舍中表现为上呼吸道感染的患病猫眼、鼻拭子,PCR初步确诊为猫杯状病毒(FCV)和猫疱疹病毒(FHV-1)混合感染。利用猫肾细胞(CRFK)对样本进行病毒分离,前两代细胞培养物的核酸检测结果为FHV-1和FCV阳性,第三代开始只有FCV阳性,由此分离出FCV。制备此株FCV的鼠源多克隆抗体,并中和混合培养物中的FCV,从而分离出FHV-1,命名为HRB2019株。通过病毒粒子形态观察、间接免疫荧光试验(IFA)和基因序列分析等方法鉴定HRB2019株,并研究其体外生长动力学。结果显示,HRB2019株可在CRFK细胞上产生典型病变,测得其第四代病毒滴度为1×10^(8.43) TCID 50·mL^(-1);电镜下可观察到球形、有囊膜、直径约为200 nm的病毒粒子;IFA结果显示,分离株可与FHV-1阳性血清结合,出现特异性荧光;扩增分离株的gD基因,其与国内外流行株高度同源。病毒一步生长曲线表明,HRB2019株感染细胞12 h后开始复制增殖,12~36 h为快速增殖期,48~72 h进入增殖平台期且滴度达到高峰,84 h病毒滴度开始下降。本研究首次从FCV与FHV-1混合感染的病料中成功分离出FHV-1,为FHV-1的流行病学调查和病原学研究提供了重要数据,为混合感染中生长弱势毒株的分离提供了方法学依据。

关键词：猫疱疹病毒猫杯状病毒分离鉴定

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不同毒力传染性支气管炎病毒诱导SPF鸡炎症反应的免疫机制

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东北农业大学学报 2023年第1期54卷 60-69页

作者：马得莹范佳慧任梦婷谢晶晶王芳芳焦亚茹韩宗玺东北农业大学动物科学技术学院哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

以specific pathogen-free(SPF)鸡为研究对象,通过滴鼻点眼方式感染传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)强毒株(CK/CH/LDL/140520)和IBV弱毒株(γCoV/ck/China/I0718/17)。分别在感染后12、36 h和3、7、14 d,采集法氏囊、脾脏、肾脏和气管,运用实时荧光定量PCR法,检测感染不同毒力IBV后,SPF鸡各脏器组织中免疫相关因子表达差异,初步探讨SPF鸡对不同毒力IBV免疫反应机制。结果表明,IBV弱毒株感染早期主要上调Toll样受体15(Toll-like receptors 15,TLR15)基因表达水平,提高白细胞介素(Interleukin,IL-1β)、IL-8基因表达量。法氏囊是介导启动获得性免疫反应的主要器官;脾脏是介导调控获得性免疫反应的主要器官,IBV强毒株在感染后期持续诱导提高TLR7、TLR15、TLR21基因和IL-6基因表达水平。可知,不同毒力IBV诱导SPF鸡炎症反应的免疫活化机制及介导调控获得性免疫反应的器官存在一定差异,为进一步揭示IBV强弱毒株致病性差异及诱导宿主不同免疫反应激活机理提供新的参考依据。

关键词：传染性支气管炎病毒 SPF鸡 Toll样受体细胞因子

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猪急性腹泻综合征冠状病毒S蛋白多克隆抗体的制备及在检测该病毒感染中的应用

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中国预防兽医学报 2024年第5期46卷 499-504页

作者：刘大凯韩郁茹张记宇张燎原冯廷帅杨小曼曾苗苗时洪艳秦毅斌石达冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 广西兽医研究所广西兽医生物技术重点实验室广西南宁530001

为制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)纤突蛋白(S)的多克隆抗体(PAb),本研究经PCR扩增SADS-Co V S蛋白S1亚基C端结构域(S1-CTD)基因片段(384 bp),并将其克隆至原核表达载体p GEX-6p-1中,构建重组质粒p GEX-6p-1-S1-CTD,经双酶切和... 详细信息

