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中国预防兽医学报 2014年第2期36卷 157-159页

作者：郭纪珂戈曼张泽力马建申之义王晓钧内蒙古农业大学兽医学院内蒙古呼和浩特010010 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 东北林业大学野生动物资源学院黑龙江哈尔滨150040

为制备马传染性贫血病毒(EIAV)蛋白表达调控因子Rev的单克隆抗体(MAb),本研究以原核表达并纯化的重组EIAV Rev为免疫原,免疫BALB/c小鼠,将其脾细胞与SP2/0细胞融合,采用间接ELISA方法筛选阳性克隆,经3次细胞克隆纯化后获得一株能够稳定... 详细信息

为制备马传染性贫血病毒(EIAV)蛋白表达调控因子Rev的单克隆抗体(MAb),本研究以原核表达并纯化的重组EIAV Rev为免疫原,免疫BALB/c小鼠,将其脾细胞与SP2/0细胞融合,采用间接ELISA方法筛选阳性克隆,经3次细胞克隆纯化后获得一株能够稳定分泌抗Rev的杂交瘤细胞株。MAb亚型鉴定为IgG2a/κ。Western blot与间接免疫荧光试验结果显示,获得的MAb与真核表达的Rev呈阳性反应。本研究首次制备了抗EIAV Rev的MAb,为Rev的功能研究奠定了基础。

关键词：马传染性贫血病毒 Rev 单克隆抗体

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结核分枝杆菌酯酶Rv1400c原核表达及表达产物的酶活性分析

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吉林农业大学学报 2014年第6期36卷 701-706页

作者：陶荣珊李金伟刘思国王全凯吉林农业大学动物科学技术学院长春130118 吉林省中韩动物科学研究院长春130600 吉林东丰药业股份有限公司东丰136300 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室哈尔滨150001

为探究结核分枝杆菌酯酶Rv1400c活性，以进一步研究Rv1400c的结构和功能。以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，对 Rv1400c 基因进行扩增，并将其克隆到 pET28b （＋）原核表达载体上，构建pET28b－Rv1400c重组质粒，然后将构建的重组... 详细信息

为探究结核分枝杆菌酯酶Rv1400c活性，以进一步研究Rv1400c的结构和功能。以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，对 Rv1400c 基因进行扩增，并将其克隆到 pET28b （＋）原核表达载体上，构建pET28b－Rv1400c重组质粒，然后将构建的重组质粒转化到BL21（ DE3）表达菌株中，增菌后用IPTG进行诱导表达再用亲和层吸树脂法进行纯化，利用不同底物、不同pH、不同温度对纯化后的Rv1400c酯酶进行活性分析。结果表明：成功构建出pET28b－Rv1400c重组质粒；SDS－PAGE和Western blot显示，Rv1400c以包涵体形式表达，蛋白分子质量为39 ku；在对8种底物的筛选中发现Rv1400c在C2～C14中具有活性，其中以在C2中活性最好；在以C12为底物、pH 8？0、37℃条件下酯酶活性最高。

关键词：结核分枝杆菌酯酶Rv1400c pET28b-Rv1400c重组质粒包涵体酯酶活性

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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒对仔猪骨髓感染及损伤的初步研究

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中国预防兽医学报 2014年第9期36卷 684-687页

作者：李莉王刚刘永刚李爱东陶冶佟杰于颖涂亚斌王淑杰孙明霞姜成刚蔡雪辉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 西北农林科技大学动物医学学院陕西杨凌712100 吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118

为研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)对断奶仔猪骨髓的损伤,本研究采用HP-PRRSV HuN4株接种30日龄的PRRSV抗原及抗体阴性的健康断奶仔猪,并在病毒感染后10 d检测仔猪骨髓内病毒感染及细胞凋亡情况。PCR和间接免疫荧光试验... 详细信息

为研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)对断奶仔猪骨髓的损伤,本研究采用HP-PRRSV HuN4株接种30日龄的PRRSV抗原及抗体阴性的健康断奶仔猪,并在病毒感染后10 d检测仔猪骨髓内病毒感染及细胞凋亡情况。PCR和间接免疫荧光试验结果显示HuN4株感染仔猪骨髓内存在病毒;流式细胞计数分析和TUNEL法检测结果显示病毒感染仔猪的骨髓内出现大量的凋亡细胞。本实验结果表明,HP-PRRSV能够感染仔猪骨髓,引起仔猪骨髓损伤并导致机体免疫抑制。本研究为进一步探索HP-PRRSV感染诱导仔猪中枢免疫器官的损伤机制奠定了基础。

