检索结果-内蒙古大学图书馆

中国预防兽医学报 2017年第6期39卷 435-438页

作者：林欢么帅脱添蓓王永强高祥韩春燕高宏雷高玉龙祁小乐刘长军张艳萍王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽免疫抑制病研究团队黑龙江哈尔滨150069 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

为分离鉴定一株鸡传染性贫血病毒(CAV),以及了解其基因组特征,本实验利用MDCC-MSB1细胞对黑龙江某鸡场疑似患病鸡的肝脏组织进行病毒分离,经PCR和间接免疫荧光试验鉴定,结果显示分离得到一株CAV,命名为HLJ16069。克隆该病毒株全基因组,... 详细信息

为分离鉴定一株鸡传染性贫血病毒(CAV),以及了解其基因组特征,本实验利用MDCC-MSB1细胞对黑龙江某鸡场疑似患病鸡的肝脏组织进行病毒分离,经PCR和间接免疫荧光试验鉴定,结果显示分离得到一株CAV,命名为HLJ16069。克隆该病毒株全基因组,测序拼接后获得全长序列,将该病毒株序列与国内外已发表的其它病毒全基因组序列进行同源比对和进化分析,结果显示同源性达96.0%以上,亲缘关系最远的是中国分离株SD1403,而与日本分离株C369亲缘关系最近(99.1%);氨基酸序列分析显示,HLJ16069在VP1的75、89、141和394位氨基酸存在有意义的突变。本研究发现了一些与CAV毒力相关的分子特征,为CAV的毒力变化提供了数据支持。

关键词： CAV 病毒分离全基因组毒力

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鸡痘病毒NX10株TK基因在病毒复制中不是完全非必需的

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微生物学通报 2017年第12期44卷 2914-2922页

作者：王曼曼赵妍张雪梅刘胜旺中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽呼吸道病创新团队黑龙江哈尔滨150069 东北农业大学动物科学技术学院黑龙江哈尔滨150030

【目的】禽痘病毒(FPV)是痘病毒科禽痘病毒属的成员。FPV因其基因组庞大,含有大量复制非必需区,目前作为活病毒载体在禽类和哺乳动物中广泛使用。重组位点的选择是禽痘病毒载体构建的先决条件,外源基因的插入不影响病毒复制是筛选插入... 详细信息

【目的】禽痘病毒(FPV)是痘病毒科禽痘病毒属的成员。FPV因其基因组庞大,含有大量复制非必需区,目前作为活病毒载体在禽类和哺乳动物中广泛使用。重组位点的选择是禽痘病毒载体构建的先决条件,外源基因的插入不影响病毒复制是筛选插入位点的前提。因此,鉴定可供外源基因插入的复制非必需位点将为重组病毒的构建提供更多选择。本研究拟鉴定FPV NX10株胸苷激酶(TK)基因在病毒复制中的必要性。【方法】以TK基因作为靶基因,增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为筛选标记构建转移载体,FPV NX10株为亲本病毒,通过同源重组筛选重组病毒r FPV-ΔTK-EGFP。通过在CEF细胞培养物中添加5-溴脱氧尿苷(BUd R)验证TK基因在FPV复制中的作用。【结果】构建了转移载体p UC19-TK AB-EGFP。在转染后重组病毒克隆纯化过程中,蚀斑克隆中绿色荧光病变所占的比例逐渐增加,但在荧光蚀斑的边缘能观察到不带荧光病变的存在。对第9-15轮随机选取的蚀斑克隆的Western blot分析表明,重组病毒中插入的EGFP基因均能够正确表达,但PCR结果显示在重组病毒中始终存在野生型病毒。在细胞培养液中添加BUd R后,重组病毒不能继续生长。【结论】FPV NX10毒株TK基因在该病毒的复制中不是完全非必需的。

关键词：鸡痘病毒 TK基因重组病毒复制非必需基因

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传染性法氏囊病病毒超强毒株衣壳蛋白的可溶性表达、纯化与活性分析

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中国畜牧兽医 2017年第7期44卷 2096-2102页

作者：高祥李辉张礼洲卢珍王永强高立吴甜甜高玉龙刘长军王笑梅祁小乐中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨150069 江苏省动物重要疫病与人畜共患病协同创新中心扬州225009

为获得高质量的病毒衣壳蛋白VP2,本研究克隆了传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)超强毒株Gx的VP2基因,并亚克隆至载体pCold-Ⅰ,进而获得重组原核表达质粒pCold-Ⅰ-GxVP2,在Transetta(DE3)工程菌中优化条件进行I... 详细信息