为制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)纤突蛋白(S)的多克隆抗体(PAb),本研究经PCR扩增SADS-Co V S蛋白S1亚基C端结构域(S1-CTD)基因片段(384 bp),并将其克隆至原核表达载体p GEX-6p-1中,构建重组质粒p GEX-6p-1-S1-CTD,经双酶切和测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG诱导表达,通过western blot鉴定重组S1-CTD蛋白(rS1-CTD)的表达及反应原性。结果显示,r S1-CTD以包涵体的形式表达,在40 ku处出现特异性条带。诱导表达后的r S1-CTD经不同浓度尿素重悬并超声离心,SDS-PAGE检测后切胶纯化,得到纯化的重组蛋白。利用BCA试剂盒测得蛋白的浓度为33μg/m L。将该重组蛋白乳化后经3次免疫新西兰大白兔,并在3免一周后采血,分离血清获得S1-CTD蛋白PAb。将SADS-Co V感染Vero E6细胞24 h后,以获得的兔PAb为一抗,分别采用western blot和间接免疫荧光试验(IFA)检测该PAb的反应原性。Western blot结果显示,在约250 ku处出现特异性条带,而阴性对照组无该条带;IFA结果显示,SADS-Co V感染的细胞中出现绿色荧光,而阴性对照细胞无绿色荧光。将SADS-Co V感染仔猪的回肠组织制备病理切片,以制备的PAb为一抗,通过免疫组织化学(IHC)检测SADS-Co V的抗原。结果显示,该组织切片中出现棕色阳性信号,而阴性对照仔猪回肠组织切片则无该棕色信号。表明该PAb可与感染SADS-Co V的仔猪回肠组织中的相应抗原发生特异性免疫反应。综上所述,本实验制备的S1-CTD蛋白PAb具有良好的反应原性和免疫原性,可以用于western blot、IFA、IHC检测体内外SADS-Co V的感染,为后续SADS-Co V检测方法的建立及S蛋白生物学功能的研究奠定基础。

关键词：猪急性腹泻综合征冠状病毒 S蛋白原核表达多克隆抗体初步应用

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H1N1亚型猪流感病毒HA蛋白225位氨基酸对病毒致病性的影响

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中国农业科学 2022年第4期55卷 816-824页

作者：杨时鳗许程志许榜丰吴运谱贾云慧乔传玲陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室辽宁中医药大学实验动物中心

【目的】流感病毒的致病性是由多个基因共同决定的，笔者之前的研究结果发现当两株具有相似基因特征的H1N1亚型猪流感病毒进行HA基因替换以后，病毒对小鼠的致病性发生了改变。通过确定影响病毒致病性的关键氨基酸位点，为进一步揭示流... 详细信息

【目的】流感病毒的致病性是由多个基因共同决定的，笔者之前的研究结果发现当两株具有相似基因特征的H1N1亚型猪流感病毒进行HA基因替换以后，病毒对小鼠的致病性发生了改变。通过确定影响病毒致病性的关键氨基酸位点，为进一步揭示流感病毒致病力差异奠定了基础。【方法】对ZD71和SY130的HA蛋白氨基酸序列进行比对，确认氨基酸差异位点并设计定点突变引物，构建单点突变的重组病毒并测定其鸡胚半数感染量（EID50）。将拯救的亲本病毒、HA单基因替换重组病毒及单点突变重组病毒以感染复数（MOI）为0.001和0.1的病毒量分别接种于MDCK和A549细胞，测定病毒的体外复制能力；将上述各株病毒以50μL含106EID50的剂量经滴鼻途径接种BALB/c小鼠，分别采集小鼠的脑、鼻甲、肺、脾、肾等脏器，匀浆处理后接种鸡胚分析病毒在小鼠体内各脏器的复制情况；将病毒分别以50μL含101-106 EID50的剂量经鼻腔感染BALB/c小鼠，感染后每天称量小鼠体重，当小鼠体重下降比率超过25%时判定为死亡，统计死亡情况，测定病毒的小鼠半数致死量（MLD50），评估各突变病毒对小鼠的致病性，与亲本病毒进行分析比较后，获知决定病毒致病性的关键氨基酸位点。【结果】ZD71和SY130病毒HA蛋白共存在4个氨基酸差异位点，分别为4、138、144和225位（H3 Numbering）。经过定点突变、病毒拯救及序列测定确认，分别获得含有单个位点突变的重组病毒。通过测定病毒在MDCK和A549细胞上的复制情况，结果发现与亲本病毒rZD71相比较，突变病毒rZD71-HA/G225E在感染MDCK细胞的各检测时间点、及感染A549细胞24—48 h后，复制滴度均显著提高；与rSY130相比较，突变病毒rSY130-HA/E225G在感染MDCK细胞12—36 h后、及感染A549细胞36—72 h后，复制滴度均显著降低。而4、138、144位点的突变对病毒的复制影响较小。进一步的小鼠感染试验发现HA 225位氨基酸的改变显著影响了病毒对小鼠的致病性，与亲本病毒rZD71相比，225位氨基酸由G突变为E后，病毒rZD71-HA/G225E的MLD50由4.32 log10EID50降低至3.0 log10EID50；病毒不仅在小鼠鼻甲和肺脏内检测到，而且在脾脏和肾脏中也均有一定水平的复制。【结论】HA蛋白225位氨基酸对两株H1N1 SIV对小鼠的致病性具有重要决定作用，提示在后续开展的病原学监测中要密切关注该位点氨基酸的变异情况，为更好地防控动物流感乃至人流感的大流行提供科学依据。

