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畜牧兽医学报 2023年第8期54卷 3206-3216页

作者：武琪张玉娟刘桐辛九庆徐青元中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069

牛支原体(***)是感染牛的一种重要病原体,可导致感染牛出现肺炎、关节炎、乳房炎、角膜结膜炎和生殖道炎等多种临床症状,给养牛业造成了巨大经济损失。***黏附素在***致病过程中发挥重要作用,包括病原感染、细胞入侵、免疫逃逸和毒力产... 详细信息

牛支原体(***)是感染牛的一种重要病原体,可导致感染牛出现肺炎、关节炎、乳房炎、角膜结膜炎和生殖道炎等多种临床症状,给养牛业造成了巨大经济损失。***黏附素在***致病过程中发挥重要作用,包括病原感染、细胞入侵、免疫逃逸和毒力产生。迄今为止,已鉴定出十多种***黏附素。这些黏附素主要结合宿主细胞的纤溶酶原(plasminogen,Plg)、纤连蛋白(fibronectin,FN)、硫酸肝素(heparin sulfate,HS)和淀粉样前体样蛋白-2(amyloid precursor-like protein-2,APLP2)。本文将对目前已知的***黏附素及其宿主细胞靶蛋白的研究现状进行综述,为***已知和未知黏附素的鉴定和应用提供参考。

关键词： Mycoplasma bovis 黏附素黏附素结合蛋白

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NMRAL1对流感病毒复制的调控机制

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中国农业科学 2022年第10期55卷 2067-2076页

作者：严娅王广文孔凡迪王旭远王一涵李俊平赵玉辉李呈军陈化兰姜丽中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室

【目的】流感病毒是一种人兽共患病原，常引起大流行，给人类健康造成巨大威胁，且流感病毒易发生变异，能不断逃逸宿主细胞的免疫反应，对现有抗流感药物产生耐药性，因此寻找抵抗流感的新方法迫在眉睫。研究通过探索NMRAL1(NmrA-like ... 详细信息

【目的】流感病毒是一种人兽共患病原，常引起大流行，给人类健康造成巨大威胁，且流感病毒易发生变异，能不断逃逸宿主细胞的免疫反应，对现有抗流感药物产生耐药性，因此寻找抵抗流感的新方法迫在眉睫。研究通过探索NMRAL1(NmrA-like family domain-containing protein 1)对流感病毒复制的影响，并揭示其发挥作用的分子机制，为抗流感药物研发提供潜在靶点。【方法】采用siRNA干扰技术在A549细胞中下调表达NMRAL1，并通过Western Blot检测siRNA干扰后NMRAL1的表达水平；在下调表达NMRAL1的细胞中，分别感染A/Anhui/2/2005 (AH05)(H5N1)和A/WSN/33 (H1N1)两株不同亚型流感病毒，利用蚀斑试验检测感染病毒后24和48 h细胞上清中的病毒滴度。为确定NMRAL1影响流感病毒复制的具体阶段，在HEK293T细胞中瞬时转染NMRAL1-Myc-pCAGGS质粒过表达NMRAL1，通过双荧光素酶报告系统检测过表达NMRAL1对流感病毒聚合酶活性的影响；使用免疫荧光技术对流感病毒NP蛋白进行染色，通过激光共聚焦试验观察下调表达NMRAL1对感染病毒后3、4、5、6和8 h NP蛋白在被感染细胞中的定位情况的影响，判断下调表达NMRAL1是否影响流感病毒的入核和出核过程；利用Western Blot检测下调表达NMRAL1对流感病毒各病毒蛋白表达的影响和对流感病毒激活I型干扰素通路下游IFN刺激基因（ISGs）表达的影响，利用间接免疫荧光试验进一步研究NMRAL1对流感病毒复制的影响。【结果】Western Blot检测发现NMRAL1 siRNA能显著下调NMRAL1表达，在下调表达NMRAL1的A549细胞中分别感染H5N1和H1N1病毒，并通过蚀斑试验检测感染病毒后细胞上清中的病毒滴度，结果显示在下调表达NMRAL1的细胞中，感染流感病毒后24和48 h收取的细胞上清中病毒滴度显著下降，表明NMRAL1能促进不同亚型流感病毒的复制；为进一步探索NMRAL1调控流感病毒复制的具体机制，利用双荧光素酶报告系统检测流感病毒聚合酶活性，发现过表达NMRAL1对流感病毒聚合酶活性无明显影响；激光共聚焦试验结果显示下调NMRAL1表达不影响NP蛋白的入核和出核过程，同时Western Blot检测表明下调NMRAL1表达不影响各病毒蛋白的表达；但荧光定量PCR试验结果显示下调NMRAL1表达能够促进流感病毒感染诱导的IFN-β mRNA水平上升，且Western Blot检测发现下调表达NMRAL1促进I型干扰素通路下游的MxA和IFITM3抗病毒蛋白的表达，与此同时，间接免疫荧光试验结果显示下调NMRAL1表达可显著抑制流感病毒复制。【结论】在流感病毒感染过程中，NMRAL1不影响流感病毒的入侵以及转录翻译过程，而是通过抑制I型干扰素通路激活从而抑制MxA、IFITM3等抗病毒因子的表达，最终促进流感病毒复制。研究证实宿主因子NMRAL1正调控流感病毒的复制，丰富了参与流感病毒复制的宿主因子网络。

