检索结果-内蒙古大学图书馆

中国生物工程杂志 2003年第3期23卷 44-49页

作者：仇华吉李卫平童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 武汉生物制品研究所实验动物室武汉430060

RNA复制子是自主复制的RNA ,保留了病毒复制酶基因 ,而结构蛋白基因缺失 ,由外源抗原基因取代 ,复制酶可控制载体RNA在胞浆中高水平复制和外源基因的高水平表达。用于开发复制子的主要是单股正链RNA病毒 ,如甲病毒 (辛德比斯病毒、塞姆... 详细信息

RNA复制子是自主复制的RNA ,保留了病毒复制酶基因 ,而结构蛋白基因缺失 ,由外源抗原基因取代 ,复制酶可控制载体RNA在胞浆中高水平复制和外源基因的高水平表达。用于开发复制子的主要是单股正链RNA病毒 ,如甲病毒 (辛德比斯病毒、塞姆利基森林病毒、委内瑞拉马脑炎病毒 )、黄病毒 (登革热病毒、昆津病毒 )、小RNA病毒 (脊髓灰质炎病毒、人鼻病毒 )、副粘病毒 (犬瘟热病毒 )、杯状病毒 (猫杯状病毒 )。基于复制子的疫苗不会产生能复制的感染性病毒粒子 ,不可能与细胞基因组发生整合 ,但可诱导全身免疫和粘膜免疫以及MHC I限制性CTL反应 ,而不受体内已有载体抗体的干扰。目前已开发了大量基于复制子的疫苗和肿瘤的治疗性和预防性疫苗 ,并在很多疾病模型上取得成功 ,包括病毒 (流感病毒、人免疫缺陷病毒、拉沙病毒、马尔堡病毒、呼吸道合胞体病毒、诺沃克样病毒、马动脉炎病毒等 )肿瘤 (人乳头瘤、癌胚抗原、B1 6肿瘤、小鼠黑素瘤等 )、以及细菌毒素 (肉毒杆菌毒素、葡萄球菌肠毒素、破伤风毒素等 )。

关键词： RNA复制子病毒复制子颗粒新型疫苗

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鸡传染性支气管炎病毒核蛋白基因在大肠杆菌中的表达及抗原性初步研究

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病毒学报 2003年第4期19卷 342-347页

作者：杜恩岐刘胜旺孔宪刚童光志杨增岐西北农林科技大学动物科技学院陕西杨陵712100 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为了研究重组鸡传染性支气管炎病毒核蛋白能否作为群特异性诊断抗原加以应用,将鸡传染性支气管炎病毒国内分离株IBV-LX4核蛋白基因亚克隆于大肠杆菌原核表达载体pPROEXTMHT中,构建拟表达重组鸡传染性支气管炎病毒核蛋白的重组质粒pPROEX... 详细信息

为了研究重组鸡传染性支气管炎病毒核蛋白能否作为群特异性诊断抗原加以应用,将鸡传染性支气管炎病毒国内分离株IBV-LX4核蛋白基因亚克隆于大肠杆菌原核表达载体pPROEXTMHT中,构建拟表达重组鸡传染性支气管炎病毒核蛋白的重组质粒pPROEXTMHT-N。经核苷酸序列测定后,阳性质粒转化大肠杆菌DH5α,并进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE、Westernblot鉴定,表明核蛋白在大肠杆菌中获得了表达,表达产物是分子量分别为约56kD和45kD的蛋白,其中分子量为56kD的蛋白表达量约为菌体总蛋白的13%。包涵体被6mol盐酸胍裂解后,通过镍离子亲和树脂进行了纯化,并用纯化的分子量为56kD的重组蛋白免疫新西兰白兔,所获得的兔抗鸡传染性支气管炎病毒核蛋白多克隆抗体,分别与不同致病型的鸡传染性支气管炎病毒进行琼脂扩散反应,结果表明,该多克隆抗体可与各不同致病型毒株发生反应。这初步表明重组鸡传染性支气管炎病毒核蛋白,可作为群特异性诊断抗原用于该病毒的诊断中。

