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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：高彩霞辛畅陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室150069哈尔滨

标准化SPF猪群是生命科学研究的重要支撑条件之一，在畜牧兽医生产实践中也发挥着重要作用。大白猪和长白猪是最普遍的主导瘦肉型商业品系，在实验动物方面的研究鲜有报道。本文介绍了 SPF大白猪和长白猪基础群的引进，探讨了猪群的标...

标准化SPF猪群是生命科学研究的重要支撑条件之一，在畜牧兽医生产实践中也发挥着重要作用。大白猪和长白猪是最普遍的主导瘦肉型商业品系，在实验动物方面的研究鲜有报道。本文介绍了 SPF大白猪和长白猪基础群的引进，探讨了猪群的标准化研究和应用前景，其研究不仅丰富了我国实验动物资源，也为畜禽疫病防控技术研发提供核心支持。

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RIG-Ⅰ介导PCV2感染小鼠诱导天然免疫应答的研究

RIG-Ⅰ介导PCV2感染小鼠诱导天然免疫应答的研究

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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：孟庆文许曼黄立平邵玉乐曾为俊王辉鲁国涛刘长明陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室150069哈尔滨

猪圆环病毒2型(PCV2)为环状单链DNA病毒，是引起PMWS的主要病原，导致严重的免疫抑制，给猪业生产造成重大的经济损失.RIG-Ⅰ是细胞质RNA传感器，除识别病毒RNA外，还能检测DNA病毒的入侵.为探究RIG-Ⅰ在PCV2感染诱导的RIG-Ⅰ信号通路...

猪圆环病毒2型(PCV2)为环状单链DNA病毒，是引起PMWS的主要病原，导致严重的免疫抑制，给猪业生产造成重大的经济损失.RIG-Ⅰ是细胞质RNA传感器，除识别病毒RNA外，还能检测DNA病毒的入侵.为探究RIG-Ⅰ在PCV2感染诱导的RIG-Ⅰ信号通路、Ⅰ型干扰素及炎性细胞因子中的作用，本研究分别将30只8周龄野生型(WT)ICR雌鼠与30只RIG-Ⅰ-/-小鼠各随机分成两组(感染组和对照组)，腹腔接种PCV2a/LG株，在接种后第3、7、14、21和28 d分别测量小鼠体重，采集小鼠肺、脾组织.

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TLR3基因敲除对小鼠免疫功能影响的初步分析

TLR3基因敲除对小鼠免疫功能影响的初步分析

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2016第十四届中国北方实验动物科技年会

作者：姜雪婷王伟李永青庞中兵孙海阳陈洪岩孟庆文中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室实验动物与比较医学团队黑龙江哈尔滨 150001

目的：通过对TLR3基因敲除小鼠免疫相关指标分析,研究TLR3基因敲除对小鼠免疫功能影响,为应用敲除小鼠模型研究TLR3在病毒感染引发的天然免疫反应中的作用及病毒致病的分子机制奠定基础. 方法：PCR、测序分析敲除小鼠基因型;利用聚... 详细信息

目的：通过对TLR3基因敲除小鼠免疫相关指标分析,研究TLR3基因敲除对小鼠免疫功能影响,为应用敲除小鼠模型研究TLR3在病毒感染引发的天然免疫反应中的作用及病毒致病的分子机制奠定基础. 方法：PCR、测序分析敲除小鼠基因型;利用聚肌胞苷酸(Poly I：C)处理24h,通过自动血液计数仪测量分析外周血中淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞百分含量;Real-TimePCR检测TLR3信号通路中TRIF、IFN-β、Mx、IL-6和TNF-α相对表达情况;流式细胞术分析外周血中树突状细胞(CD86)、NK细胞(CD49)、淋巴细胞(CD3、CD8)比例变化. 结果：本实验所用TLR3基因敲除小鼠为纯合子(TLR3-/-),测序表明TLR3基因缺失13个碱基;在Poly I：C刺激下,TLR3-/-小鼠较WT小鼠外周血中淋巴细胞百分比显著降低,单核细胞中性粒细胞显著升高,脾脏中TRIF、IFN-β、Mx、IL-6和TNF-α表达量显著降低,外周血中CD86+细胞比例显著降低,CD49+细胞未见显著差异,细胞毒性T淋巴细胞(CD3+CD8+)显著降低. 结论：在Poly I：C刺激条件下,TLR3基因缺失引起其下游信号转导通路变化,影响IFN-β基因表达及炎性因子的释放,从而影响小鼠免疫功能.

