检索结果-内蒙古大学图书馆

利用CRISPR/Cpf1技术构建HEK293细胞DDX21基因稳定敲除株及功能鉴定

中国兽医学报 2020年第2期40卷 257-263页

作者：鲁国涛王辉曾为俊邵玉乐许曼陈洪岩孟庆文中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

利用CRISPR/Cpf1基因编辑技术构建DDX21基因稳定敲除的细胞株,并检测其生物学功能。设计、构建靶向DDX21基因向导RNA表达载体,与Cpf1表达载体共转染HEK293细胞,通过流式筛选、基因测序、Western blot和细胞增殖能力检测鉴定细胞株;荧光... 详细信息

利用CRISPR/Cpf1基因编辑技术构建DDX21基因稳定敲除的细胞株,并检测其生物学功能。设计、构建靶向DDX21基因向导RNA表达载体,与Cpf1表达载体共转染HEK293细胞,通过流式筛选、基因测序、Western blot和细胞增殖能力检测鉴定细胞株;荧光定量PCR检测病毒感染后模式识别受体(TLR-3、TLR-7、MDA-5)、Ⅰ型干扰素、IL-6以及抗病毒蛋白OAS mRNA水平表达情况。结果显示:成功筛选到2株DDX21基因敲除的细胞株,蛋白免疫印迹显示DDX21蛋白不表达;与野生型(wild type,WT)相比敲除株形成细胞单层的时间明显延长(P<0.01);H9N2亚型禽流感病毒感染试验表明,模式识别受体TLR-3、MDA-5的mRNA表达水平上调,TLR-7表达水平无明显差异,IFN-α、IFN-β、IL-6及抗病毒蛋白OAS的mRNA表达水平下调,表明DDX21基因敲除阻断了DDX21-TRIF-MyD88信号通路;TCID50测定结果显示,差异最高可达到WT的3.01倍,表明DDX21基因敲除后流感病毒复制增加。本研究利用CRISPR/Cpf1系统获得2株DDX21基因稳定敲除的HEK293细胞株,为深入研究DDX21基因功能、病毒感染的天然免疫应答和调控研究奠定理论基础。

关键词： DDX21基因 H9N2亚型禽流感病毒 CRISPR/Cpf1 HEK293细胞基因敲除

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DHV-Ⅰ和DEV双重荧光定量PCR方法的建立

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中国兽医科学 2021年第2期51卷 169-175页

作者：陈肖韩刘海燕苏世博赵丽丽陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为建立快速特异的能够鉴别诊断DHV-I和DEV的荧光定量PCR方法,根据NCBI中I型鸭肝炎病毒和鸭肠炎病毒的保守序列,采用Beacon Designer 7.5软件,设计了2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。接着,对反应条件进行优化,验证其... 详细信息

为建立快速特异的能够鉴别诊断DHV-I和DEV的荧光定量PCR方法,根据NCBI中I型鸭肝炎病毒和鸭肠炎病毒的保守序列,采用Beacon Designer 7.5软件,设计了2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。接着,对反应条件进行优化,验证其特异性及敏感性。结果,该方法特异性好,对鹅细小病毒、番鸭细小病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、鸭坦布苏病毒、禽网状内皮增生病毒、禽呼肠弧病毒、减蛋综合征病毒、鸭甲肝病毒3型9种病毒检测,均无荧光信号。而且其灵敏度高,对DHV-I和DEV的最小检出量均为200拷贝。利用所建立的荧光定量PCR方法对江苏徐州采集的166份肛拭子进行检测,检出I型鸭肝炎病毒13份(阳性率为7.8%),鸭肠炎病毒75份(阳性率为45%)。上述结果表明,本研究建立了灵敏度高特异性强的DHV-I和DEV双重荧光定量PCR方法。

关键词： Ⅰ型鸭肝炎病毒鸭肠炎病毒,双重荧光定量

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肠炎沙门菌感染ICR小鼠模型的建立

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中国兽医科学 2017年第10期47卷 1257-1263页