关键词： NMRAL1 流感病毒病毒复制 IFN-β 抗病毒基因

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基于量子点微球和RPA技术的ASFV抗体-核酸快速现场联检方法的建立

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中国农业科学 2024年第24期57卷 4990-5002页

作者：赵伊然单衍可李嘉豪何昭群王欣艺温墩王米拉储蕊赵东明刘斐南京农业大学动物医学院单分子生物化学与生物医学实验室兽医生物技术国家重点实验室/中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

【背景】非洲猪瘟（African swine fever,ASF）作为世界动物卫生组织（world organization for animal health,WOAH）规定必须通报的疫病之一，同时也是我国一类动物疫病，因缺乏有效疫苗和治疗方法，早期、有效、快速和敏感的检测对防... 详细信息

【背景】非洲猪瘟（African swine fever,ASF）作为世界动物卫生组织（world organization for animal health,WOAH）规定必须通报的疫病之一，同时也是我国一类动物疫病，因缺乏有效疫苗和治疗方法，早期、有效、快速和敏感的检测对防控ASF至关重要。目前，非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）常用临床检测方法主要包括荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)、酶联免疫吸附测定试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）等，但这些技术均需要复杂的操作、昂贵的仪器以及较长的检测时间，不适用于现场快速检测。此外，ASFV感染后宿主体内的抗体和核酸含量在不同时间段有明显的差异，因此单独检测ASFV核酸或抗体可能会导致假阴性的存在。【目的】通过研发一种基于量子点微球和重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification,RPA）的ASFV抗体-核酸联检试纸条，实现ASFV抗体和核酸的现场同时检测，以提高检测的灵敏度、特异性，降低检测成本，节约检测时间。【方法】通过结合量子点荧光免疫层析技术及RPA技术建立了同时检测ASFV抗体及核酸的侧向流层析试纸条，配套便携式荧光分析仪可实现ASFV抗体-核酸的快速现场联检。本研究优化了量子点偶联蛋白量及检测线包被浓度等条件。在此基础上，确定了该检测方法的cutoff值、敏感性、特异性及重复性，并将所建立的ASFV联检试纸条与市售ELISA试剂盒、qPCR检测试剂盒对临床样品进行检测，比较检测结果，验证该方法的符合率，评价该试纸条的实用性。【结果】联检试纸条使用方便、快速，整个检测过程可在30 min内完成。且与其他6种常见猪传染性病毒之间不存在交叉反应，特异性良好。核酸检测灵敏度可达10 copies/μL，抗体检测灵敏度可达1:3 200。抗体和核酸检测批内变异系数均小于10%，批间变异系数均小于15%，重复性良好。经市售ELISA试剂盒、qPCR试剂盒分别验证，符合率均为100%。除此之外，在临床样品检测中发现，有2份抗体检测阳性的样品其对应的猪只核酸检测为阴性，且这2头猪无明显临床症状，该结果进一步证明了通过抗体和核酸联检能够提高检测的准确性，减少假阴性的存在。【结论】核酸-抗体联检单次试验成本与病原核酸抗体分别检测总成本相比有所降低，节约了检测成本和时间，对于ASF急性发作、慢性感染检测均敏感，避免了仅检测单个核酸或单个抗体的局限性。此方法对操作环境要求低，使用的荧光分析仪便于携带，易于操作，整个操作过程无需过多昂贵的实验仪器和专业技术人员，降低了对检测设备的精密要求，适用在偏远地区以及基层中开展ASFV检测工作。因此，该方法有望成为未来猪场ASFV即时检测的可靠方法。

