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检测和鉴别猪瘟强弱毒的复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)的建立

中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次学术研讨会

作者：李艳仇华吉王秀荣张守发朱庆虎李娜李国新童光志延边大学农学院吉林龙井133400 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 延边大学农学院吉林龙井133400 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030

GenBank上登录的所有猪瘟病毒(classicalswinefever,CSFV)基因组全序列,选择高度保守区设计了一对通用引物P1和P4,并在该对引物跨越区域的内部设计了猪瘟兔化弱毒疫苗特异性引物P2及猪瘟强毒特异性引物P3,用引物P1/P4进行RT-PCR,然后用... 详细信息

GenBank上登录的所有猪瘟病毒(classicalswinefever,CSFV)基因组全序列,选择高度保守区设计了一对通用引物P1和P4,并在该对引物跨越区域的内部设计了猪瘟兔化弱毒疫苗特异性引物P2及猪瘟强毒特异性引物P3,用引物P1/P4进行RT-PCR,然后用引物P2/P3/P4进行复合套式PCR,建立了一种能区分猪瘟强弱毒的复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)的鉴别诊断方法.应用该方法从猪瘟兔化弱毒株和猪瘟强毒石门株基因组中扩增出了大小分别为447bp和343bp的一条特异性片段,从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为447bp和343bp的两条特异性片段,但对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(RV)、乙型脑炎病毒(JEV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)的细胞培养物以及正常细胞基因组进行复合RT-nPCR扩增时均为阴性.该方法可以检测出0.04pg的病毒RNA.对从黑龙江省采集的15份疑似猪瘟病料进行了检测,结果表明,有14份类似猪瘟强毒,1份类似猪瘟弱毒.用限制性片段长度多态性(RFLP)对15份病料、猪瘟兔化弱毒株和石门株的RT-nPCR产物进行分析,发现石门株和14份黑龙江省强毒样品的扩增产物中均能被ApaⅠ切开,而猪瘟兔化弱毒株和1份黑龙江省弱毒样品无此识别位点,但有1个BanⅡ识别位点.从14份样品中抽检7份,对NS5B基因进行种系发生分析表明,它们均接近于石门株.本研究建立的复合RT-nPCR可以有效检测猪瘟病毒感染并把强毒和弱毒区分开,有助于减少未感染的免疫猪被误杀的可能,降低经济损失.

关键词：猪瘟病毒聚合酶链式反应限制性片段长度多态性基因组序列鉴别诊断

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不同致病力禽流感病毒的细胞生长特性

不同致病力禽流感病毒的细胞生长特性

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次学术研讨会

作者：刘丽玲王秀荣陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

究用2个不同亚型的AIV感染Madin-Darbycaninekidney(MDCK)细胞,通过观察细胞病变、红细胞凝集实验、间接免疫荧光等探讨不同致病力禽流感病毒(AIV)在MDCK细胞上的生长特性;同时取这2株不同浓度(10-2～10-7)AIV在MDCK上培养72h的细胞培... 详细信息

究用2个不同亚型的AIV感染Madin-Darbycaninekidney(MDCK)细胞,通过观察细胞病变、红细胞凝集实验、间接免疫荧光等探讨不同致病力禽流感病毒(AIV)在MDCK细胞上的生长特性;同时取这2株不同浓度(10-2～10-7)AIV在MDCK上培养72h的细胞培养上清0.1mL接种于9～11日龄鸡胚尿囊腔,37℃孵育48h～72h,无菌收获尿囊液,再做红细胞凝集实验.结果显示:这2个亚型AIV感染MDCK细胞后,血凝价(HA)最高为27,表现为较低的红细胞凝集活性,高致病力禽流感病毒(HPAIV)红细胞凝集活性较低致病力禽流感病毒(LPAIV)出现的要早一些;上述2个亚型AIV的MDCK培养上清接种鸡胚48～72h后,HA较高,在25.5～210之间,而且HPAIV-A/Goose/Guangdong/1/96高于LPAIV-A/Turkey/England/N28/73.这2株AIV均可致MDCK细胞发生病变,但病变程度和病变出现的时间不同,A/Goose/Guangdong/1/96[H5N1]感染MDCK细胞后3d可见明显病变,A/Turkey/England/N28/73[H5N2]感染MDCK细胞后4～5d可见明显病变;2个亚型不同浓度(10-2～10-7)AIV的间接免疫荧光结果均为阳性.以上结果表明HPAIV和LPAIV可致MDCK细胞病变,但红细胞凝集活性较低,接种鸡胚后红细胞凝集活性显著提高.

