检索结果-内蒙古大学图书馆

黑龙江畜牧兽医 2014年第10期 15-17,21页

作者：陈玉明高玉龙张礼洲王念高立任宪刚姜莉莉高宏雷秦立廷王永强祁小乐王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室哈尔滨150001

为了研究传染性法氏囊病病毒(IBDV)与宿主B淋巴细胞作用机制,构建鸡法氏囊B淋巴细胞酵母表达文库,试验从3周龄SPF鸡中摘取法氏囊,分离制备B淋巴细胞,从中提取细胞总RNA,使用SMART和LD-PCR技术合成双链cDNA,并进一步与线性化载体pGADT7-... 详细信息

为了研究传染性法氏囊病病毒(IBDV)与宿主B淋巴细胞作用机制,构建鸡法氏囊B淋巴细胞酵母表达文库,试验从3周龄SPF鸡中摘取法氏囊,分离制备B淋巴细胞,从中提取细胞总RNA,使用SMART和LD-PCR技术合成双链cDNA,并进一步与线性化载体pGADT7-Rec共同转化Y187酵母感受态细胞,通过同源重组构建酵母表达文库。结果表明:所构建cDNA文库的效价为9.5×107cfu/mL,重组率为100%,可以用于酵母双杂交试验。

关键词：法氏囊 B淋巴细胞酵母双杂交 cDNA文库

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牛副流感病毒3型TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

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中国兽医科学 2014年第6期44卷 617-623页

作者：董秀梅朱远茂蔡虹王姝吕闯马磊薛飞东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室大动物传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

根据牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)膜蛋白M基因设计引物及探针,以体外转录法制备的cDNA标准品为模板,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性、重复性进行了测定,并对人工感染BPIV3的牛群... 详细信息

根据牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)膜蛋白M基因设计引物及探针,以体外转录法制备的cDNA标准品为模板,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性、重复性进行了测定,并对人工感染BPIV3的牛群临床样本进行了检测。结果显示,建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR的最低检测限为17.6copies/μL,同时进行批内、批间5次重复性试验,变异系数均小于2.5%。应用建立的方法检测牛传染性鼻气管炎病毒、牛腺病毒3型、牛呼吸道合胞体病毒、牛病毒性腹泻-黏膜病病毒1型,结果均为阴性,说明建立的方法特异性较强。用建立的方法检测人工感染BPIV3的犊牛鼻拭子样本,检测结果与样本TCID50的测定结果相符合,但比其更敏感。结果表明,本试验中建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR可以作为BPIV3早期诊断及定量分析的有效技术手段。

关键词：实时荧光定量RT-PCR TaqMan探针牛副流感病毒3型

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结核分枝杆菌rv3802c基因双顺反子真核表达质粒的构建及鉴定

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畜牧与兽医 2014年第10期46卷 1-5页

作者：张娈娈陈利苹曹俊崔保亮李华芳刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

为了构建结核分枝杆菌rv3802c基因双顺反子真核表达质粒,本研究利用重叠延伸PCR技术扩增出rv3802c-HisFlag基因片段,将其克隆到真核表达载体pCDNA3.1(+)上,测序验证后,将基因合成的内部核糖体进入位点和增强型红色荧光蛋白基因片段(IRES... 详细信息

为了构建结核分枝杆菌rv3802c基因双顺反子真核表达质粒,本研究利用重叠延伸PCR技术扩增出rv3802c-HisFlag基因片段,将其克隆到真核表达载体pCDNA3.1(+)上,测序验证后,将基因合成的内部核糖体进入位点和增强型红色荧光蛋白基因片段(IRES-DsRed2)定向插入到这个重组质粒上,经酶切鉴定获得双顺反子表达质粒pC3.1-3LHF-Red。将质粒pC3.1-3LHF-Red转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,通过荧光显微镜观察到增强型红色荧光蛋白成功表达;经Western blot分析表明Rv3802c-HisFlag融合蛋白在CHO细胞中获得了表达。结果表明,本研究成功构建了共表达增强型红色荧光蛋白和Rv3802c-HisFlag融合蛋白的双顺反子表达质粒pC3.1-3LHF-Red,为进一步研究结核分枝杆菌Rv3802c蛋白在分枝杆菌感染细胞过程中的作用奠定基础。

关键词： Rv3802c蛋白 pC3.1-3LHF-Red重组质粒内部核糖体进入位点(IRES) CHO细胞

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结核分枝杆菌rv0199基因在耻垢分枝杆菌中的表达及检测

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中国畜牧兽医 2014年第7期41卷 9-13页

作者：崔保亮陈利苹张娈娈李华芳刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

为研究结核分枝杆菌(***)rv0199基因在该病原致病性中可能发挥的作用,本研究克隆了rv0199基因,在耻垢分枝杆菌(Ms)中异源表达,并对其表达进行检测。将大肠杆菌—分枝杆菌穿梭表达载体pMV261进行改造,向载体中引入常用的6His和StrepⅡ重... 详细信息