关键词：非洲猪瘟核酸检测抗体检测侧向流免疫试纸条

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非洲猪瘟病毒p34蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

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中国动物传染病学报 2024年第6期32卷 176-181页

作者：王晓刘传霞鲍苗菲李雪雯李婷婷陈欣郑君翁长江中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室基础免疫创新团队哈尔滨150069

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染家猪或野猪而引起的一种高度接触性传染病。ASFV编码超过150种蛋白,其中大多数蛋白的功能有待鉴定。本研究旨在表达ASFV p34蛋白,并制备其单克隆抗体,为p34蛋白的功能研究提供材料。首先构建了... 详细信息

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染家猪或野猪而引起的一种高度接触性传染病。ASFV编码超过150种蛋白,其中大多数蛋白的功能有待鉴定。本研究旨在表达ASFV p34蛋白,并制备其单克隆抗体,为p34蛋白的功能研究提供材料。首先构建了重组原核表达质粒pET-21a-p34,将质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE以及Western blot鉴定,结果显示,得到了可溶性表达的His-p34重组蛋白。将纯化的蛋白免疫小鼠,然后通过细胞融合以及ELISA筛选,获得了1株能够稳定分泌p34蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经Western blot鉴定,该抗体能够特异性识别通过转染质粒过表达的外源p34蛋白以及ASFV感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)表达的内源p34蛋白;免疫荧光试验表明,外源转染以及内源表达的p34蛋白均能被特异性标记;免疫沉淀(IP)试验结果显示,该单克隆抗体能够特异性的结合HEK293T细胞中外源表达的p34蛋白以及ASFV感染PAMs中内源表达的p34蛋白。综上所述,本研究成功制备了p34蛋白的单克隆抗体,该抗体可以用于内源性p34蛋白的鉴定,为该蛋白的功能研究奠定了基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 p34蛋白原核表达单克隆抗体

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消毒剂的抗病毒研究进展

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中国动物传染病学报 2023年第4期31卷 200-206页

作者：祁梦南孙元仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069

猪病毒性传染病发病急、蔓延快,危害大,严重影响猪只健康以及农业经济发展。对于疾病的防控主要靠疫苗免疫以及严格的生物安全措施。自2018年非洲猪瘟在中国暴发,且无商品化疫苗,各大养猪场越来越重视生物安全,将其作为防控非洲猪瘟的... 详细信息

猪病毒性传染病发病急、蔓延快,危害大,严重影响猪只健康以及农业经济发展。对于疾病的防控主要靠疫苗免疫以及严格的生物安全措施。自2018年非洲猪瘟在中国暴发,且无商品化疫苗,各大养猪场越来越重视生物安全,将其作为防控非洲猪瘟的重要手段,而其中的消毒环节是养殖过程中的重中之重。因此,如何选择适宜的消毒剂并进行合理使用是养殖户值得注意的。本文对猪场常用消毒剂的作用机理、使用方法、评价方法以及适用范围等进行总结归纳,以期对我国消毒剂在猪场中的规范使用提供参考。

关键词：消毒剂作用机理效果评价适用范围

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SPF鸡的主要垂直传播性病原体及其检测标准分析

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实验动物与比较医学 2024年第3期44卷 305-312页

作者：王梦杰马文杰潘喻陈见兴张贺夏长友王玉娥中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069 西南大学动物医学院重庆400715

无特定病原体(specific pathogen-free,SPF)鸡在禽病及疫苗研究中应用广泛。垂直传播性疾病以垂直传播的方式传递给雏鸡,降低雏鸡成活率、增加生产成本、给整个养殖行业带来巨大经济损失的同时,严重影响SPF鸡的培育与使用。因此,需要加... 详细信息