关键词：禽流感病毒 MDCK细胞红细胞凝集活性间接免疫荧光

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检测H1～15禽流感病毒亚型的DNA芯片初步研究

检测H1～15禽流感病毒亚型的DNA芯片初步研究

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次学术研讨会

作者：王秀荣于康震刘丽玲乔传玲石锐孙凯孔宪刚陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

对流感病毒14个血凝素亚型的基因芯片检测技术进行了初步研究.通过RT-PCR克隆禽流感病毒血凝素基因片段,获得重组质粒.从重组质粒扩增大约500bp的DNA片段,浓缩后点到氨基化玻璃载体上,制成芯片.待检病毒样品用TrozolLS提取RNA,反转录过... 详细信息

对流感病毒14个血凝素亚型的基因芯片检测技术进行了初步研究.通过RT-PCR克隆禽流感病毒血凝素基因片段,获得重组质粒.从重组质粒扩增大约500bp的DNA片段,浓缩后点到氨基化玻璃载体上,制成芯片.待检病毒样品用TrozolLS提取RNA,反转录过程中用Cy5标记样品cDNAs.将标记样品与芯片杂交,扫描芯片上待检样品与芯片上捕捉探针的结合位点,杂交信号与预期设想一致.结果显示,DNA芯片技术可以提供一种有效的AIV血凝素亚型鉴别诊断方法。

关键词：禽流感病毒基因芯片检测血凝素亚型鉴定 RT-PCR 鉴别诊断

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猪圆环病毒诊断技术研究进展

猪圆环病毒诊断技术研究进展

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第二届全国现代免疫诊断技术学术研讨会

作者：全艳平张亚非崔尚金赵玉军中国农业科学院哈尔滨兽医研究所疫病诊断与流行病学中心哈尔滨150001 兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 沈阳农业大学畜牧兽医学院沈阳110161 哈尔滨市科技情报研究所哈尔滨150006 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所疫病诊断与流行病学中心哈尔滨150001 兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

猪圆环病毒(PorcineCircovirus,PCV)是1974年德国学者Tischer首次从猪肾传代细胞系PK-15中发现的一种污染病毒,由于该病毒不产生细胞病变,所以以前一直未被发现.PCV属于圆环病毒科,单链环状DNA病毒,该科还包括人TT病毒(TTV),鸡贫血病毒(... 详细信息

猪圆环病毒(PorcineCircovirus,PCV)是1974年德国学者Tischer首次从猪肾传代细胞系PK-15中发现的一种污染病毒,由于该病毒不产生细胞病变,所以以前一直未被发现.PCV属于圆环病毒科,单链环状DNA病毒,该科还包括人TT病毒(TTV),鸡贫血病毒(CAV),鹦鹉喙羽病病毒(PBFDV),地三叶草矮化病毒(SCSV)、椰树叶腐烂病毒(CFDV)和香蕉簇顶病毒(BBTV).PCV病毒粒子呈20面体对称,无囊膜,直径约为17nm,病毒DNA以滚环方式复制.PCV对外界抵抗力较强,对酸、氯仿不敏感,不能凝集动物红细胞.研究表明从PK-15细胞中分离的圆环病毒无致病性,命名为PCV1;而在一种新病--猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)中分离到了猪圆环病毒有致病性,命名为PCV2.这两种类型PCV之间有抗原部分交叉反应,两者基因组结构有显著差别,PCV1的基因组全长1759nt,PCV2基因组全长1767/1768nt,核苷酸同源性68-76﹪,而PCV2毒株之间的核苷酸同源性高于96﹪.从PCV的核苷酸序列推导出11个开放读码框,其中ORF1和ORF2是两个重要渎码框,ORF1编码病毒的复制酶,ORF2编码病毒的衣壳蛋白.本文讨论，1病毒分离，2.多重PCR(multipiexPCR)，3PCR-限制性片段长度多态性分析(PCR-restrictionfragmentlengthpolymorphism,PCR-RFLP)，4免疫组织化学试验(Immunohistochemicalaasay,IHC)，5原位杂交试验(insituhybridization,ISH)，6.酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)，7间接免疫荧光试验。

关键词：猪圆环病毒免疫诊断猪断奶后多系统衰竭综合征多重PCR 免疫组织化学酶联免疫吸附

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高致病禽流感时空分布规律研究(三)禽流感免疫与流行的生物数学模型初析

高致病禽流感时空分布规律研究(三)禽流感免疫与流行的生物数学模...