关键词：病毒感染免疫功能 TLR3基因敲除干扰素β 炎性因子

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鸭瘟病毒在鸭胚脐带间充质干细胞上生物学特性的研究

鸭瘟病毒在鸭胚脐带间充质干细胞上生物学特性的研究

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第八届北京实验动物科学国际论坛

作者：徐丽晶陆涛峰王怡平陈洪岩赵丽丽中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

为了解鸭瘟病毒(DPV)在鸭胚脐带间充质干细胞上的适应性和增殖情况.本实验将DPV接种鸭胚脐带间充质干细胞,连续传代致第10代,通过CPE观察、病毒粒子电镜观察、核酸检测、间接免疫荧光检测等方法分析其生物学特性,并测定了连续10代的病... 详细信息

为了解鸭瘟病毒(DPV)在鸭胚脐带间充质干细胞上的适应性和增殖情况.本实验将DPV接种鸭胚脐带间充质干细胞,连续传代致第10代,通过CPE观察、病毒粒子电镜观察、核酸检测、间接免疫荧光检测等方法分析其生物学特性,并测定了连续10代的病毒滴度(TCID50).第一代DPV即在鸭胚脐带间充质干细胞上产生了明显的CPE,并且在连续传代的过程中CPE能够稳定出现.电镜观察显示,初步提纯的病毒悬浮液在电镜下可见到结构清晰的子代病毒.PCR检测结果显示,F1～F10代DPV均能扩增出大小为416bp的UL6基因片段.间接免疫荧光又进一步证实DPV的阳性血清能够对染毒病灶产生特异性荧光染色.而且连续测定10代的病毒滴度(TCID50)均不低于10-6.43.说明DPV能在鸭胚脐带间充质干细胞上稳定增殖.本研究有望为获得高纯度鸭瘟病毒及细胞源疫苗研究提供理论基础.

关键词：鸭瘟病毒鸭胚脐带间充质干细胞适应性病毒增殖

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CRISPR/Cpf1介导DDX21基因敲除载体活性检测

CRISPR/Cpf1介导DDX21基因敲除载体活性检测

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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：鲁国涛张子博田璐李昂陈洪岩孟庆文中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

目的：旨在建立一种简单、快捷、高效、稳定的家鸡基因组编辑系统,为研究基因功能及模型建立奠定基础.方法：根据鸡DDX21基因序列设计选择4个gRNA,构建Cpf1/gRNA敲除表达载体并转染状态良好的DF-1细胞,经流式细胞仪收集表达红色荧光蛋...

目的：旨在建立一种简单、快捷、高效、稳定的家鸡基因组编辑系统,为研究基因功能及模型建立奠定基础.方法：根据鸡DDX21基因序列设计选择4个gRNA,构建Cpf1/gRNA敲除表达载体并转染状态良好的DF-1细胞,经流式细胞仪收集表达红色荧光蛋白的阳性细胞,T7E1酶切法选择高效的敲除载体,TA克隆测序法评估其介导DDX21基因敲除的效率.结果：结果表明4个gRNA序列正确插入表达载体中;T7E1酶切结果显示Cpf1/gRNA1基因靶向敲除活性最高,TA测序分析发现其敲除活性为33.3％.结论：本研究初步建立了CRISPR/Cpf1系统介导的基因编辑技术,结果表明CRISPR/Cpf1能够稳定介导鸡DF-1细胞上的基因组编辑,这为进一步揭示DDX21基因功能、建立DDX21基因敲除的细胞系和鸡体模型提供了理论基础和科学依据.