关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒骨髓细胞凋亡

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马TRIM5α基因的扩增及抗EIAV作用评价

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中国预防兽医学报 2014年第8期36卷 620-623页

作者：蔡伟刚那雷刘荻萩马建尹鑫张泽力艾有为王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030 东北林业大学野生动物资源学院黑龙江哈尔滨150040

TRIM5α是一种重要的天然免疫因子,能够限制多种逆转录病毒的跨种感染。为研究马的TRIM5α是否具有抗病毒作用,本实验采用RT-PCR技术从马外周血液细胞的总RNA中扩增TRIM5α基因。测序结果表明,与GenBank中唯一的马TRIM5α(eqTRIM5α)基... 详细信息

TRIM5α是一种重要的天然免疫因子,能够限制多种逆转录病毒的跨种感染。为研究马的TRIM5α是否具有抗病毒作用,本实验采用RT-PCR技术从马外周血液细胞的总RNA中扩增TRIM5α基因。测序结果表明,与GenBank中唯一的马TRIM5α(eqTRIM5α)基因序列相比马基因组预测的TRIM5α(eqTRIM5α-predicted)基因在其C末端部位有208 bp片段的插入,该插入造成TRIM5α的截短突变(eqTRIM5α-S)。通过删除插入片段后得到与eqTRIM5α-predicted基因相同的全长马的TRIM5α(eqTRIM5α-F)基因。同时将eqTRIM5α-S基因和eqTRIM5α-F基因分别插入pLPCX-HA真核表达载体中构建重组质粒,并分别转染293T细胞,转染24 h后感染马传染性贫血(EIAV)假病毒。通过检测荧光素酶活性,实验结果表明相对于阴性对照组eqTRIM5α-S可以有效地降低EIAV假病毒的复制,而eqTRIM5α-F则无该生物学功能。但通过将两种eqTRIM5α重组质粒与EIAV-gag表达重组质粒共转染293T细胞,结果表明eqTRIM5α-S和eqTRIM5α-F均不能降解Gag蛋白,这表明eqTRIM5α-S可能存在另一种机制限制EIAV的复制。

关键词：马TRIM5α 马传染性贫血病毒抗病毒作用衣壳蛋白降解作用

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Mycoplasma mycoides *** Ben-1株一个新的膜蛋白的特性研究

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中国预防兽医学报 2014年第5期36卷 354-358页

作者：周玉梅汪洋李媛邹晓辉刘素丽白帆吴金迪辛九庆中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/国家牛传染性胸膜肺炎指定检测实验室黑龙江哈尔滨150001 吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118 东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150001

为研究Mycoplasma mycoides ***(Mmm)Ben-1弱毒疫苗传代致弱的机制,本研究通过比较Mmm Ben-1株和其兔体内传代致弱毒株Ben-470的全基因组序列,发现在Ben-470株中缺失了一个编码165个氨基酸(分子量约19 ku)的495 bp的假定蛋白基因,命名为... 详细信息

为研究Mycoplasma mycoides ***(Mmm)Ben-1弱毒疫苗传代致弱的机制,本研究通过比较Mmm Ben-1株和其兔体内传代致弱毒株Ben-470的全基因组序列,发现在Ben-470株中缺失了一个编码165个氨基酸(分子量约19 ku)的495 bp的假定蛋白基因,命名为p588,扩增该基因,并表达重组P588(rP588)蛋白,制备兔抗血清。经细菌膜蛋白不同组份的提取及western blot鉴定,结果显示P588是一种膜蛋白,并且rP588与CBPP国际标准血清呈阳性反应。通过激光共聚焦显微镜观察到rP588对牛肺细胞(EBL)具有明显的粘附作用,并且ELISA试验也证明该蛋白的这种粘附为特异性粘附。上述结果表明P588蛋白是Mmm Ben-1的一个粘附蛋白。

关键词：牛传染性胸膜肺炎基因P588 粘附

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虎源伪狂犬病毒的鉴定及gB基因分析

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中国病原生物学杂志 2014年第12期9卷 1057-1060页

作者：李元果高晓龙桑晓宇王海军张成林王爱荣于志君任志广郑学星冯娜王铁成杨松涛黄耕高玉伟夏咸柱胡永浩甘肃农业大学甘肃兰州730070 军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病重点实验室吉林长春130122 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点实验室黑龙江哈尔滨150001 北京动物园北京100081

目的对不明原因死亡虎进行病毒感染检测,并对病毒部分保守基因序列进行分析。方法采集不明原因病死虎肺组织,研磨后提取总DNA,使用特异性引物对伪狂犬病毒gB基因、gD基因进行PCR扩增、测序并构建进化树;经负染法染色后用电子显微镜观察... 详细信息