为获得高质量的病毒衣壳蛋白VP2,本研究克隆了传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)超强毒株Gx的VP2基因,并亚克隆至载体pCold-Ⅰ,进而获得重组原核表达质粒pCold-Ⅰ-GxVP2,在Transetta(DE3)工程菌中优化条件进行IBDV衣壳蛋白VP2的可溶性表达,运用Ni-NTA亲和层析和凝胶过滤两种技术串联的方法进行蛋白纯化,运用单克隆抗体介导的Western blotting技术鉴定纯化蛋白的特异性,免疫SPF鸡鉴定纯化蛋白的免疫活性。结果显示,在冷休克条件下,IBDV衣壳蛋白VP2在Transetta(DE3)工程菌中实现了可溶性表达;通过纯化获得了高纯度的VP2,浓度为542μg/mL;该蛋白不仅能与VP2单克隆抗体特异性反应,还能刺激鸡产生特异性免疫应答,具有良好的免疫活性。本研究在IPTG为1mmol/L,15℃、120r/min,诱导时间为24h的条件下,实现了有免疫活性的IBDV衣壳蛋白VP2的可溶性表达和纯化。高纯度、可溶、具有功能活性的衣壳蛋白的制备,为深入开展IBDV致病机制研究奠定了基础。

关键词：传染性法氏囊病病毒衣壳蛋白可溶性表达纯化

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猫细小病毒HH-1/86株理化性质鉴定及全基因组测序

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中国兽医学报 2017年第5期37卷 818-822页

作者：程楠赵永坤于永乐希冀王化磊冯娜张渭蛟高玉伟杨松涛刘维全夏咸柱中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点实验室黑龙江哈尔滨150001 军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室吉林长春130062 中国农业大学生物学院农业生物技术国家重点实验室北京100093

本试验对HH-1/86株细小病毒进行了理化性质鉴定和全基因组序列分析。研究结果表明,电镜下可见少量直径20nm左右的立体对称细小病毒粒子。该病毒对热、酸、乙醚具有一定的耐受性,pH在5.8~6.8的0.015mol/L PBS均能凝集0.1%猪红细胞,其中pH... 详细信息

本试验对HH-1/86株细小病毒进行了理化性质鉴定和全基因组序列分析。研究结果表明,电镜下可见少量直径20nm左右的立体对称细小病毒粒子。该病毒对热、酸、乙醚具有一定的耐受性,pH在5.8~6.8的0.015mol/L PBS均能凝集0.1%猪红细胞,其中pH6.5血凝活性最佳。HH-1/86株细小病毒的全基因长5 123nt。其中,A+T含量63.65%,C+G的含量为36.35%。3′末端反向重复序列(inverted terminal repeats,ITR)形成Y型结构,长126nt;5′末端ITR形成U型结构,长198nt。利用MEGA 6.0软件的邻接法(Neighbor-Joining,Replication=1 000)对NS1和VP2基因编码氨基酸进行的种系发生树分析表明,VP2蛋白归于FPV分支,VP2蛋白10个决定抗原性、血凝性和宿主范围的关键氨基酸位点与FPV参照株一致;而NS1蛋白相对保守,归于独立的分支。

关键词：猫细小病毒血凝两端反向重复序列序列分析

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Leachii支原体PCR检测方法的建立与应用

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中国预防兽医学报 2017年第11期39卷 912-915页

作者：陈嘉常继涛王建发杨颗粒武瑞于力黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/牛羊传染病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

为建立一种leachii支原体的检测方法,本研究根据leachii支原体LPPA外膜蛋白编码基因序列设计一对引物,建立了PCR检测方法。结果显示,该方法仅对leachii支原体扩增出539 bp的目的片段,而与牛支原体、丝状支原体山羊亚种、绵羊肺炎支原体... 详细信息

为建立一种leachii支原体的检测方法,本研究根据leachii支原体LPPA外膜蛋白编码基因序列设计一对引物,建立了PCR检测方法。结果显示,该方法仅对leachii支原体扩增出539 bp的目的片段,而与牛支原体、丝状支原体山羊亚种、绵羊肺炎支原体、丝状支原体丝状亚种小菌落型、山羊支原体山羊肺炎亚种等其它支原体无交叉反应,具有良好的特异性;该方法对leachii支原体的最低检测浓度为105 ccu/m L,敏感性较高。采用该方法可以在乳汁和关节液等病料样品中检测到leachii支原体,与分离培养的结果相符。上述结果表明,本研究建立的leachii支原体PCR检测方法具有特异性强、敏感性高的特点,可实现准确、高效检测leachii支原体的目的。

