检索结果-内蒙古大学图书馆

中国与美国RFLP 1-4-4 lineage1C变异株同一分支PRRSV的全基因组序列分析

中国预防兽医学报 2022年第2期44卷 202-207页

作者：许浒李超相丽润汤艳东赵静龚帮俊李宛生付军彭金美王倩周国辉冷超粮安同庆蔡雪辉张洪亮田志军中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 南阳师范学院河南南阳473061

2020年美国报道了高致病性的RFLP 1-4-4 lineage 1C PRRSV变异株,其对猪的致死率达到17.5%。为了分析美国1-4-4 lineage1C PRRSV变异株与中国当前流行的PRRSV的关系,本研究对中国不同基因亚型的PRRSV与美国新发1-4-4 lineage1C PRRSV变... 详细信息

2020年美国报道了高致病性的RFLP 1-4-4 lineage 1C PRRSV变异株,其对猪的致死率达到17.5%。为了分析美国1-4-4 lineage1C PRRSV变异株与中国当前流行的PRRSV的关系,本研究对中国不同基因亚型的PRRSV与美国新发1-4-4 lineage1C PRRSV变异株进行遗传演化分析,结果显示,中国类NADC34 PRRSV与美国RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV变异株关系密切;其Nsp2推导氨基酸序列比对结果显示,中国类NADC34 PRRSV与美国RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV变异株在Nsp2区域存在相同的分子特征,即100个氨基酸(aa328~aa427)的连续缺失。PRRSV基因重组分析结果显示,美国RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV变异株是以类NADC34 IA14737-2016株为母本毒株,并由IA/2014/NADC34和NADC30病毒株提供重组基因片段的重组病毒,而中国早期的类NADC34 PRRSV是以IA/2014/NADC34株为母本毒株的重组病毒。美国早期的类NADC34 PRRSV对仔猪的致病力差异较大,而中国早期的类NADC34 PRRSV对仔猪多为中、低致病力。此外,中国HLJZD22-1812株与美国RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV变异株具有类似的重组模式、相同的Nsp2缺失特征、相同的1-4-4 ORF5限制性片段长度多态性(RFLP)模式,且均属于lineage1C分支。本研究结果首次表明美国RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV变异株与中国类NADC34(PRRSV)属于同一亚型分支,且具有一致的分子特征,提示类NADC34 PRRSV在我国的流行及演化情况需高度关注。

关键词： 1-4-4 PRRSV变异株类NADC34 PRRSV 100个氨基酸缺失重组病毒

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TRIM74对流感病毒复制机制影响的研究

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中国预防兽医学报 2022年第10期44卷 1025-1033页

作者：叶苗苗孙楠李奇兵石文军王波王广文姜丽陈化兰李呈军中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、兽医生物技术国家重点实验室/农业农村部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

为探究三方基序蛋白74(TRIM74)对流感病毒复制的影响,本研究设计并合成靶向TRIM74基因的siRNA,即siTRIM74-331,将其转染A549细胞后,利用荧光定量PCR检测siTRIM74-331对细胞中TRIM74转录水平的干扰效率,利用细胞活力检测试剂盒检测该siRN... 详细信息