无特定病原体(specific pathogen-free,SPF)鸡在禽病及疫苗研究中应用广泛。垂直传播性疾病以垂直传播的方式传递给雏鸡,降低雏鸡成活率、增加生产成本、给整个养殖行业带来巨大经济损失的同时,严重影响SPF鸡的培育与使用。因此,需要加强研究及管理人员对鸡垂直传播性疫病病原的认识,并制定出行之有效的监测措施。质量监测是保证SPF鸡质量的重要环节,其中病原检测是首要环节。在此基础上,应结合净化方式以及生物安全防控手段来培育合格的SPF鸡群。本文综述了包括病毒性病原、细菌性病原和支原体在内的鸡主要垂直传播性病原和这些病原的检测方法,比较美国企业标准和中国国家标准中有关SPF鸡微生物检测项目及方法的差异。结果分析显示,在两种标准中,垂直传播性病原大肠埃希菌、奇异变形杆菌以及沙门菌、禽白血病等垂直传播性疾病均未被列入SPF鸡微生物检测项目。而这些病原存在混合感染特征,一旦爆发,将严重影响鸡群健康。为生产更高质量的SPF鸡群,有必要将其列入必检项目。本文旨在帮助人们了解SPF鸡微生物监测的相关标准以及垂直传播性病原的危害和防控策略,为SPF鸡病原检测及净化提供参考。

关键词： SPF鸡垂直传播病原检测

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基于16S rDNA分析饲喂唾液乳杆菌XP132对白羽肉种鸡肠道菌群的影响

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畜牧兽医学报 2024年第9期55卷 4091-4099页

作者：何塔娜胡馨匀米洁兰高立张艳萍祁小乐崔红玉杨桂连高玉龙中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069 吉林农业大学动物医学院长春130118

旨在评估1株替抗专利菌株唾液乳杆菌XP132对健康白羽肉种鸡肠道菌群的影响。选取12只6月龄白羽肉种鸡,随机平均分为试验组和对照组,每组6只。试验组白羽肉种鸡每日饲喂活菌数为1×10^(9)CFU的唾液乳杆菌XP132发酵液,对照组饲喂PBS,... 详细信息

旨在评估1株替抗专利菌株唾液乳杆菌XP132对健康白羽肉种鸡肠道菌群的影响。选取12只6月龄白羽肉种鸡,随机平均分为试验组和对照组,每组6只。试验组白羽肉种鸡每日饲喂活菌数为1×10^(9)CFU的唾液乳杆菌XP132发酵液,对照组饲喂PBS,连续饲喂4周后,基于16S rDNA测序方法,比较两组鸡肠道菌群发生的相对改变。结果表明,在饲喂唾液乳杆菌XP132后,通过α多样性分析物种丰富度,试验组菌群丰富程度高于对照组。在菌群组成的属水平上,饲喂唾液乳杆菌XP132的肉种鸡肠道菌群中,螺旋体科NK4A136属、梭状芽胞杆菌属、副拟杆菌属、罗氏菌属等有益物种丰度增加;在种水平上,饲喂唾液乳杆菌XP132组的肉种鸡肠道菌群中乳杆菌、拟杆菌、鼠李糖乳杆菌类等有益物种丰度增加。结果提示,本试验条件下,饲喂唾液乳杆菌XP132改变了白羽肉种鸡肠道菌群的丰富度,增加了有益菌菌群的物种丰度。

关键词：肠道菌群唾液乳杆菌 16S rDNA 白羽肉种鸡

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保护性病毒抗原的筛选策略及其在新型疫苗研发中的应用

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生物工程学报 2022年第8期38卷 2857-2871页

作者：钟代浪王涛罗瑞仇华吉孙元中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

随着疫苗研发技术的发展,新型疫苗在传染病的预防中得到了广泛应用。由于新型疫苗安全性良好,因此其在烈性病疫苗的应用中有着得天独厚的优势,然而研制新型疫苗的前提是筛选出保护性抗原。随着各种组学研究的发展,针对真核生物的多种生... 详细信息