关键词：传染性支气管炎病毒重组核蛋白多克隆抗体抗原性

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传染性法氏囊病毒VP2在酵母细胞内的高效表达及其免疫原性研究

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中国农业科学 2003年第4期36卷 443-447页

作者：王笑梅王牟平高宏雷付朝阳曾祥伟张守发东北农业大学动物医学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室吉林133400 哈尔滨150030 延边大学农学院哈尔滨150001

应用Pichia酵母表达系统高效表达了传染性法氏囊病毒 (IBDV)VP2 基因片段。首先用OLIGO设计 1对引物P5、P6 ,以插入IBDVVP2 基因的 pUC19为模板 ,扩增出带有终止密码子的 1.5kb片段 ,将此片段正向亚克隆到 pPICZA表达载体上 ,将构建好... 详细信息

应用Pichia酵母表达系统高效表达了传染性法氏囊病毒 (IBDV)VP2 基因片段。首先用OLIGO设计 1对引物P5、P6 ,以插入IBDVVP2 基因的 pUC19为模板 ,扩增出带有终止密码子的 1.5kb片段 ,将此片段正向亚克隆到 pPICZA表达载体上 ,将构建好的载体pPICVP2 用SacI内切酶线性化后 ,转染酵母PichiapastorisGS115细胞 ,经PCR鉴定 ,筛选出 5 0多个重组子。分别用甲醇诱导后 ,经SDS PAGE凝胶电泳、琼脂扩散试验、Dot ELISA检测 ,得到 9个不同程度表达 4 1kuVP2 活性蛋白的阳性重组子。经凝胶薄层扫描仪分析 ,表达蛋白占酵母细胞总蛋白的最高比率为 16 % ,表达量为 0 .6 2 0 8g·L-1。表达产物免疫SPF鸡可诱导产生特异性抗体 ,并能保护鸡抵抗超强毒致死性攻击 ,具有良好的免疫原性。

关键词：传染性法氏囊病病毒 VP2 酵母表达免疫原性

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日本脑炎病毒NS1基因在大肠杆菌中的高效表达

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兽医大学学报 2003年第3期23卷 255-257页

作者：金吉东仇华吉田志军周艳君张守发童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 延边大学农学院动物医学系吉林龙井133400

提取日本脑炎病毒弱毒株 SA1 4 - 1 4 - 2的基因组 RNA,用 RT- PCR扩增其 NS1基因 c DNA,将其克隆到原核表达载体 p ET- 30 b(+)中 ,转化大肠杆菌 BL - 2 1 (DE3) ,经 IPTG诱导 ,NS1基因获得高效表达。 SDS- PAGE分析显示 ,表达的融合... 详细信息

提取日本脑炎病毒弱毒株 SA1 4 - 1 4 - 2的基因组 RNA,用 RT- PCR扩增其 NS1基因 c DNA,将其克隆到原核表达载体 p ET- 30 b(+)中 ,转化大肠杆菌 BL - 2 1 (DE3) ,经 IPTG诱导 ,NS1基因获得高效表达。 SDS- PAGE分析显示 ,表达的融合蛋白表观相对分子质量约为 4 6 0 0 0 ,重组 NS1蛋白占菌体总蛋白的 30 .8%。 Western blotting分析表明。

关键词：日本脑炎病毒 NSl基因大肠杆菌表达乙型脑炎

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伪狂犬病病毒通用转移载体的构建及应用

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中国预防兽医学报 2003年第1期25卷 16-20页

作者：钱平李祥敏陈焕春肖少波仇华吉童光志华中农业大学畜牧兽医学院动物病毒室湖北武汉430070 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