关键词： leachii支原体 PCR 检测

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猪传染性胃肠炎病毒免疫过氧化物酶单层细胞试验原位检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2017年第3期39卷 237-239页

作者：朱蕴暖张鑫朱向东陈建飞时洪艳石达冯力黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪消化道团队黑龙江哈尔滨150069

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的原位检测方法,本研究以TGEV N蛋白的单克隆抗体为一抗,羊抗小鼠IgG-HRP为二抗,AEC过氧化物酶底物为显色液,建立了TGEV的免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)检测方法。检测结果显示,一抗的最佳使用浓度为... 详细信息

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的原位检测方法,本研究以TGEV N蛋白的单克隆抗体为一抗,羊抗小鼠IgG-HRP为二抗,AEC过氧化物酶底物为显色液,建立了TGEV的免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)检测方法。检测结果显示,一抗的最佳使用浓度为0.5 ng/μL,二抗的最佳稀释倍数为1∶2 000倍,经AEC显色,TGEV感染的阳性细胞呈红棕色;对常见的猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒和猪圆环病毒2型等猪病病原检测均为阴性,具有良好特异性;同时该方法能够在普通显微镜下观察到病毒在细胞中的分布情况。本研究建立的方法为TGEV的实验室鉴定及TGEV在感染细胞中的定位和动态分布提供有效的检测手段。

关键词：猪传染性胃肠炎病毒 N蛋白过氧化物酶单层试验

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表达EGFP蛋白新型重组新城疫病毒疫苗载体的构建

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中国兽医科学 2017年第7期47卷 843-849页

作者：赵冉齐甜铭孙军峰刘怀然韩宗玺杨孝朴刘胜旺甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽呼吸道病研究团队黑龙江哈尔滨150069

为构建新型新城疫病毒(NDV)载体疫苗,前期我们将La Sota全长c DNA中的F基因编码区替换为基因Ⅶ型NDV的F基因编码区,并将其裂解位点突变为弱毒株的序列,构建获得了p NDFLSP-m F重组质粒。为探索p NDFLSP-m F是否能够作为载体有效地表达... 详细信息

为构建新型新城疫病毒(NDV)载体疫苗,前期我们将La Sota全长c DNA中的F基因编码区替换为基因Ⅶ型NDV的F基因编码区,并将其裂解位点突变为弱毒株的序列,构建获得了p NDFLSP-m F重组质粒。为探索p NDFLSP-m F是否能够作为载体有效地表达外源蛋白,在p NDFLSP-m F的P基因与M基因之间引入PmeⅠ酶切位点,并将EGFP基因编码区克隆至构建好的p NDFLSP-m F载体中,构建含有EGFP基因的重组质粒p NDFLSP-m F-EGFP。将p NDFLSP-m F-EGFP以及辅助质粒p CI-NP-K、p CI-P-K、p CI-LK共转染表达T7 RNA聚合酶的重组痘病毒预感染的BSR-T7/5细胞,拯救获得了重组病毒La Sota-m FEGFP。通过RT-PCR证明,被拯救的重组病毒中含有插入的外源基因EGFP。荧光观察和Western-blot分析结果表明,EGFP蛋白能在重组病毒中稳定表达。生物学特性测定结果显示,La Sota-m F-EGFP具有低毒力毒株特征,MDT为144 h,能够在鸡胚上有效地复制,EID50为1×108.75/0.1 m L。上述研究结果为研制和开发新型NDV载体疫苗奠定了基础。

关键词：新城疫病毒基因Ⅶ型绿色荧光蛋白

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新城疫弱毒活疫苗中FAdV-4的分离鉴定及分子特征

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微生物学通报 2017年第12期44卷 2773-2781页

作者：刘亮亮王娟李慧昕刘胜旺马得莹东北农业大学动物科学技术学院黑龙江哈尔滨150030 东北农业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

【目的】当前我国鸡群禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAd V)感染严重,该病毒既可水平传播也可经卵垂直传播,因此鸡胚源禽用弱毒活疫苗是否存在FAd V污染,进而造成疫病的传播尚不清楚。检测我国商品化新城疫La Sota弱毒活疫苗中是否存在FAd ... 详细信息