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鸭圆环病毒双拷贝串联基因组感染性克隆的构建

鸭圆环病毒双拷贝串联基因组感染性克隆的构建

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：文辉强武永淑张晓娜廉传江赵丽丽韩凌霞陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室实验动物与比较医学团队黑龙江哈尔滨 150001

以鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)FJ/2011分离株基因组为模板,构建带遗传标记的双拷贝串联基因组感染性克隆(pEGFP-2DuCV).应用分子生物学技术,以GenBank数据库中本实验室测得的DuCV全基因组序列(登录号KF726087)为模板,以DuCV ORF1... 详细信息

以鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)FJ/2011分离株基因组为模板,构建带遗传标记的双拷贝串联基因组感染性克隆(pEGFP-2DuCV).应用分子生物学技术,以GenBank数据库中本实验室测得的DuCV全基因组序列(登录号KF726087)为模板,以DuCV ORF1中的EcoRI酶切位点(GAATTC代替GAGTTC)为上下游引物5'端,经PCR反应得到DuCV全基因组,克隆构建于pMD 18-T载体中得到pMD-DuCV.以pMD-DuCV为模板,分别设计两对引物(引物位置不变,引物一的上下游分别含有XhoI和EcoRI位点,引物二的上下游分别含EcoRI和HindⅢ位点),分别经PCR反应得到两个DuCV全基因组,PCR产物分别用自带酶切、pEGFP-C1载体由XhoI和HindⅢ酶切后,三片段回收连接后得到双拷贝DuCV串联基因组感染性克隆pEGFP-2DuCV.经鸡胚成纤维细胞系(DF-1)与鸡马立克病毒肿瘤淋巴细胞系(MDCC-MSB1)体外转染试验验证,转染后12h均可观察到EGFP发出较强的绿色荧光.体外转染后验证病毒蛋白的表达、病毒传代以及超微形态学观察等是下一步进行病毒拯救研究重点.

关键词：鸭圆环病毒双拷贝串联基因组感染性克隆

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表达抗流感Mx-RNAis基因转基因鸡研究

表达抗流感Mx-RNAis基因转基因鸡研究

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：孟庆文王伟田进王建超邓瑞坡陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室实验动物与比较医学团队黑龙江哈尔滨150001

本研究采用赤道开窗法将同时表达Mx、RNAis双基因重组慢病毒注射入新生种蛋胚盘下腔，制备转基因(TG)鸡，通过PCR,RT-PCR,Southern blot,Western blot及Tail-PCR方法等方法检测FO代TG鸡，结果表明外源基因整合到鸡基因组2号染色体上，... 详细信息

本研究采用赤道开窗法将同时表达Mx、RNAis双基因重组慢病毒注射入新生种蛋胚盘下腔，制备转基因(TG)鸡，通过PCR,RT-PCR,Southern blot,Western blot及Tail-PCR方法等方法检测FO代TG鸡，结果表明外源基因整合到鸡基因组2号染色体上，并能检测到外源基因的表达;TG鸡与野生型(WT)鸡交配繁育F1代，经鉴定再用F1代TG鸡与WT鸡繁育F2代，现已繁育至F3代，建立微核心群单元，在每代TG鸡的血液与组织中均能够检测到外源基因的整合、表达，表明外源基因能稳定遗传;H5N1感染4周龄TG鸡与WT鸡，攻毒后观察到TG感染组鸡比WT感染组鸡的死亡时间延长;TG感染组咽拭子、肺组织病毒滴度显著低于WT感染组;对感染后各组鸡细胞因子进行检测，IFN-α与TNFα在TG组的表达量显著低于WT组，表明TG组鸡与WT组鸡相比病毒感染程度低，证明转基因鸡有抗禽流感病毒的作用。

关键词：转基因鸡抗禽流感病毒基因表达

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利用CRISPR/Cpf1技术构建HEK293细胞DDX21基因稳定敲除株及功能鉴定

利用CRISPR/Cpf1技术构建HEK293细胞DDX21基因稳定敲除株及功能鉴...

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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：鲁国涛王辉曾为俊邵玉乐许曼陈洪岩孟庆文中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

利用CRISPR/Cpf1基因编辑技术构建DDX21基因稳定敲除的细胞株,并检测其生物学功能.设计、构建靶向DDX21基因向导RNA表达载体,与Cpf1表达载体共转染HEK293细胞,通过流式筛选、基因测序、Western印迹、细胞增殖能力检测鉴定细胞株;荧光定...