随着疫苗研发技术的发展,新型疫苗在传染病的预防中得到了广泛应用。由于新型疫苗安全性良好,因此其在烈性病疫苗的应用中有着得天独厚的优势,然而研制新型疫苗的前提是筛选出保护性抗原。随着各种组学研究的发展,针对真核生物的多种生物信息学方法代表着最前沿的技术手段。相对于真核细胞,病毒具有更为简单的结构,对应着相对简单的研究方法,未来的保护性抗原筛选策略,需要结合生物信息学和传统分子生物学方法的优势。本文分别从宿主和病毒入手,论述了病毒保护性抗原的筛选策略,列举了一系列基于真核细胞开发的可能用于保护性抗原筛选的生物信息学方法,并总结了应用保护性抗原进行新型疫苗设计的案例,以便加深对病毒保护性抗原筛选策略的认知,为新型疫苗的研发提供借鉴。

关键词：保护性抗原筛选策略新型疫苗

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抗病毒免疫中干扰素与炎症信号通路的交互调控:防御反应与维持稳态

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微生物学报 2022年第10期62卷 3709-3721页

作者：戴静雯周萍萍李素仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

天然免疫是机体通过识别自身或外部危险信号后,为维持体内稳态而逐步建立起来的一系列防御反应,当宿主细胞内的模式识别受体识别胞内病原相关分子模式后激活干扰素(interferon,IFN)、核因子-kappa B(nuclear factor-kappa B,NF-κB)和... 详细信息

天然免疫是机体通过识别自身或外部危险信号后,为维持体内稳态而逐步建立起来的一系列防御反应,当宿主细胞内的模式识别受体识别胞内病原相关分子模式后激活干扰素(interferon,IFN)、核因子-kappa B(nuclear factor-kappa B,NF-κB)和炎性小体等信号通路。IFNs在天然免疫应答中发挥重要作用,它诱导的抗病毒基因能够通过多种方式抵御病毒的感染,炎症反应则是机体自动的防御反应,能够在病毒感染机体时释放促炎性细胞因子以调控机体的免疫反应,进而发挥抗病毒作用。在病毒感染过程中,IFN信号通路与炎症反应调控网络中的关键分子如NF-κB/RelA、PKR等存在一定的交互作用,此外,IFN信号通路及其产生的细胞因子又影响其他信号通路的活化,进而调控机体的免疫应答以维持自身稳态,它们之间的交互调控失衡将会引起过度炎症反应,导致组织器官的免疫病理损伤,例如SARS-CoV-2感染机体时产生的过度炎症反应。本文综述了机体抗病毒免疫过程中干扰素信号通路与炎症反应之间的交互调控,为研发抗病毒策略提供新思路。

关键词：抗病毒免疫干扰素炎性小体先天性免疫炎症反应

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内网质应激反应:调控天然免疫信号传导抵御病毒感染的枢纽

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中国兽医学报 2023年第4期43卷 804-811页

作者：曹宏伟张柯慧李淑红仇华吉李素中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是细胞为应对内质网腔内错误折叠与未折叠蛋白聚集以及钙离子平衡紊乱等状况,而激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)、内质网过载反应和Caspase-12介导的凋亡通路等信号途... 详细信息

内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是细胞为应对内质网腔内错误折叠与未折叠蛋白聚集以及钙离子平衡紊乱等状况,而激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)、内质网过载反应和Caspase-12介导的凋亡通路等信号途径的反应过程,是细胞的一种保护性应激行为。ERS主要通过激活细胞内UPR,促进内质网正常功能的恢复。在病毒感染过程中,病毒会“劫持”细胞内质网合成大量病毒蛋白,加之细胞自身蛋白合成的需求,内质网中蛋白质合成超出了细胞的正常处理范围,造成大量未折叠或者错误折叠蛋白的积聚,接着诱导ERS和激活UPR。ERS作为细胞的一种保护性应激反应,在机体抗病毒感染和调节天然免疫反应中发挥着重要的作用。本研究对ERS的产生及功能、ERS与天然免疫信号通路的交互调控以及ERS诱导的细胞凋亡等方面进行了综述,以期为进一步研究抗病毒策略提供新思路。

关键词：内质网应激天然免疫病毒细胞凋亡

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