为研究结核分枝杆菌(***)rv0199基因在该病原致病性中可能发挥的作用,本研究克隆了rv0199基因,在耻垢分枝杆菌(Ms)中异源表达,并对其表达进行检测。将大肠杆菌—分枝杆菌穿梭表达载体pMV261进行改造,向载体中引入常用的6His和StrepⅡ重组蛋白标签,命名为pMV262。使用Ms/pMV262表达系统对rv0199基因进行超表达,用抗6His标签抗体和抗StrepⅡ标签抗体均能特异的检测到重组蛋白。本试验改造的pMV262穿梭表达载体可很方便的检测***的基因在Ms中的异源表达,不用制备针对蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体。构建的重组菌Ms/262-99为进一步研究rv0199基因的功能提供了材料,奠定了基础。

关键词：结核分枝杆菌 rv0199基因 pMV261 pMV262 耻垢分枝杆菌

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H4N2亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的构建

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中国预防兽医学报 2014年第2期36卷 90-93页

作者：王帅梁立滨邓国华施建忠姜永萍关云涛陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为建立H4N2亚型禽流感病毒(AIV)反向遗传操作系统,本研究构建了A/Duck/JiangXi/21046/2012(H4N2)(W-DKJX)的8个重组质粒,拯救出A/Duck/JiangXi/21046/2012(H4N2)(R-DKJX)。全基因组序列测序结果表明,拯救病毒R-DKJX与野生病毒W-DKJX的核苷酸序列完全相同。受体结合试验表明,野生病毒与拯救病毒均具有人型受体结合特性。以106EID50/50μL剂量鼻腔感染BALB/c小鼠,病毒均仅在小鼠的呼吸道复制,对BALB/c小鼠呈低致病性,可以在感染早期引起小鼠体重轻微下降但并未引起发病或死亡。以上结果表明,两者保持了一致的生物学特性。H4N2亚型AIV反向遗传操作系统的构建为进一步研究H4亚型AIV的致病机理及其跨种传播分子机制等提供了技术平台。

关键词： H4N2 禽流感病毒反向遗传操作系统

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影响禽流感病毒致病性和传播的关键氨基酸位点的研究进展

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中国预防兽医学报 2014年第2期36卷 165-168页

作者：徐晓龙包红梅陈化兰王秀荣中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

A型流感病毒根据其血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的不同分为不同亚型，目前已鉴定出有17种HA亚型和10种NA亚型。禽流感（AvianInfluenza，AI）是由A型流感病毒引起的急性或慢性呼吸道传染病，

关键词：禽流感病毒神经氨酸酶致病性慢性呼吸道传染病 A型流感病毒酸位传播亚型

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H7和N9亚型及A型流感病毒多重荧光定量RT-RCR检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2014年第12期36卷 939-942页

作者：徐晓龙包红梅马勇施建忠曾显营李雁冰王秀荣陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为同时检测H7亚型、N9亚型和A型流感病毒,本研究根据流感病毒H7 HA、N9 NA以及M基因序列分别合成3对引物和3种荧光素标记的探针,建立了多重Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法。特异性试验结果显示,仅H7亚型和N9亚型病毒分别在FAM和JOE通道... 详细信息

为同时检测H7亚型、N9亚型和A型流感病毒,本研究根据流感病毒H7 HA、N9 NA以及M基因序列分别合成3对引物和3种荧光素标记的探针,建立了多重Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法。特异性试验结果显示,仅H7亚型和N9亚型病毒分别在FAM和JOE通道监测到荧光信号,而所有A型参考流感病毒株均可获得Cy5荧光信号,此外其他相关的禽源病毒检测结果均为阴性。同时,以H7N9亚型病毒RNA为模板建立了标准曲线,检测H7 HA、N9 NA以及M基因的R2值均为0.999,最低检出量均为35.4 EID50/m L。批内和批间试验的变异系数均小于1.48%。利用该方法对1 072份临床样品(咽喉和泄殖腔拭子)检测,H7N9亚型和A型流感病毒分别检出7份和23份。该方法可以有助于H7N9亚型和A型流感病毒的快速检测及鉴定。

关键词： A型流感病毒 H7N9亚型流感病毒多重TaqMan荧光定量RT-PCR

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H7N9亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的建立及其疫苗候选株的构建

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中国预防兽医学报 2014年第5期36卷 407-409页

作者：李媛媛郭晶李旭勇王金良范俊梁立滨邓国华施建忠陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为建立H7N9亚型禽流感病毒(AIV)反向遗传操作系统,本研究以H7N9亚型(AIV)A/CK/Shanghai/S1053/2013(CK/53)株为亲本病毒,构建了该病毒株的8质粒反向遗传操作系统,并拯救出救获株rCK/53。全基因组序列测定结果表明,rCK/53与亲本病毒的核... 详细信息