关键词：猪流感病毒 HA蛋白氨基酸致病性

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DBNL蛋白影响A型流感病毒复制机制的研究

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中国预防兽医学报 2023年第11期45卷 1095-1100页

作者：孟德锦李奇兵胡玉珍王一涵王波石文军单智博姜丽陈化兰李呈军中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、兽医生物技术国家重点实验室/农业农村部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

A型流感病毒(IAV)在宿主细胞内复制过程中需要许多宿主因子的参与,同时IAV也能调控多种宿主因子的表达。为寻找调控IAV复制的宿主因子,本研究通过SDS-PAGE电泳检测发现H1N1亚型流感病毒A/WSN/1933株(简写为WSN)感染A549细胞会上调表达55... 详细信息

A型流感病毒(IAV)在宿主细胞内复制过程中需要许多宿主因子的参与,同时IAV也能调控多种宿主因子的表达。为寻找调控IAV复制的宿主因子,本研究通过SDS-PAGE电泳检测发现H1N1亚型流感病毒A/WSN/1933株(简写为WSN)感染A549细胞会上调表达55 ku左右的特异蛋白条带(感染后9 h),将该55 ku左右的蛋白条带切胶回收后进行质谱分析,根据质谱分析的筛选标准选择蛋白得分(Mass score)较高、谱图数(Matches)和序列数(Sequences)较为可信的宿主因子DBNL作为调控IAV复制的潜在研究对象进一步研究。本研究针对DBNL设计特异的siRNA和对照Scrambled siRNA,将其分别转染A549细胞,通过荧光定量PCR确定DBNL siRNA在转录水平的干扰效果显著;利用细胞活力测定试验确定DBNL siRNA的干扰不影响细胞活力。利用DBNL siRNA下调表达A549细胞中的DBNL后,以WSN感染该细胞,在感染后24 h、48 h分别收集细胞上清,利用MDCK细胞进行噬斑滴定试验。试验结果显示,与对照组相比,下调表达DBNL后IAV的滴度极显著降低(P<0.01),表明下调表达DBNL能够抑制A549细胞中的IAV复制。利用siRNA下调表达A549细胞中的DBNL后,以WSN感染A549细胞,采用激光共聚焦试验鉴定IAV NP蛋白的表达与定位情况。结果显示,在病毒感染后6 h,对照组中红色荧光集中分布在细胞质中,而DBNL siRNA组中红色荧光在细胞核与细胞质中均有分布,表明下调表达DBNL能够抑制细胞中IAV NP蛋白的出核。反之,通过转染过表达DBNL的重组质粒,以WSN感染A549细胞,采用激光共聚焦试验鉴定IAV NP蛋白的表达与定位情况。结果显示,在病毒感染后4 h,转染pCAGGS的对照组中红色荧光主要分布在细胞核中,而过表达DBNL组中的红色荧光在细胞核与细胞质中均有分布,表明过表达DBNL能够促进细胞中IAV NP蛋白的出核。以上研究结果证实DBNL正调控IAV的复制与其NP蛋白的出核。本研究丰富了DBNL功能的多样性,为宿主因子调控IAV复制的研究提供参考数据。

关键词：流感病毒 DBNL蛋白 NP蛋白

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