为探究三方基序蛋白74(TRIM74)对流感病毒复制的影响,本研究设计并合成靶向TRIM74基因的siRNA,即siTRIM74-331,将其转染A549细胞后,利用荧光定量PCR检测siTRIM74-331对细胞中TRIM74转录水平的干扰效率,利用细胞活力检测试剂盒检测该siRNA对细胞活力的影响。结果表明siTRIM74-331的干扰效率较好且不影响细胞活力。将siTRIM74-331转染A549细胞后感染禽流感病毒(AIV)A/WSN/1933株(WSN),并于感染后24 h、48 h分别进行噬斑滴定,结果显示干扰TRIM74的表达可抑制流感病毒的复制。利用慢病毒包装系统构建TRIM74过表达细胞系(A549-pLVX-TRIM74)和对照细胞系(A549-pLVX),并经qPCR及western blot鉴定正确后,将WSN株(MOI 0.01)分别感染上述两种细胞,并于感染后24 h、48 h收集细胞上清分别进行噬斑滴定。结果表明,过表达TRIM74能够显著促进流感病毒的复制。将WSN株(MOI 5)分别感染A549细胞和HEK293T细胞后,分别采用qPCR和western blot检测细胞中内源TRIM74的转录及蛋白表达水平,结果表明WSN能够刺激细胞内源TRIM74的转录与表达,推测宿主细胞可能通过增强TRIM74的表达响应流感病毒的感染。为探究TRIM74在宿主细胞天然免疫反应中发挥的作用,将不同剂量的表达质粒pTRIM74-V5转染HEK293T细胞,经western blot确定其能够在细胞中呈剂量依赖性表达后,将上述剂量的p TRIM74-V5与p RL-TK、pIFN-β-Luc报告质粒共转染HEK293T细胞(1组);同时将上述剂量的pTRIM74-V5与p RL-TK、pISRE-Luc报告质粒共转染HEK293T(2组),24 h后感染仙台病毒(SeV),12 h后采用双荧光素酶试验检测过表达TRIM74对IFN-β和ISRE启动子活性的影响。结果显示,转染空载体的对照细胞在感染SeV后上述两种启动子的活性均升高,而1组和2组细胞中该两种启动子的活性均极显著下降,且随pTRIM74-V5转染量的升高二者的活性均呈下降趋势。分别将SeV和poly(I:C)刺激TRIM74过表达及干扰其表达的HEK293T细胞,12 h后采用q PCR分别检测各组细胞中IFN-β和ISG56 mRNA的转录水平。结果显示,TRIM74过表达的各组细胞中IFN-β及ISG56 mRNA的转录水平均显著高于未刺激的Mock组细胞,且均极显著低于转染空载体的阴性对照细胞;干扰TRIM74表达的各组细胞中IFN-β及ISG56 mRNA的转录水平均显著高于未刺激的Mock组细胞,且均极显著或者显著高于转染NC siRNA的阴性对照细胞,表明TRIM74能够负调控细胞中相应干扰素的分泌。本研究结果首次表明TRIM74能够促进流感病毒的复制,并负调控宿主细胞中IFN-β信号通路,该研究丰富了流感病毒与宿主因子间的调控网络,为深入了解TRIM74蛋白的功能奠定了实验基础。

关键词： TRIM74 流感病毒干扰素

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野鸟源H8N2亚型禽流感病毒的生物学特性分析

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中国预防兽医学报 2022年第6期44卷 577-582页

作者：田井满李明慧白晓利李玉磊刘丽娜李雁冰陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

本研究团队于2019年在常规主动监测野鸟源禽流感病毒(AIV)时,于山东省荣成市分离到一株H8N2亚型AIV,为了解该株H8N2亚型AIV的生物学特性,本研究对其全基因组进行了测序及遗传演化分析。结果显示,该病毒HA和NA基因分别来自鸭源H8N4和H9N... 详细信息

本研究团队于2019年在常规主动监测野鸟源禽流感病毒(AIV)时,于山东省荣成市分离到一株H8N2亚型AIV,为了解该株H8N2亚型AIV的生物学特性,本研究对其全基因组进行了测序及遗传演化分析。结果显示,该病毒HA和NA基因分别来自鸭源H8N4和H9N2亚型AIV,其部分内部基因来源于野鸟源AIV,而且该H8N2亚型AIV的PB2基因起源于北美,表明该H8N2亚型AIV是一株跨大陆、跨物种、多亚型的重组AIV。关键氨基酸位点分析显示,其HA蛋白碱性裂解位点氨基酸序列为SIEPK/GLF,为低致病AIV分子标志;PB1蛋白出现D622G突变,NS1蛋白存在P^(42)S、I^(106)M、C^(138)F突变,提示其具有增强对哺乳动物致病性的潜在能力。采用该H8N2亚型AIV感染SPF鸡后采集各脏器及拭子样品,接种鸡胚后通过病毒滴定试验检测,结果显示,该病毒不能通过SPF鸡的喉头或泄殖腔排毒,且在感染鸡各脏器中均未检测到该病毒的有效复制。进一步采用该病毒感染BALB/c小鼠后观察临床症状,并采集各脏器后利用普通鸡胚进行脏器病毒滴定试验,结果显示,小鼠感染病毒后无明显临床症状和体质量下降。该H8N2亚型AIV虽不致死小鼠,但在其肺脏、鼻甲、肾脏以及脾脏均可有效复制。本研究对该H8N2亚型AIV的部分生物学特性进行了探究,为H8N2亚型AI的综合防控提供参考依据。