将来自质粒pFSV40的 3 0 0bpBamHI/PstI片段〔其中含有SV40poly(A)和部分多克隆位点〕插入到质粒pUSK相应的酶切位点中 ,获得重组质粒pUSKSV40 ,该重组质粒中gG基因 5’端编码区缺失了 42 8bp。将来自质粒pcDNA3 .1( +)的 946bpBglIIEc... 详细信息

将来自质粒pFSV40的 3 0 0bpBamHI/PstI片段〔其中含有SV40poly(A)和部分多克隆位点〕插入到质粒pUSK相应的酶切位点中 ,获得重组质粒pUSKSV40 ,该重组质粒中gG基因 5’端编码区缺失了 42 8bp。将来自质粒pcDNA3 .1( +)的 946bpBglIIEcoRI片段 (其中含CMV启动子及部分多克隆位点 )插入到质粒pUSKSV40的BamHIEcoRI位点 ,构建了通用载体pPRVCMV_uni,其中含有CMV启动子、SV40poly(A)以及NheI、Pmel、BamHI、BstXI、EcoRI、StuI、XbaI等 7个单一克隆位点。将eGFP基因插入到该通用载体的BamHI和EcoRI之间 ,用所获得的转移载体与TK_/gG_/LacZ+ PRV基因组共转染PK_1 5细胞 ,经检测eGFP基因在重组伪狂犬病病毒中获得表达 ,从而证实该通用载体的构建是可行的。本研究研制以伪狂犬病病毒为载体的二价或多价基因工程疫苗奠定了物质基础。

关键词：伪狂犬病伪狂犬病病毒通用转移载体重组伪狂犬病病毒基因工程疫苗

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鸡IL-15基因的克隆与序列分析

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中国预防兽医学报 2003年第2期25卷 107-111页

作者：独军政刘胜旺孔宪刚陈怀涛夏春甘肃农业大学动物医学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 中国农业大学动物医学院

参照已发表的鸡IL_15cDNA序列 ,设计合成引物 ,应用反转录_聚合酶链反应 (ReverseTranscription_PolymeraseChainReaction ,RT_PCR)技术从有丝分裂原ConA活化 4 8小时的白来航鸡脾淋巴细胞中克隆到了鸡IL_15cDNA ,并对单独的三个阳性克... 详细信息

参照已发表的鸡IL_15cDNA序列 ,设计合成引物 ,应用反转录_聚合酶链反应 (ReverseTranscription_PolymeraseChainReaction ,RT_PCR)技术从有丝分裂原ConA活化 4 8小时的白来航鸡脾淋巴细胞中克隆到了鸡IL_15cDNA ,并对单独的三个阳性克隆分别进行了核苷酸序列测定 ,核苷酸与推导的氨基酸序列分析显示 ,本研究所用白来航鸡IL_15cDNA5’非编码区有两个框外ATG起始密码子 ,开放阅读框由 5 6 1bp组成 ,编码 187个氨基酸 ,其中N端信号肽含有 6 6个氨基酸 ,在第 4 8、14 9和 16 6位的天冬酰胺残基上有三个潜在的N糖基化位点。成熟的鸡IL_15含有 4个高度保守的半胱氨酸(Cysteine)残基 ,可形成两个链内二硫键。与已发表的鸡IL_15基因序列相比 ,该序列编码区第 36 5、397、4 0 7、4 5 7、4 74、5 5 6、5 5 7位的核苷酸发生了变化 ,分别由A、C、G、G、A、A、T依次变成了G、T、T、T、G、A、T ,推导的氨基酸序列在第 12 2、133、136、15 3和 186位发生了改变 ,分别由原来的天冬氨酸、精氨酸、色氨酸、丙氨酸、丙氨酸依次变成了甘氨酸、色氨酸、亮氨酸、丝氨酸和异亮氨酸 ,其中第 4 74位碱基的变化是同义突变。

