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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十三次学术讨论会和中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十二次学术讨论会

作者：余丹丹张书霞陈化兰南京农业大学动物医学院南京农业大学动物医学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点实验室/兽医生物技术国家重点实验室

目的:研究A/Duck/Guangdong/40/2000(H5N1)(简称DKGD/40/00)和A/Duck/Guangxi/35/2001(简称DKGX/35/01)两株H5N1亚型禽流感病毒的NS1基因对Hela细胞凋亡的影响,为该两株病毒的致病机理提供依据。材料与方法:病毒株A/Duck/Guangdong/40/2000(H5N1)(简称DKGD/40/00)和A/Duck/Guangxi/35/2001(H5N1)(简称DKGX/35/01)由哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室保存;10日龄的SPF鸡胚由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供;引物参照NS1基因序列保守区设计。并引入EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ两个酶切位点,由上海博亚生物技术有限公司合成;病毒NS1基因的克隆与表达

关键词：禽流感病毒 NS1 细胞凋亡

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两株H5N1亚型禽流感病毒诱导鸡胚成纤维细胞凋亡的初步研究

两株H5N1亚型禽流感病毒诱导鸡胚成纤维细胞凋亡的初步研究

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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十三次学术讨论会和中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十二次学术讨论会

目的:为了弄清禽流感病毒的毒力强弱与细胞凋亡的关系,我们进行了生物学特性差异明显的A/Duck/Guangdong/40/2000(H5N1)和A/Duck/Guangxi/35/2001(H5N1)两株H5N1亚型禽流感病毒对鸡胚成纤维细胞的感染实验,并检测了细胞凋亡指标,以期为... 详细信息

目的:为了弄清禽流感病毒的毒力强弱与细胞凋亡的关系,我们进行了生物学特性差异明显的A/Duck/Guangdong/40/2000(H5N1)和A/Duck/Guangxi/35/2001(H5N1)两株H5N1亚型禽流感病毒对鸡胚成纤维细胞的感染实验,并检测了细胞凋亡指标,以期为该两株病毒的致病机理及相关比较研究提供参考依据。方法:用灭菌PBS将含有两株病毒的尿囊液分别以十倍比稀释到10-4,置于冰上。接种100μl禽流感病毒稀释液于鸡胚成纤维细胞上,37℃吸附30min,PBS洗涤3次,加入5ml 2%DMEM维持液。置37℃5%CO2培养箱培养,逐日观察,出现细胞病变时收集细胞供DNA抽提及流式细胞仪测试。

关键词：鸡胚成纤维细胞禽流感病毒初步研究

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NS2A序列对日本脑炎病毒NS1基因在原核系统中的体外表达的影响

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中国农业科学 2004年第4期37卷 614-618页

作者：仇华吉金吉东田志军周艳君王云峰童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 哈尔滨150001 延边大学农学院动物医学系龙井133400 哈尔滨150001 哈尔滨150001 哈尔滨150001 哈尔滨150001

用RT-PCR扩增并克隆了日本脑炎病毒弱毒株SA14-14-2的NS1、NS1’、NS1-2A的 cDNA片段,分别将其亚克隆到原核表达载体pET-30b(+),构建了重组原核表达质粒pET30b-NS1、pET30b-NS1’、pET30b-NS1-2A,转化大肠杆菌BL-21(DE3),用IPTG诱导培养。结果表明,仅有pET30b-NS1质粒转化的菌株获得表达,而另外2种重组质粒转化的菌株均无表达。表达的融合蛋白分子量约为46kD,约占菌体总蛋白的30.8%,Western blotting分析表明表达产物具有抗原活性。动物试验证实,重组NS1免疫小鼠蛋白可以抵抗强毒的攻击。笔者研究证实NS2A或部分NS2A的存在对于NS1的表达具有不利影响。

关键词：日本脑炎病毒 NS1 NS1’ RT-PCR 基因表达

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镉致鸡脾淋巴细胞凋亡及对p53mRNA表达的影响

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中国环境科学 2004年第4期24卷 456-459页

作者：李金龙徐世文熊永忠李术王秀荣东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室及兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

应用吖啶橙/溴化乙锭荧光染色(AO/EB)法、DNA琼脂糖凝胶电泳及半定量RT-PCR法检测了氯化镉在浓度0～30μmol/L范围内对体外培养的鸡脾脏淋巴细胞凋亡及对p53mRNA表达的影响.结果表明,浓度为0～30μmol/L的镉能引起鸡脾脏淋巴细胞凋亡及... 详细信息

应用吖啶橙/溴化乙锭荧光染色(AO/EB)法、DNA琼脂糖凝胶电泳及半定量RT-PCR法检测了氯化镉在浓度0～30μmol/L范围内对体外培养的鸡脾脏淋巴细胞凋亡及对p53mRNA表达的影响.结果表明,浓度为0～30μmol/L的镉能引起鸡脾脏淋巴细胞凋亡及干扰p53mRNA的表达,低浓度镉引起的细胞凋亡与p53mRNA的表达密切相关,而高浓度的镉能够导致鸡脾脏淋巴细胞坏死.