目的对不明原因死亡虎进行病毒感染检测,并对病毒部分保守基因序列进行分析。方法采集不明原因病死虎肺组织,研磨后提取总DNA,使用特异性引物对伪狂犬病毒gB基因、gD基因进行PCR扩增、测序并构建进化树;经负染法染色后用电子显微镜观察病毒形态结构;取研磨组织液接种家兔,观察病毒的致病力。结果 PCR扩增组织样品为gB基因、gD基因阳性,基因序列经blast比对伪狂犬病毒。将gB基因通过序列测定分析并与GenBank中近4年公布的9株伪狂犬病毒gB基因比对,同源性为99.5%-100%。进化树分析该病毒与2012年北京家猪分离株属同一进化分支。组织研磨液置电镜观察,见病毒呈圆形,直径100nm左右,有囊膜,为具有典型特征的疱疹病毒样病毒粒子。家兔接种组织研磨液后出现啃咬接种部位,抽搐,嘶叫等伪狂犬病症状。结论本研究在病死虎体内检测到伪狂犬病毒,表明濒危野生动物虎已受到伪狂犬病毒病的威胁。

关键词：虎伪狂犬病毒 PCR鉴定 gB基因进化分析

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高致病性PRRSV HuN4株不同代次病毒对仔猪胸腺损伤的研究

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中国预防兽医学报 2014年第5期36卷 343-345,382页

作者：陶冶王刚刘永刚李莉李爱东于颖涂亚斌王淑杰姜成刚蔡雪辉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物疫病诊断中心黑龙江哈尔滨150001 吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118 西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

为研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)不同致弱代次病毒对断奶仔猪胸腺的损伤,本研究选用HP-PRRSV HuN4株在Marc-145细胞中传代致弱的F5、F15、F23、F30代及弱毒疫苗HuN4 F112代分别接种30日龄的PRRSV抗原及抗体阴性健康断... 详细信息

为研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)不同致弱代次病毒对断奶仔猪胸腺的损伤,本研究选用HP-PRRSV HuN4株在Marc-145细胞中传代致弱的F5、F15、F23、F30代及弱毒疫苗HuN4 F112代分别接种30日龄的PRRSV抗原及抗体阴性健康断奶仔猪。实验结果显示:HuN4 F30感染组胸腺的眼观病变、胸腺重量、病理组织学变化、病毒载量及胸腺细胞凋亡比例均与F23感染组有显著差别(p<0.05)。本实验结果表明,HuN4 F23代仍然能够引起仔猪胸腺萎缩并导致机体免疫抑制,而F30代已不能引起断奶仔猪胸腺萎缩现象。因此,HP-PRRSV HuN4 F23、F30代可以作为研究HP-PRRSV HuN4致胸腺萎缩的分子机制的关键代次。本研究为进一步研究HP-PRRSV感染诱导仔猪胸腺萎缩和胸腺细胞凋亡的分子机制奠定了基础。

关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株致弱病毒胸腺萎缩细胞凋亡

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猪脑心肌炎病毒2B蛋白与RACK1蛋白相互作用的鉴定

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中国预防兽医学报 2014年第5期36卷 339-342页

作者：王岩黄丽崔尚金李江南杨春梅于会彬郭东伟张元峰夏雪山翁长江昆明理工大学生命科学与技术学院云南昆明650500 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物病原监测与流行病学研究创新团队黑龙江哈尔滨150001

为筛选与猪脑心肌炎病毒(EMCV)2B蛋白相互作用的宿主蛋白,本实验利用酵母双杂交方法筛选BHK-21细胞表达文库制备与EMCV 2B蛋白相互作用的宿主蛋白RACK1蛋白。酵母共转化试验和免疫共沉淀试验表明两者可以特异性结合,激光共聚焦试验表明... 详细信息

为筛选与猪脑心肌炎病毒(EMCV)2B蛋白相互作用的宿主蛋白,本实验利用酵母双杂交方法筛选BHK-21细胞表达文库制备与EMCV 2B蛋白相互作用的宿主蛋白RACK1蛋白。酵母共转化试验和免疫共沉淀试验表明两者可以特异性结合,激光共聚焦试验表明两者共定位于细胞质中。为定位RACK1与2B蛋白相互作用区域,本研究构建了RACK1截短表达重组质粒,并将其与pCAGGS-Flag-2B共转染HEK293细胞,利用免疫共沉淀试验验证其相互作用区域。结果显示2B蛋白与宿主细胞RACK1蛋白存在相互作用,并且证明相互作用区域位于RACK1蛋白的N端。