关键词：禽流感病毒 H8N2 野鸟跨大陆重组跨种感染

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一株新型重配H9N8亚型禽流感病毒的分子进化分析及其对小鼠的感染性研究

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中国预防兽医学报 2022年第7期44卷 691-696页

作者：颜成崔鹏飞邢鑫谷文丽张元成衡武昌王丛丛邓国华陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业农村部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

2020年5月,本实验室在对禽流感常规监测时从广西一鸭场分离到一株H9N8亚型禽流感病毒(AIV),命名为A/duck/Guangxi/S10590/2020(H9N8)(简称DK/GX/S10590/2020)。为了解该H9N8分离株的生物学特性和公共卫生风险,本研究对其进行了全基因组... 详细信息

2020年5月,本实验室在对禽流感常规监测时从广西一鸭场分离到一株H9N8亚型禽流感病毒(AIV),命名为A/duck/Guangxi/S10590/2020(H9N8)(简称DK/GX/S10590/2020)。为了解该H9N8分离株的生物学特性和公共卫生风险,本研究对其进行了全基因组序列及遗传演化分析,并采用贝叶斯端点定年法进行进化分析;进一步以小鼠为动物模型,评价该AIV对哺乳动物的感染性。全基因组序列经BLAST比对,结果显示,该病毒株与H1N1、H3N8、H4N8、H6N1、H7N3、H7N7和H9N2等多种亚型野鸟源低致病性AIV(LPAIV)具有较高同源性,提示其可能是由多种LPAIV在病毒传播过程中经过复杂重配而形成。遗传演化及贝叶斯进化分析结果显示,该病毒可能在2018年末重配产生,后由东亚-澳大利西亚迁徙线上的野鸟引入广西鸭群。特殊氨基酸位点分析结果显示,该病毒HA蛋白裂解位点为PAASNR/GL,仅含有一个碱性氨基酸,且其HA蛋白具有T分子特征,进一步表明该AIV为LPAIV,且具有结合人型唾液酸受体的潜在能力;此外,在内部基因表达蛋白中发现了PB1蛋白的LP、PB1-F2蛋白的LS、PA蛋白的KE和VD、NP蛋白的VM和KQ、以及M1蛋白的HY和AV等多个可增强H9亚型AIV对鸡或哺乳动物组织嗜性的突变,表明该病毒株具有潜在感染鸡和哺乳动物的风险。小鼠感染性试验结果显示,该病毒仅在小鼠鼻甲中低水平复制,对小鼠呈低致病力。本研究为H9亚型AIV的监测和流行病学评估提供了数据支持。

关键词：禽流感病毒 H9N8 重配感染性

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宿主因子KRT2影响A型流感病毒复制的研究

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中国预防兽医学报 2022年第3期44卷 237-242页

作者：王一涵石文军李奇兵胡玉珍赵玉辉王广文严娅姜丽陈化兰李呈军中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业农村部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

本实验室前期通过质谱分析筛选到宿主因子II型角蛋白2(KRT2),推测其可能与流感病毒复制相关。为进一步研究KRT2对流感病毒复制的影响,本研究将真核表达质粒pCAGGS-KRT2-Myc转染至HEK293T细胞24 h后,感染A/WSN/1933(H1N1)株病毒,采用噬... 详细信息

本实验室前期通过质谱分析筛选到宿主因子II型角蛋白2(KRT2),推测其可能与流感病毒复制相关。为进一步研究KRT2对流感病毒复制的影响,本研究将真核表达质粒pCAGGS-KRT2-Myc转染至HEK293T细胞24 h后,感染A/WSN/1933(H1N1)株病毒,采用噬斑滴定、western blot及激光共聚焦技术检测过表达KTR2蛋白对流感病毒复制影响,结果显示,过表达KRT2蛋白后流感病毒滴度和NP蛋白表达均下降;激光共聚焦试验检测结果显示,过表达KRT2蛋白后,流感病毒复制早期NP蛋白向细胞核内的聚积受到了抑制。针对KRT2基因设计特异性siRNA-1/2,转染A549细胞后采用细胞活力检测试剂盒检测下调KRT2蛋白表达后对A549细胞活力影响,进一步利用荧光定量PCR方法检测干扰效率,筛选最佳siRNA,结果显示,与对照siRNA相比,KRT2特异性siRNA处理不影响A549细胞活力,且siRNA-2能更有效降低KRT2的表达。以A/WSN/1933(H1N1)株病毒感染siRNA-2转染后的A549细胞,采用噬斑滴定、western blot及激光共聚焦技术检测siRNA-2干扰下调KTR2蛋白表达对流感病毒复制影响,上述试验结果均显示,KRT2表达下调后病毒滴度和NP蛋白表达均显著提高;激光共聚焦试验结果显示,下调KRT2蛋白表达后,流感病毒在复制早期阶段受到了抑制。本研究结果首次表明,KRT2是一种负调控流感病毒复制的宿主因子。本研究丰富了流感病毒与宿主因子互作的网络,也深化了对宿主因子影响流感病毒复制机制的认知。