关键词：镉鸡脾脏淋巴细胞凋亡坏死 p53mRNA

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表达H5亚型禽流感病毒HA基因的DNA疫苗免疫保护效力研究

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中国农业科学 2004年第7期37卷 1071-1075页

作者：姜永萍于康震邓国华田国斌乔传玲陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

表达高致病力禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1) [GD/1/96(H5N1)]HA基因的DNA疫苗质粒pCIHA5具有良好的免疫保护性,为了将其开发并应用于实际,对其免疫保护效力进行了进一步的研究。结果表明,用10、40、70、100和150g pCIHA... 详细信息

表达高致病力禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1) [GD/1/96(H5N1)]HA基因的DNA疫苗质粒pCIHA5具有良好的免疫保护性,为了将其开发并应用于实际,对其免疫保护效力进行了进一步的研究。结果表明,用10、40、70、100和150g pCIHA5和油苗1次免疫后,其免疫保护率分别为12.5%(1/8)、58.3%(7/12)、72.7%(8/11)、50.0%(6/12)、66.7%(8/12)和100%(12/12),其中70和100g剂量组的病毒分离结果为1/8和2/6;用剂量为5、20、35和50g pCIHA5分别免疫2次,免疫保护率分别为45.5%(5/11)、58.3%(7/12)、58.3%(7/12)和91.7%(11/12),5g的病毒分离结果为1/5,其余组未分离出病毒;pCIHA5免疫后AGP抗体均未检出,油苗免疫后其HI抗体虽高,但AGP抗体也呈阳性。结果显示,加强免疫应为DNA疫苗质粒pCIHA5的安全免疫方式,DNA疫苗质粒pCIHA5虽具有较为稳定的免疫原性和免疫保护性,但有必要进一步提高其在肌肉组织中的有效表达水平和抗体反应水平。

关键词：禽流感病毒血凝素基因 DNA疫苗免疫保护效力

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共表达禽流感病毒HA和NA基因的重组禽痘病毒在SPF鸡的免疫效力试验

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中国农业科学 2004年第4期37卷 605-608页

作者：乔传玲姜永萍于康震田国斌陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/农业部动物流感重点开放实验室及兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/农业部动物流感重点开放实验室及兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

将禽流感病毒A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)毒株的HA和NA2个基因同源重组到禽痘病毒基因组中,获得了能同时高效表达这2种蛋白的重组禽痘病毒(rFPV-HA-NA)。将rFPV-HA-NA经翅膀刺种途径接种8周龄SPF鸡,免疫后4周分别用10LD50的高致病力... 详细信息

将禽流感病毒A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)毒株的HA和NA2个基因同源重组到禽痘病毒基因组中,获得了能同时高效表达这2种蛋白的重组禽痘病毒(rFPV-HA-NA)。将rFPV-HA-NA经翅膀刺种途径接种8周龄SPF鸡,免疫后4周分别用10LD50的高致病力禽流感病毒(HPAIV)A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)和A/FPV/Rostock/34(H7N1)毒株进行攻击。结果重组禽痘病毒免疫鸡群诱导产生了高水平的抗体,能够完全抵抗H5N1和H7N1亚型病毒的致死性攻击;并可有效阻止病毒在泄殖腔的排出。而禽痘病毒免疫组和非免疫对照组在攻毒后全部发病并死亡。

关键词：禽流感病毒 HA NA 重组禽痘病毒免疫效力

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禽流感病毒N3亚型神经氨酸酶基因的克隆

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中国预防兽医学报 2004年第3期26卷 161-164页

作者：邓国华王秀荣张立春刘振勇乔传玲田国彬于康震陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

本研究应用11日龄SPF鸡胚增殖禽流感病毒标准株A/Duck/Germany/1215(H2N3),用LSTRIAZOL试剂盒提取病毒RNA,应用自行设计的NA基因半特异性引物进行RT＿PCR扩增,得到NA基因的全长DNA片段,克隆到PMD18＿T载体上,并进行鉴定和序列测定。测... 详细信息

本研究应用11日龄SPF鸡胚增殖禽流感病毒标准株A/Duck/Germany/1215(H2N3),用LSTRIAZOL试剂盒提取病毒RNA,应用自行设计的NA基因半特异性引物进行RT＿PCR扩增,得到NA基因的全长DNA片段,克隆到PMD18＿T载体上,并进行鉴定和序列测定。测定结果表明所获得的NA基因DNA片段长1451bp,编码469个氨基酸残基,与其他亚型的NA基因编码的氨基酸长度相一致。根据推导的氨基酸序列进行预测,该蛋白具有6个潜在的糖基化位点和19个半胱氨酸残基。与其他亚型的NA基因相比较发现克隆的NA基因符合神经氨酸的分子结构特征,本研究首次获得N3亚型NA基因全序列。

关键词：禽流感病毒神经氨酸酶 N3 NA基因克隆

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鸡传染性支气管炎中国地方分离毒株LX4 mRNA1 ORF1的遗传变异特征