关键词：鸡白细胞介素15 基因克隆序列

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编码鸡IL-18成熟蛋白基因的分子克隆与序列测定

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中国预防兽医学报 2003年第2期25卷 114-117页

作者：潘蔚绮刘胜旺孔宪刚李广兴夏春东北农业大学动物医学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 中国农业大学动物医学院

白细胞介素 18(IL_18)是一种能诱导IFN_γ产生的新型细胞因子 ,在调节Th1型细胞免疫应答中起重要作用。本研究根据已发表的鸡白介素 18(IL_18)cDNA基因序列设计引物 ,用反转录_聚合酶链反应 (RT_PCR)技术从有丝分裂原ConA刺激 4 8小时... 详细信息

白细胞介素 18(IL_18)是一种能诱导IFN_γ产生的新型细胞因子 ,在调节Th1型细胞免疫应答中起重要作用。本研究根据已发表的鸡白介素 18(IL_18)cDNA基因序列设计引物 ,用反转录_聚合酶链反应 (RT_PCR)技术从有丝分裂原ConA刺激 4 8小时活化的白来航鸡脾细胞中扩增出编码鸡IL_18成熟蛋白质的基因 ,并进行序列测定 ,并与结果进行了比较 ,发现本研究克隆到的鸡IL_18成熟蛋白编码基因序列在 4 82位为C ,而Schnieder等报道的序列为T ,这一核苷酸序列的变化导致了推导的对应氨基酸残基由苯丙氨酸变为丝氨酸。该处碱基变化的原因究竟是鸡IL_18本身存在多态性 ,还是反转录或PCR过程中的碱基错配所致 ,该处碱基的变化对于鸡IL_18蛋白的表达及其生物活性究竟有无影响等问题正在研究中。该基因为国内首次报道经序列测定证实的鸡IL_18基因。

关键词：鸡IL-18成熟蛋白基因克隆序列测定白细胞介素8

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鸡白细胞介素-18基因的原核表达及多克隆抗血清的制备

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中国兽医学报 2003年第5期23卷 427-430页

作者：刘胜旺潘蔚绮孔宪刚李广兴夏春中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业大学动物医学院北京100094

将编码鸡白细胞介素 - 18(interleukin- 18,IL- 18)成熟蛋白的基因亚克隆至原核表达载体 p PROEXTMHT中 ,构建重组质粒并进行确证性序列测定。然后将重组质粒转化大肠杆菌 DH5α并用 IPTG于 37℃诱导培养。表达的融合蛋白主要以包涵体... 详细信息

将编码鸡白细胞介素 - 18(interleukin- 18,IL- 18)成熟蛋白的基因亚克隆至原核表达载体 p PROEXTMHT中 ,构建重组质粒并进行确证性序列测定。然后将重组质粒转化大肠杆菌 DH5α并用 IPTG于 37℃诱导培养。表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在 ,目的蛋白表达量占菌体蛋白的 30 %。 SDS- PAGE和 Western blot分析显示 ,表达的鸡 IL-18融合蛋白相对分子质量约为 2 30 0 0。包涵体被 6 mol/ L 盐酸胍裂解后 ,通过镍离子亲和树脂进行了纯化。用所获得的重组鸡 IL- 18融合蛋白及其纯化产物经 3次肌肉注射豚鼠 ,制备豚鼠抗鸡 IL- 18多克隆抗血清 ,并用琼脂扩散试验多克隆抗血清进行了证明。本试验成功的原核表达、纯化了鸡 IL- 18融合蛋白 ,并制备了抗鸡 IL- 18多克隆抗血清 ,为下一阶段关于鸡 IL -

关键词：鸡白细胞介素-18基因原核表达多克隆抗血清重组蛋白制备细胞因子

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鸡传染性支气管炎病毒LX4株mRNA_5和mRNA_6 cDNA的分子特征

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中国病毒学 2003年第3期18卷 265-270,F003页