关键词：猪脑心肌炎病毒酵母双杂交 2B蛋白 RACK1蛋白相互作用

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马传染性贫血病毒弱毒疫苗gp90多样性及其对病毒体外增殖的影响

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中国预防兽医学报 2014年第3期36卷 182-186页

作者：秦玉寅王雪峰韦华冕王帅林跃智杜承王晓钧周建华胡建军塔里木大学生命科学学院塔里木盆地生物资源保护利用省部共建重点实验室新疆阿拉尔843300 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 塔里木大学动物科学学院兵团塔里木畜牧科技重点实验室新疆阿拉尔843300

为研究马传染性贫血病毒(EIAV)弱毒疫苗gp90基因多样性的生物学意义,本研究对EIAV驴胎皮肤细胞弱毒疫苗(EIAVFDDV13)gp90基因进行测序,在随机获得的15个克隆中,不同克隆推导的氨基酸平均差异率为2.7%(0~5.8%),其中克隆F13-15与感染性克... 详细信息

为研究马传染性贫血病毒(EIAV)弱毒疫苗gp90基因多样性的生物学意义,本研究对EIAV驴胎皮肤细胞弱毒疫苗(EIAVFDDV13)gp90基因进行测序,在随机获得的15个克隆中,不同克隆推导的氨基酸平均差异率为2.7%(0~5.8%),其中克隆F13-15与感染性克隆pLGFD3-8的gp90之间的差异率均为4.8%。以pLGFD3-8为骨架,通过对gp90基因的替换方法构建了感染性克隆pLGFD13-15。将pLGFD13-15转染驴胎皮肤细胞后,拯救出一株衍生病毒vpLGFD13-15。比较vpLGFD13-15和vpLGFD3-8在驴胎皮肤细胞和马单核细胞来源的巨噬细胞中的复制特性显示,vpLGFD13-15在感染驴胎皮肤细胞后4 d^6 d内,上清液中的病毒含量明显高于vpLGFD3-8。但vpLGFD13-15在巨噬细胞中的复制较vpLGFD3-8明显延迟。结果表明,EIAV疫苗株中不同gp90基因的病毒克隆在体外复制特性存在差异。该研究结果为进一步分析EIAV弱毒疫苗基因多样性的生物学意义,特别是对其诱导免疫保护作用的研究奠定了基础。

关键词：马传染性贫血病毒弱毒疫苗 gp90 基因多样性

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鉴别猪伪狂犬病病毒强弱毒的高效纳米PCR检测试剂盒及初步应用

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养猪 2014年第5期 100-104页

作者：马兴杰仇铮崔宇超王晓玲张晶朱宝孔苗苗罗亚坤崔尚金中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

试验建立了鉴别猪伪狂犬病病毒（PRV）强弱毒高效纳米PCR检测方法，并对相关条件进行优化，组装了试剂盒。根据PRV保守序列设计3对引物分别扩增PRV基因组的gB（431 bp）、gE（316 bp）和gG（202 bp）3个基因，用于区分PRV强毒与基因缺... 详细信息

试验建立了鉴别猪伪狂犬病病毒（PRV）强弱毒高效纳米PCR检测方法，并对相关条件进行优化，组装了试剂盒。根据PRV保守序列设计3对引物分别扩增PRV基因组的gB（431 bp）、gE（316 bp）和gG（202 bp）3个基因，用于区分PRV强毒与基因缺失毒株，优化反应条件后建立了纳米PCR检测PRV强弱毒的方法并组装试剂盒，对试剂盒进行了特异性、敏感性、批内批间可重复性及保存期评估试验，并对临床样品进行检测。特异性试验表明，此试剂盒对于PRV能够扩增出431（gB）、316（gE）和202 bp（gG）的目的片段，对于PRV-Bartha-K61能够扩增出431和202 bp的目的片段，对于猪捷申病毒、非洲猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒及大肠杆菌等DNA或cDNA均未扩增出条带。敏感性试验表明，此试剂盒的方法比常规PCR方法敏感100-1000倍，最低核酸拷贝数检出量可以达到101 copy/μL数量级。试剂盒的批内、批间检测结果无明显差异，稳定性良好。-20℃至少可保存12个月。在对中国黑龙江、吉林等7个省市的临床送检的117份样品进行检测，结果显示，PRV强毒阳性率为51%，阴性率为49%，未发现有弱毒感染。鉴别PRV强弱毒纳米PCR试剂盒的研制，对PRV感染的早期检测、野毒株和疫苗株的鉴别、疾病控制等都有重要意义，而且也可以用于其他动物PRV感染的检测和早期诊断。

关键词：检测猪伪狂犬病病毒

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