作者：王伟尹海畅吕兴峰刘思国陈洪岩孟庆文中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis,SE)是引起人类食源性疾病的重要革兰阴性菌之一,可引起禽、家畜等动物较为严重的感染症状。本研究为了建立肠炎沙门菌感染ICR小鼠模型,标准菌株SE 50336分别以1×10~8、1×10~7、1×0~6... 详细信息

肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis,SE)是引起人类食源性疾病的重要革兰阴性菌之一,可引起禽、家畜等动物较为严重的感染症状。本研究为了建立肠炎沙门菌感染ICR小鼠模型,标准菌株SE 50336分别以1×10~8、1×10~7、1×0~6、1×10~5、1×10~4CFU/mL的剂量通过口腔灌注方式感染6周龄ICR雌鼠,每组10只,以接种PBS的10只小鼠作为对照组,测定肠炎沙门菌对ICR小鼠的半数致死量(LD_(50))。将40只ICR雌鼠随机分成两组,以测定的LD_(50)剂量接种肠炎沙门菌,通过临床症状、体重变化、组织病理学、组织中细菌载量以及TNF-α与IL-6表达水平评价肠炎沙门菌对小鼠的致病性。结果,标准菌株SE 50336对ICR小鼠的LD_(50)为1×10^(5.67)CFU/mL。感染后第3天,小鼠出现采食量下降、活动减少、皮毛色泽变暗、畏寒扎堆等症状;感染后第5天,小鼠的平均体重较对照组呈现下降趋势,后期开始恢复。组织病理学结果显示,肝脏出现灶状坏死,形成血栓,出现坏死细胞;脾脏先后出现纤维素性坏死性脾炎,白髓内淋巴细胞减少,呈小空泡状,出现坏死灶。菌落载量分析发现,细菌载量随着感染进程而升高,在脾脏中繁殖速度最快,载量也最高,肝脏次之。定量PCR结果显示,TNF-α表达水平呈升高趋势,而IL-6表达水平降低。上述结果表明,本试验成功建立了肠炎沙门菌标准菌株SE50336感染ICR小鼠的模型,为肠炎沙门菌感染与致病机制的研究提供了有价值的动物模型,也为表达抗菌肽转基因小鼠抗肠炎沙门菌的评价奠定了基础。

关键词：肠炎沙门菌 ICR小鼠感染模型炎性细胞因子

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部分兽医相关单位Ⅱ级生物安全柜的性能测试与分析

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实验动物与比较医学 2022年第2期42卷 111-116页

作者：马文杰张伟王伟苏世博郭慧娟张贺王梓刘怀然陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室国家禽类实验动物资源库黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

目的了解兽医相关单位实验室Ⅱ级生物安全柜的性能与使用情况。方法测试哈尔滨市3家兽医相关单位正在使用的126台Ⅱ级生物安全柜,依据相关标准针对检测结果进行性能指标的判定与分析,了解生物安全柜的使用情况。结果126台Ⅱ级生物安全... 详细信息

目的了解兽医相关单位实验室Ⅱ级生物安全柜的性能与使用情况。方法测试哈尔滨市3家兽医相关单位正在使用的126台Ⅱ级生物安全柜,依据相关标准针对检测结果进行性能指标的判定与分析,了解生物安全柜的使用情况。结果126台Ⅱ级生物安全柜性能检测总合格率为17.5%。Ⅱ级生物安全柜的外观完整性、工作区洁净度、送排风高效过滤器检漏、气流模式、流入气流流速、下降气流流速、照度、噪声及报警和联锁系统共9个项目的检测总合格率分别为100%、100%、100%、100%、49.2%、92.9%、68.3%、22.2%和100%。结论兽医相关单位实验室Ⅱ级生物安全柜性能检测总合格率较低,应对生物安全柜做定期性能检测,加强运行维护管理,及时排除生物安全隐患,防止实验室感染事故发生。

关键词：生物安全柜性能检测兽医实验室

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自主研发生物安全型换笼工作台的性能检测与评价

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实验动物与比较医学 2022年第2期42卷 102-110页

作者：苏世博马文杰王伟郭慧娟张贺王梓康雷刘守琦刘怀然司昌德苟春天张伟陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室国家禽类实验动物资源库黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