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中国畜牧兽医学会信息技术分会成立大会暨首届学术研讨会

作者：崔尚金李曦符芳王靖飞吴春燕童光志孔宪刚于康震中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物疫病诊断于流行病学中心哈尔滨150001

禽流感(AI)是由A型流感病毒引起的一种禽类的感染或疾病综合症.慢性或亚临床感染可使家禽的生产力严重下降,如增重减缓或不长,产蛋量下降等;高致病力禽流感(HPAI)可造成100﹪死亡,导致全军覆没.1983年美国禽流感和1995年墨西哥禽流感分... 详细信息

禽流感(AI)是由A型流感病毒引起的一种禽类的感染或疾病综合症.慢性或亚临床感染可使家禽的生产力严重下降,如增重减缓或不长,产蛋量下降等;高致病力禽流感(HPAI)可造成100﹪死亡,导致全军覆没.1983年美国禽流感和1995年墨西哥禽流感分别造成了相当于10亿多美元的直接经济损失.1993年我国证实鸡群中有禽流感流行,1996年又从水禽中分离出对鸡高致病力的H5和H7亚型禽流感毒株.因此,我们必须对此提高警惕,采取积极措施以防禽流感在我国的扩散与流行.本文的目的旨在探讨禽流感发生与流行的有关因素,从而为禽流感的防制找到确实可行的措施,之后对症下药,确保我国养禽业的健康发展.

关键词：禽流感时空分布免疫生物数学模型

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禽流感发生的流行病学分析

禽流感发生的流行病学分析

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中国畜牧兽医学会信息技术分会成立大会暨首届学术研讨会

作者：崔尚金李曦符芳王靖飞吴春燕童光志孔宪刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物疫病诊断于流行病学中心哈尔滨150001

2004年以来在亚洲蔓延的高致病性禽流感引起人们的强烈关注.禽流感虽然没有像2003年的SARS疫情那样明显地影响和改变我们的生活,但接连由动物引发的威胁到人类健康甚至生存的瘟疫,还是让人产生很多的联想和思索.微生物远在人类出现之前... 详细信息

2004年以来在亚洲蔓延的高致病性禽流感引起人们的强烈关注.禽流感虽然没有像2003年的SARS疫情那样明显地影响和改变我们的生活,但接连由动物引发的威胁到人类健康甚至生存的瘟疫,还是让人产生很多的联想和思索.微生物远在人类出现之前就存在于这个星球上了,也将伴随着人类生命的进化而进化,或许它在人类生命消失之后还会存在于这个星球.从一定程度上说,在地球上,面对微生物,人类更像是客人.而由于微生物对环境的适应力极强,它不会像动物或者植物那样出现某个种类的灭绝,科学的发展,也只能是尽力控制病毒.流感病毒也是如此.今次导致禽流感流行传染的原因除了周边国家发生禽流感以外,主要有如下:对禽类检疫力不够或缺少主动监测;候鸟迁徙导致疫情漫延;对已发禽流感缺乏检测和扑灭措施;人畜禽间保持密切接触.禽流感的发生和流行有其必然的因素.

关键词：禽流感流行病学畜牧兽医学禽类检疫力

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高致病禽流感时空分布规律研究(一)传播的风险评估框架的初步建立

高致病禽流感时空分布规律研究(一)传播的风险评估框架的初步建立

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中国畜牧兽医学会信息技术分会成立大会暨首届学术研讨会

作者：崔尚金王靖飞吴春燕李曦符芳童光志孔宪刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物疫病诊断于流行病学中心哈尔滨150001

为实现对高致病性禽流感传播的风险评估,以在该病的控制中制定科学有效的控制策略,本研究在分析高致病性禽流感传播风险因素的基础上,汲取各类风险分析的原则,确定了高致病性禽流感传播风险评估指标,并采用层次分析法(AHP)确定各风险因... 详细信息

为实现对高致病性禽流感传播的风险评估,以在该病的控制中制定科学有效的控制策略,本研究在分析高致病性禽流感传播风险因素的基础上,汲取各类风险分析的原则,确定了高致病性禽流感传播风险评估指标,并采用层次分析法(AHP)确定各风险因素的权重,结合多指标综合评价函数,建立了包括评估指标体系、指标评价标准、指标权重、综合评分和数据采集五个方面的高致病性禽流感传播风险评估框架.

关键词：高致病性禽流感风险因素风险评估框架层次分析法权重多指标综合评价法

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高致病禽流感时空分布规律研究(二)温度对我国禽流感传播影响的时空模式分析

高致病禽流感时空分布规律研究(二)温度对我国禽流感传播影响的时...