为建立H7N9亚型禽流感病毒(AIV)反向遗传操作系统,本研究以H7N9亚型(AIV)A/CK/Shanghai/S1053/2013(CK/53)株为亲本病毒,构建了该病毒株的8质粒反向遗传操作系统,并拯救出救获株rCK/53。全基因组序列测定结果表明,rCK/53与亲本病毒的核苷酸序列完全一致。同时以A/PueaoRico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以CK/53的HA和NA的表面基因为供体,构建H7N9亚型AIV疫苗候选株CK53/PR8,疫苗株的8个基因来源与预期完全一致。对rCK/53以及疫苗候选株CK53/PR8在MDCK和A549两种细胞中进行生物学特性的比较,在A549中复制差异不显著,而在MDCK中48 h和72 h两者复制具有明显差异。rCK/53反向遗传操作系统的建立和疫苗候选株CK53/PR8的构建为进一步开展H7N9亚型AIV跨宿主传播机制、致病机理及进一步的免疫保护实验奠定了基础。

关键词： H7N9 禽流感病毒反向遗传操作系统疫苗候选株

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猪源化嵌合抗体在杆状病毒中的表达

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中国预防兽医学报 2014年第7期36卷 559-562页

作者：杨玉菊姜福成柴政符芳郑楠王香玲郭殿磊李曦中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 哈尔滨学院黑龙江哈尔滨150086

为构建具有活性的抗副猪嗜血杆菌(***)鼠-猪嵌合单链抗体(scFv),本研究以***单克隆抗体(MAb)杂交瘤细胞1D8株的总RNA制备的cDNA为模板,通过RT-PCR分别扩增抗MAb轻链、重链可变区序列及猪抗体轻链和重链恒定区序列,并将这些片段经重叠延... 详细信息

为构建具有活性的抗副猪嗜血杆菌(***)鼠-猪嵌合单链抗体(scFv),本研究以***单克隆抗体(MAb)杂交瘤细胞1D8株的总RNA制备的cDNA为模板,通过RT-PCR分别扩增抗MAb轻链、重链可变区序列及猪抗体轻链和重链恒定区序列,并将这些片段经重叠延伸PCR分别扩增可变区与恒定区的轻链与重链的序列。将扩增的两个目的基因克隆于双向表达载体pFast-Bac-Dual中,并进一步以其构建的重组杆粒,转染Sf9昆虫细胞筛选制备稳定表达的抗***猪源化嵌合的scFv重组杆状病毒。Western blot、ELISA、体外和体内的抑菌试验表明,抗***猪源化嵌合scFv具有中和活性和抑制细菌增殖的能力,可以为进一步的***的抗体治疗奠定基础。

关键词：副猪嗜血杆菌猪源化嵌合抗体杆状病毒表达

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不同类型H5亚型禽流感疫苗的免疫保护效力比较研究

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中国农业科技导报 2014年第1期16卷 46-51页

作者：赵双成柳金雄陈普成曾显营葛金英乔传玲田国彬姜永萍陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部人兽共患病重点开放实验室哈尔滨150001

为比较以我国首个H5亚型禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/1/1996(H5N1)[GS/GD/96]为基础构建的新型重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1亚型,Re-1株)、禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗(H5亚型)、禽流感、新城疫重组二联活疫苗(rLH5-1株)以及... 详细信息

为比较以我国首个H5亚型禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/1/1996(H5N1)[GS/GD/96]为基础构建的新型重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1亚型,Re-1株)、禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗(H5亚型)、禽流感、新城疫重组二联活疫苗(rLH5-1株)以及禽流感DNA疫苗(H5亚型,pH5-GD)的免疫保护效力。分别将四种禽流感疫苗以2.8μg HA/0.3 mL(肌肉注射)、103PFU/100μL(刺种)、106EID50/100μL(滴鼻、点眼)、15μg/200μL(肌肉注射)等不同剂量和方式免疫3周龄SPF鸡,首次免疫3周后再加强免疫一次,加强免疫2周后用106EID50的高致病力禽流感病毒(HPAIV)GS/GD/96鼻腔途径进行攻击,观察发病与死亡情况。分别于攻毒后第3 d、第5 d、第7 d采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测排毒情况,同时检测免疫及攻毒后血清HI抗体的动态变化。所有疫苗均可对免疫鸡形成100%完全保护(不发病、不致死、不排毒);在病毒攻击前,灭活疫苗(H5N1亚型,Re-1株)、禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗(H5亚型)、禽流感、新城疫重组二联活疫苗(rLH5-1株)以及禽流感DNA疫苗(H5亚型,pH5-GD)所诱导的HI抗体平均水平分别为8.75log2、6.5log2、5.13log2和7.88log2。新型的基因工程疫苗具有良好的免疫保护性,已经或将在H5亚型HPAIV的防治实践中起到有益的补充作用。

关键词：禽流感 H5N1 疫苗保护效力

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