目的对自主研发的生物安全型换笼工作台进行功能检测与安全性评价。方法依据YY 0569—2011《Ⅱ级生物安全柜》、RB/T 199—2015《实验室设备生物安全性能评价技术规范》等标准对自主研发的由深圳泓腾生物科技有限公司生产的生物安全型... 详细信息

目的对自主研发的生物安全型换笼工作台进行功能检测与安全性评价。方法依据YY 0569—2011《Ⅱ级生物安全柜》、RB/T 199—2015《实验室设备生物安全性能评价技术规范》等标准对自主研发的由深圳泓腾生物科技有限公司生产的生物安全型换笼工作台(HT-1303)的各项性能指标进行检测,并判定其有效性及安全性。结果换笼工作台的主体外观完整性和稳定性、工作区洁净度、流入气流流速、下降气流流速、照度、噪声、气流流向、高效过滤器等检测效果良好,达到Ⅱ级生物安全柜标准。污染物品回收舱及器物表面灭菌舱的气密性效果良好,其尺寸、灭菌笼盒数量等还需进一步改进。结论本团队研制的生物安全型换笼工作台可实现整机正常运行,其各项指标合格,能够完成负压环境下独立通风笼具的更换,并保证操作者、实验对象及环境的安全。

关键词：换笼工作台性能检测生物安全

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STAT3在猪流行性腹泻病毒感染的作用及机制初步探索

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中国兽医杂志 2019年第7期55卷 3-7页

作者：杨丽君张健许嘉宇张璐冯力陈洪岩王玉娥中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室

为探究信号传导及转录激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染过程中的作用,采用STAT3特异性siRNA处理HEK293和IPEC细胞,作用24 h后,通过荧光定量PCR和Western Blot试验显示,其能够明显降低STAT3的mRNA水平和蛋白水平;在此条件下接种PEDV,通过荧光定量PCR试验,显示当STAT3的mRNA水平降低时能够显著抑制PEDV的RNA水平,Western Blot试验结果也证实抑制STAT3内源性表达能够显著抑制PEDV复制。为进一步研究STAT3的作用机制,采用STAT3特异性siRNA处理这两种细胞,24 h后经过荧光定量PCR检测发现敲低STAT3后,干扰素刺激基因MxA、ISG15以及IFN-β,IFN-λ的mRNA水平均显著升高。本研究对于进一步阐明STAT3参与PEDV感染引发的IFN抗病毒反应提供了试验依据。

关键词： STAT3 PEDV IFN

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鸡NK细胞相关C型凝集素样编码基因研究进展

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动物医学进展 2015年第6期36卷 134-137页

作者：吴少莲韩凌霞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物与比较医学团队兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

鸡的C型凝集素样基因编码包括鸡自然杀伤(natural killer,NK)细胞受体在内的许多免疫分子。鸡C型凝集素样编码基因分别位于自然杀伤基因复合体(NK gene complex,NKC)和主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)区域,... 详细信息

鸡的C型凝集素样基因编码包括鸡自然杀伤(natural killer,NK)细胞受体在内的许多免疫分子。鸡C型凝集素样编码基因分别位于自然杀伤基因复合体(NK gene complex,NKC)和主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)区域,在NKC区为CD69和CD94/NKG2,在MHC区为相邻的B-NK和B-Lec基因。B-NK是目前唯一已证明表达于NK细胞上的凝集素样受体,其配体尚不清楚,但是已经证明B-NK能够和活化的细胞上的配体结合。论文主要讨论CD69、CD94/NKG、B-NK和BLec 4个基因的系统发育比较和蛋白质结构的研究进展。

关键词：鸡 NK细胞 C型凝集素样受体

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实验用SPF大白猪和长白猪母系遗传结构分析

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农业生物技术学报 2019年第1期27卷 97-107页

作者：辛畅高彩霞权金强马璐璐陈洪岩东北农业大学生命科学学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室