【目的】当前我国鸡群禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAd V)感染严重,该病毒既可水平传播也可经卵垂直传播,因此鸡胚源禽用弱毒活疫苗是否存在FAd V污染,进而造成疫病的传播尚不清楚。检测我国商品化新城疫La Sota弱毒活疫苗中是否存在FAd V污染,探讨国内鸡群中FAd V感染和流行的可能原因。【方法】应用本实验室建立的FAd V PCR检测方法检测商品化新城疫La Sota弱毒活疫苗,并进行FAd V分离鉴定。经序列比对和进化分析,鉴定分离毒株所属种、血清型及进化特征。【结果】分离到一株禽腺病毒,命名为L160962。基因分析表明,分离株L160962的52k和hexon基因片段序列与C种内的血清4型毒株相似性最高,其中与中国毒株HN/151025和CH/HNJZ/2015的相似性为99.9%-100%,与奥地利毒株KR5的相似性为99.3%,但与A、B、D和E种FAd V的相似性分别为79.0%-83.3%。系统进化分析表明,L160962与C种内的血清4型禽腺病毒在同一分支,核苷酸相似性在99.9%以上,应划分为血清4型FAd V。基于分离株L160962的hexon基因构建的系统进化树的拓扑结构,分离株L160962与中国毒株亲缘关系最近,提示疫苗源分离株L160962与我国当前流行毒株相近。【结论】我国商品化的新城疫La Sota弱毒活疫苗中存在血清4型FAd V污染,这可能是我国鸡群中FAd V大面积感染和流行的原因之一。

关键词：禽腺病毒 La Sota疫苗分离鉴定

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HN蛋白携带TC标签的重组新城疫病毒的构建及鉴定

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中国兽医科学 2017年第6期47卷 671-679页

作者：齐甜铭赵文钧陈玉秋孙军峰马得莹东北农业大学动物科学技术学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽呼吸道病研究团队黑龙江哈尔滨150069

新城疫病毒(NDV)是在世界范围内引发家禽发病和死亡的主要病因。HN作为重要的囊膜蛋白,在NDV吸附入侵过程中发挥重要作用。本研究利用反向遗传技术,在HN编码区的N端插入由6个氨基酸组成的TC标签(tetracysteine),成功转染细胞拯救获得TC... 详细信息

新城疫病毒(NDV)是在世界范围内引发家禽发病和死亡的主要病因。HN作为重要的囊膜蛋白,在NDV吸附入侵过程中发挥重要作用。本研究利用反向遗传技术,在HN编码区的N端插入由6个氨基酸组成的TC标签(tetracysteine),成功转染细胞拯救获得TC标记的重组病毒La Sota-HN-NTC,经鉴定La Sota-HN-NTC能够在鸡胚中有效复制,生长曲线与亲本病毒La Sota相似。Western-blot结果显示,La Sota-HN-NTC中HN蛋白的表达量与La Sota相比无明显变化。La Sota-HN-NTC的毒力稍低于La Sota,并且TC标签能够在重组病毒中稳定存在。La Sota-HN-NTC感染的细胞中能够观察到明显的绿色荧光,表明TC标记的HN蛋白能够正常表达并被双砷染料特异性染色。NDV吸附试验表明,La Sota-HN-NTC吸附细胞受体的能力没有因为TC标签发生改变。激光共聚焦监测到了La Sota-HN-NTC感染细胞中HN蛋白的动态分布。本研究为监测HN蛋白在NDV感染过程中的动态分布,阐明HN蛋白在NDV感染中的作用机制提供了工具和基础。

关键词：新城疫病毒 TC标签 HN蛋白

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SU6656对鸡传染性喉气管炎病毒与宿主细胞互作分子网络的影响

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中国预防兽医学报 2017年第8期39卷 605-610页

作者：高琦李海闻晓波刘胜旺冉旭华黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽呼吸道传染病创新团队黑龙江哈尔滨150069

为探索SU6656对鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)感染的影响及调控机制,本研究应用鸡LMH细胞系感染ILTV LJS09株作为实验模型,测定了SU6656对ILTV增殖和毒力的影响,通过高通量RNA测序技术(RNA-Seq)在全基因组范围内检测宿主细胞基因转录谱表... 详细信息

为探索SU6656对鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)感染的影响及调控机制,本研究应用鸡LMH细胞系感染ILTV LJS09株作为实验模型,测定了SU6656对ILTV增殖和毒力的影响,通过高通量RNA测序技术(RNA-Seq)在全基因组范围内检测宿主细胞基因转录谱表达,并利用荧光定量PCR对部分差异表达基因进行验证。进一步的GO功能分析显示,在宿主细胞应答ILTV感染过程中,SU6656所调控基因主要涉及氢离子跨膜运输、辅酶Q的结合、Fe^(2+)和S^(2+)聚集等功能。KEGG通路分析表明,氧化磷酸化通路在SU6656调控ILTV感染的过程中可能发挥重要作用。本研究为进一步解析ILTV感染及致病机制提供了重要依据。

关键词：传染性喉气管炎病毒 RNA-seq SU6656 病毒与宿主互作

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