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中国畜牧兽医学会信息技术分会成立大会暨首届学术研讨会

为研究温度对禽流感传播的影响,本文根据禽流感传播最适温度6-16℃确立了风险分析标准,以中国各个气象站的各月平均气温为基础数据,运用本实验室二次开发的地理信息系统软件绘制了风险图.研究结果显示风险区域随时间变化而转移,其时空... 详细信息

为研究温度对禽流感传播的影响,本文根据禽流感传播最适温度6-16℃确立了风险分析标准,以中国各个气象站的各月平均气温为基础数据,运用本实验室二次开发的地理信息系统软件绘制了风险图.研究结果显示风险区域随时间变化而转移,其时空模式为:1-5月,风险区域从南向北迁移;6-8月,除青藏高原外,全国基本处于低风险;9-12月,从北向南迁移.其时空转移规律与2004年第一季度的禽流感疫情扩散趋势基本吻合.

关键词：禽流感风险评估 GIS 时空模式

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鸡传染性支气管炎病毒SY毒株生物学特性及其S1基因分子遗传变异分析

鸡传染性支气管炎病毒SY毒株生物学特性及其S1基因分子遗传变异分...

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辽宁省第二届学术年会暨第五届青年学术年会

作者：刘明春江国托康丽娟刘思国赵玉军沈阳农业大学畜牧兽医学院 110161 大连三仪生物工程研究所 116000 大连市畜牧兽医技术服务中心 116013 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室 150001

本文通过生物学特性研究,验证了分离自沈阳地区的SY毒株确实为一株鸡传染性支气管炎病毒,病毒中和试验表明其血清型不同于参考毒株T、H52、M41及国内其他流行株如HD、HB、DB等.S1基因序列分析表明,其核苷酸序列段推导的氨基酸序列与参... 详细信息

本文通过生物学特性研究,验证了分离自沈阳地区的SY毒株确实为一株鸡传染性支气管炎病毒,病毒中和试验表明其血清型不同于参考毒株T、H52、M41及国内其他流行株如HD、HB、DB等.S1基因序列分析表明,其核苷酸序列段推导的氨基酸序列与参考毒株Beau、M41、H120、NI-62、Gray、6/82、Ark99等毒株的同源百分率都低于80﹪,进化关系与各参考毒株也相距甚远,糖基化位点出现3个新位点,氨基酸疏水性区域也存在差异.

关键词：鸡支气管炎病毒生物学特性 S1基因序列分析

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伪狂犬病病毒gE基因主要抗原表位区的原核表达及其在疫苗接种和自然感染鉴别诊断中的应用

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生物工程学报 2004年第4期20卷 526-531页

作者：倪健强张春玲童光志仇华吉王云峰田志军中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

根据伪狂犬病病毒 (PRV)Min A株gE基因序列 ,利用PCR方法扩增了PRVgE基因不含信号肽、胞内区和跨膜区的主要抗原表位区 ,并克隆到原核表达载体pGEX 6p 1中 ,获得的重组质粒命名为pGEX tgE。经SDS PAGE电泳分析证实克隆的部分gE基因获得... 详细信息

根据伪狂犬病病毒 (PRV)Min A株gE基因序列 ,利用PCR方法扩增了PRVgE基因不含信号肽、胞内区和跨膜区的主要抗原表位区 ,并克隆到原核表达载体pGEX 6p 1中 ,获得的重组质粒命名为pGEX tgE。经SDS PAGE电泳分析证实克隆的部分gE基因获得了表达 ,融合表达产物大小约为 6 3kD ,并在终浓度为 0 6mmol L的IPTG诱导下 ,3 5h其表达量达到高峰。通过改变诱导条件 ,有效抑制了包涵体形成 ,提高了重组蛋白的溶解性。Westernblot分析证实表达的重组gE蛋白具有抗原反应活性。将表达产物利用亲和层析法纯化后作为ELISA抗原 ,通过对其特异性、敏感性及工作条件的优化试验 ,和对 4 8份PRV阴性血清样品的检测结果的统计学分析 ,建立了猪伪狂犬病tgE ELISA鉴别诊断方法。通过对 4 0 0份送检血清样品的检测结果分析 ,表明其与PRV全病毒ELISA试验的符合率高达 95 %以上 ,与基于抗gE蛋白单抗竞争性ELISA的符合率达 94 %。

关键词： PRV gE 鉴别诊断

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