作者：刘胜旺杜恩岐孔宪刚杨增岐中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100

本研究参照已发表的IBV基因序列设计合成了一对引物,经反转录-聚合酶链式反应(Reverse Transcription-polymerase Chin Reaction,RT-PCR)技术扩增得到我国地方分离株LX4 mRNA_5和mRNA_6的全部cDNA大小约1.7kb的片段。将该片段克隆并进... 详细信息

本研究参照已发表的IBV基因序列设计合成了一对引物,经反转录-聚合酶链式反应(Reverse Transcription-polymerase Chin Reaction,RT-PCR)技术扩增得到我国地方分离株LX4 mRNA_5和mRNA_6的全部cDNA大小约1.7kb的片段。将该片段克隆并进行序列测定,与国内外部分参考毒株的相应序列比较分析发现:LX4 5a基因与已发表的国内外IBV毒株之间同源性很低,而这些参考毒株间5a基因同源性却很高(推导的氨基酸同源性在90％以上)。5b基因与国内分离株D971同源性最高。在所选的12株参考毒株中,LX4 N基因推导氨基酸同源性与国内分离株SD/97/02最高(94％),与HB次之(93％),与其他毒株核苷酸和推导氨基酸同源性在89％和92％以下。对已报道的N基因所编码蛋白的三个保守碱性区同源性比较发现,LX4在第66-88位与Beau、M41、H52及FIB同源性均为100％。在第181-234位,推导氨基酸同源性与SD/97/02最高(94％)。在第334-373位推导氨基酸同源性与H120和ZJ971推导氨基酸同源性均为93％,与其他毒株在82％以下。同时还发现在c末端350-409位,LX4与H120推导氨基酸的同源性为100％,与HB次之(98％),与其他毒株在95％以下。以上研究结果提示:我国地方分离毒株LX4 mRNA_5和mRNA_6 cDNA序列与国内其他分离株最高,表明与国内其他分离株具有较近的?

关键词：传染性支气管炎病毒 cDNA 分子特征 mRNA5 mRNA6

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表达禽流感病毒核蛋白基因重组禽痘病毒的构建及其免疫保护性研究

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中国农业科学 2003年第6期36卷 704-708页

作者：乔传玲于康震姜永萍张建林邓国华孟庆文田国斌唐秀英中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感研究中心农业部动物流感研究中心农业部动物流感研究中心哈尔滨150001 农业部动物流感研究中心哈尔滨150001现在农业部畜牧兽医局工作

从含有禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1)核蛋白 (NP)基因的质粒pUCNP中切下NP基因片段 ,将其亚克隆到pSY5 38质粒 ,再将带有痘苗病毒启动子P11的LacZ基因也平端克隆到pSY5 38质粒 ,然后切下同时含有NP及LacZ基因的片段 ,再亚克... 详细信息

从含有禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1)核蛋白 (NP)基因的质粒pUCNP中切下NP基因片段 ,将其亚克隆到pSY5 38质粒 ,再将带有痘苗病毒启动子P11的LacZ基因也平端克隆到pSY5 38质粒 ,然后切下同时含有NP及LacZ基因的片段 ,再亚克隆到禽痘病毒载体pSY6 81,从而构建出表达核蛋白基因的重组禽痘病毒转移载体pSY(NP +LacZ)。应用脂质体介导的方法将转移载体转染已感染禽痘病毒S FPV 0 17的鸡胚成纤维细胞 ,在X gal存在的条件下 ,利用蓝白斑筛选、数轮蚀斑纯化以及PCR、Western blot鉴定 ,结果证明 ,获得了能高效表达AIVNP蛋白的重组禽痘病毒rFPV NP。SPF鸡体内的免疫保护试验结果表明 ,它能够诱导机体产生较高水平的NP特异性抗体 ,并对H5N1和H7N1这 2种亚型高致病力禽流感病毒的攻击提供一定的保护。

关键词：禽流感病毒重组禽痘病毒核蛋白基因免疫保护性

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