利用CRISPR/Cpf1基因编辑技术构建DDX21基因稳定敲除的细胞株,并检测其生物学功能.设计、构建靶向DDX21基因向导RNA表达载体,与Cpf1表达载体共转染HEK293细胞,通过流式筛选、基因测序、Western印迹、细胞增殖能力检测鉴定细胞株;荧光定量PCR检测病毒感染后模式识别受体(TLR-3、TLR-7、MDA-5)、Ⅰ型干扰素、IL-6以及抗病毒蛋白OAS mRNA水平表达情况.结果显示：成功筛选到两株DDX21基因敲除的细胞株,蛋白免疫印迹显示DDX21蛋白不表达;与野生型(Wildtype,WT)相比形成细胞单层的时间明显延长(P＜0.01);H9N2亚型禽流感病毒感染实验表明：模式识别受体TLR-3、MDA-5的mRNA表达水平上调,TLR-7表达水平无明显差异,IFN-α、IFN-β、IL-6及抗病毒蛋白OAS的mRNA表达水平下调,表明DDX21基因敲除阻断了DDX21-TRIF-MyD88信号通路;TCID50测定结果显示,差异最高可达到WT的3.01倍,表明DDX21基因敲除后流感病毒复制增加.本研究利用CRISPR/Cpf1系统获得两株DDX21基因稳定敲除的HEK293细胞株,为深入研究DDX21基因功能、病毒感染的天然免疫应答和调控研究奠定了基础.

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疱疹病毒逃避宿主递呈抗原性多肽的几种策略

疱疹病毒逃避宿主递呈抗原性多肽的几种策略

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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：佟相慧陈洪岩韩凌霞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

疱疹病毒是个古老而庞大的家族，为了对抗宿主的抵御进化出了独特的针对抗原递呈途径的免疫逃避机制，主要靶向抗原处理相关转运体(TAP)和MHCⅠ类分子。不同疱疹病毒可能采取相同的策略，而同一疱疹病毒也可能有多种方式。本文就目前已...

疱疹病毒是个古老而庞大的家族，为了对抗宿主的抵御进化出了独特的针对抗原递呈途径的免疫逃避机制，主要靶向抗原处理相关转运体(TAP)和MHCⅠ类分子。不同疱疹病毒可能采取相同的策略，而同一疱疹病毒也可能有多种方式。本文就目前已报道的疱疹病毒针对TAP介导的病毒肽转运过程和MHC Ⅰ类分子介导的病毒肽递呈过程的干扰，做一简单综述，希望对其他尚未阐明免疫逃避机制的疱疹病毒的研究有所帮助。

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SPF鸡不同生长阶段粪便菌群组成及多样性研究

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实验动物与比较医学 2017年第3期37卷 231-239页

作者：周妍刁晨曦张圆圆于海波陆涛峰赵丽丽陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室实验动物与比较医学创新团队哈尔滨150069 东北农业大学生命科学学院哈尔滨150030 牡丹江师范学院生命科学与技术学院牡丹江157011

目的提供SPF鸡不同生长阶段肠道菌群的组成及多样性数据。方法采集10日龄、12周龄、23周龄和52周龄SPF鸡粪便,利用Illumina HiSeq 2500高通量测序方法,对样品16S rRNA的两个高变区(V3-V4)进行测序分析,并进行了α-多样性指数、β-多样... 详细信息

目的提供SPF鸡不同生长阶段肠道菌群的组成及多样性数据。方法采集10日龄、12周龄、23周龄和52周龄SPF鸡粪便,利用Illumina HiSeq 2500高通量测序方法,对样品16S rRNA的两个高变区(V3-V4)进行测序分析,并进行了α-多样性指数、β-多样性指数和粪便群落特征分析。结果四个生长阶段粪便样品菌群具有相似的较高的丰富度和良好的均匀度,物种多样性无显著差异(P>0.05);厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度占95%以上;乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)、肠球菌属(Enterococcus)为优势菌属,不同时期丰度差异达显著水平(P<0.05)。结论四个生长阶段菌群组成多样,且优势菌群主要为有益菌。该实验结果能够为SPF鸡品质评定、健康监测和安全性评价提供依据。

关键词： SPF鸡不同生长阶段粪便菌群 16s rRNA Illumina HiSeq 2500高通量测序

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