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病毒学报 2004年第4期20卷 347-352页

作者：刘胜旺刘玉芬孔宪刚邵昱昊中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030

应用RT-PCR方法扩增了冠状病毒鸡传染性支气管炎中国分离毒株LX4的mRNA1ORF1,并将其进行了克隆、序列测定和分析。表明LX4mRNA1基因包含2个ORF,其中ORF1a由11916个核苷酸组成,编码一条3971个氨基酸残基组成的多肽。ORF1b由7950个核苷酸... 详细信息

应用RT-PCR方法扩增了冠状病毒鸡传染性支气管炎中国分离毒株LX4的mRNA1ORF1,并将其进行了克隆、序列测定和分析。表明LX4mRNA1基因包含2个ORF,其中ORF1a由11916个核苷酸组成,编码一条3971个氨基酸残基组成的多肽。ORF1b由7950个核苷酸组成,编码2649个氨基酸残基组成的多肽。与美国Beaudette株对应的ORF1a核苷酸及推导的氨基酸序列同源性均为85%,与对应的ORF1b的同源性分别为89%和95%。二者ORF1a和ORF1b重叠区推测的"滑脱序列"(slipperysequence)核苷酸序列一致,"假结"(pseudoknot)基本结构相似。不同之处在于"假结"第2环中LX4的第7位为A,而Beaudette株在该位置为G。与Beaudette株比较,LX4ORF1a核苷酸变异最频繁的区域集中在第2656～3098位碱基处,且在该区域有60个碱基的插入,导致推导的氨基酸序列插入了20个氨基酸残基。LX4ORF1b序列缺失9个核苷酸,主要集中在第5168～5181位之间,导致对应的氨基酸缺失3个。但这些差异是否与病毒的生物学特性有关不明。

关键词：核苷酸 4mRNA 分离毒株氨基酸残基列缺多肽冠状病毒鸡传染性支气管炎遗传变异同源性

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禽流感病毒NA基因在巴斯德毕赤酵母系统中的表达

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中国兽医科技 2004年第6期34卷 52-55页

作者：冉多良施建忠孟庆文新疆农业大学动物医学院新疆乌鲁木齐830052 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

采用PCR扩增禽流感病毒 (AIV)NA基因 ,克隆入 pMD18 T载体中 ,再亚克隆入含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列的巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)表达载体pPIC9k中 ,构建了重组转移载体 pPIC9kNA。经电穿孔转化酵母宿主菌GS115和筛选高拷... 详细信息

采用PCR扩增禽流感病毒 (AIV)NA基因 ,克隆入 pMD18 T载体中 ,再亚克隆入含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列的巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)表达载体pPIC9k中 ,构建了重组转移载体 pPIC9kNA。经电穿孔转化酵母宿主菌GS115和筛选高拷贝重组转化子及筛选His+Mut+表型转化子后 ,摇瓶培养 ,10mL/L甲醇诱导表达后 ,经SDS PAGE、Western blotting、双向琼脂扩散试验、神经氨酸酶试验分析证明 ,获得了几株高效表达重组表达株 ,并且该重组NA蛋白具有免疫学活性。

关键词：禽流感病毒巴斯德毕赤酵母 NA基因分泌表达

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猪γ干扰素的体外表达及其多克隆抗血清的制备

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中国预防兽医学报 2004年第4期26卷 252-255页

作者：闫丽萍周艳君仇华吉魏萍童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030

从健康仔猪前腔静脉无菌采血 ,分离外周血单个核细胞 ,提取细胞总RNA ,用猪γ干扰素 (IFN_γ)基因特异性引物通过RT_PCR扩增猪IFN_γ的全长cDNA序列 ,将其克隆到pMD18_T载体中 ,再亚克隆到pUC18和表达载体pET_30a中 ,经测序发现其序列与... 详细信息

从健康仔猪前腔静脉无菌采血 ,分离外周血单个核细胞 ,提取细胞总RNA ,用猪γ干扰素 (IFN_γ)基因特异性引物通过RT_PCR扩增猪IFN_γ的全长cDNA序列 ,将其克隆到pMD18_T载体中 ,再亚克隆到pUC18和表达载体pET_30a中 ,经测序发现其序列与GenBank报道的IFN_γ基因序列基本一致。将重组质粒pET_30a_IFN_γ转化大肠杆菌BL2 1,于 37℃经IPTG诱导表达 ,IFN_γ基因获得表达 ,表达产物以包涵体形式存在 ,占菌体总蛋白的 39%。经SDS_PAGE及Westernblot分析表明 ,表达的融合蛋白分子量约为 2 5ku。将包涵体用 8mol/L脲变性 ,用ProBondTMPurificationSysterm纯化 ,经透析复性 ,得到纯化的目的蛋白 ,含量可达 0 3mg/mL。将复性蛋白免疫新西兰白兔三次 ,制备了高滴度的猪IFN_γ抗血清。本实验表达和纯化了猪IFN_γ ,并制备兔抗猪IFN_γ的抗血清 ,为下一阶段关于猪γ干扰素重组蛋白其应用奠定了基础。

关键词：猪γ干扰素重组细胞因子抗血清

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