无特定病原体(specific pathogen free, SPF)大白猪(Sus scrofa)和长白猪作为重要的实验动物,其遗传学质量控制研究十分必要。为分析实验用SPF大白猪、长白猪的线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)控制区(displacement-loop region, D-loop区)遗传多样性,揭示其母系遗传结构,本研究提取SPF大白猪和长白猪基因组DNA,同时以我国地方品种巴马小型猪和融水小型猪为对照,应用PCR技术扩增其mtDNA D-loop区,进行测序比对。结果显示,107个样本中共检测到40个多态位点,分为13个单倍型,与地方品种相比,大白猪和长白猪单倍型数较少,分别含有3种和2种特有单倍型,只有1个共享单倍型H4。两猪群中各存在1个优势单倍型。单倍型多样度(Hd)分析,融水小型猪单倍型多样度最高(0.767),长白猪最低(0.429),大白猪和巴马小型猪分别为0.566和0.503。此外,中介网络关系图和系统进化树发现大白猪和长白猪与欧洲猪种亲缘关系较近。本研究表明实验用SPF大白猪和长白猪种群的单倍型数较少,各存在1个优势单倍型,遗传多样性低,具有清晰的母系遗传结构。研究结果有利于进一步的实验动物标准化以及遗传质量控制研究。

关键词：无特定病原体(SPF)猪 mtDNA 控制区母系遗传结构

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鹅源星状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

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中国比较医学杂志 2021年第3期31卷 43-48页

作者：苏世博蒲路莎陈肖韩赵丽丽陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室/国家禽类实验动物资源库哈尔滨150069

目的建立一种可快速诊断鹅源星状病毒的荧光定量PCR方法。方法分析比对NCBI下载的鹅源星状病毒全基因组序列,在其ORF1a保守区设计一对特异性引物及Taq Man探针,优化反应条件,建立标准曲线,并验证其特异性,敏感性和稳定性。结果该方法最... 详细信息

目的建立一种可快速诊断鹅源星状病毒的荧光定量PCR方法。方法分析比对NCBI下载的鹅源星状病毒全基因组序列,在其ORF1a保守区设计一对特异性引物及Taq Man探针,优化反应条件,建立标准曲线,并验证其特异性,敏感性和稳定性。结果该方法最低检测线限为1.50×10^(2)copies/μL,批内和批间检测变异系数分别小于0.5%和4%,且对其他常见水禽病毒无特异性扩增。临床应用结果显示检出率明显高于常规RT-PCR方法。结论建立了一种鹅源星状病毒的Taq Man荧光定量PCR方法,该方法特异性强,灵敏度高且重复性良好,适用于鹅源星状病毒的早期检测和定量分析。

关键词：鹅源星状病毒荧光定量PCR 雏鹅痛风检测方法

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鹅源星状病毒ORF2基因原核表达及遗传进化分析

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浙江农业学报 2020年第5期32卷 789-797页

作者：蒲路莎苏世博陈肖韩赵丽丽陈洪岩黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

应用RT-PCR方法扩增鹅源星状病毒(goose astrovirus,GoAstV)HLJ01株的ORF2基因,将扩增产物克隆至pET32a原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21进行表达。通过SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到大小约为106 ku的ORF2蛋白,与理论值相符。将诱... 详细信息

应用RT-PCR方法扩增鹅源星状病毒(goose astrovirus,GoAstV)HLJ01株的ORF2基因,将扩增产物克隆至pET32a原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21进行表达。通过SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到大小约为106 ku的ORF2蛋白,与理论值相符。将诱导表达的蛋白经镍亲和层析柱纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体,并测定其抗体效价。Western-blotting结果显示,ORF2蛋白可被鼠抗GoAstV阳性血清识别。序列分析表明,该毒株与其他鹅源星状病毒参考毒株的核苷酸相似性介于37.8%~99.3%之间,HLJ-1801分离株与已发表的8株鹅源星状病毒毒株位于同一分支,表明其属于一种新型星状病毒成员。利用原核表达系统成功高效地表达了GoAstV ORF2蛋白,融合蛋白以包涵体形式存在。本试验成功获得了纯化的ORF2重组蛋白和小鼠抗GoAstV多克隆抗体,为进一步研究ORF2蛋白对星状病毒感染的诊断试剂的研发奠定了基础。

关键词：鹅星状病毒 ORF2 原核表达遗传进化分析

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