关键词：角蛋白2 流感病毒病毒复制

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欧亚类禽H1N1猪流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2022年第9期44卷 946-951,976页

作者：王飞飞黄凯伦宋祖晨刘雅茹张丹丹杨焕良乔传玲陈化兰陈艳中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业农村部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

为建立一种快速检测欧亚类禽H1N1猪流感病毒(EA H1N1 SIV)抗体的检测方法,本研究以EA H1N1 SIV代表株A/Swine/Liaoning/445/2018(LN445)灭活的全病毒免疫BALB/c小鼠,通过HI试验筛选得到7株HA蛋白单克隆抗体(MAb),分别命名为1B3、2B12、... 详细信息

为建立一种快速检测欧亚类禽H1N1猪流感病毒(EA H1N1 SIV)抗体的检测方法,本研究以EA H1N1 SIV代表株A/Swine/Liaoning/445/2018(LN445)灭活的全病毒免疫BALB/c小鼠,通过HI试验筛选得到7株HA蛋白单克隆抗体(MAb),分别命名为1B3、2B12、2E1、3B4、3F6、3G5、3H12。抗体亚类鉴定结果显示,HA蛋白MAb除3B4重链为IgG1之外,其余均为IgG2a,7株MAb轻链均为κ链。间接免疫荧光试验结果显示,7株HA蛋白MAb均可以与EA H1N1 SIV发生特异性反应。采用纯化的EA H1N1 SIV(LN445)灭活全病毒作为包被抗原,以EA H1N1 SIV SPF猪阳性血清作为待检血清,选取HA蛋白MAb 2B12作为竞争抗体,经条件优化后初步建立了检测EA H1N1 SIV抗体的竞争ELISA方法。特异性试验结果显示EA H1N1 SIV的阳性血清对2B12 MAb具有良好的阻断作用,而甲型H1N1 SIV、H3N2 SIV、猪圆环病毒2型(PCV2)、轮状病毒(RV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)和肠致病性大肠杆菌(EPEC)阳性血清对其均无阻断作用,表明该方法的特异性较强;敏感性试验结果显示,该方法对HI效价为1:10的EA H1N1 SIV阳性血清检测仍为阳性结果,敏感性较高;重复性试验结果显示,该方法批内、批间变异系数均小于10%,重复性较好。利用本研究建立的竞争ELISA方法与GB/T 27535-2011猪流感HI抗体检测方法同时对100份临床猪血清样品进行检测,结果显示该方法与国标HI检测方法总体符合率为81%,表明该方法的准确性较高。本研究为EA H1N1 SIV抗体检测和流行病学调查提供了有效的检测手段。

关键词：欧亚类禽H1N1 猪流感病毒单克隆抗体竞争ELISA方法

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猪链球菌细菌素基因膜接合转移的研究

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中国预防兽医学报 2022年第5期44卷 465-470,507页

作者：王凌利杨亲祝瑶杨文琳曹俊刘思国张万江中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150069

为研究猪链球菌细菌素基因能否在同种和不同种属之间转移,本研究对供体菌xj-144的红霉素耐药基因ermB和四环素耐药基因tetO进行PCR鉴定,然后以携带猪链球菌细菌素基因的菌株xj-144为供体菌,分别以猪链球菌BAA和粪肠球菌JH2-2株为受体菌... 详细信息

为研究猪链球菌细菌素基因能否在同种和不同种属之间转移,本研究对供体菌xj-144的红霉素耐药基因ermB和四环素耐药基因tetO进行PCR鉴定,然后以携带猪链球菌细菌素基因的菌株xj-144为供体菌,分别以猪链球菌BAA和粪肠球菌JH2-2株为受体菌进行膜接合转移试验,并对接合子进行PCR检测,对经检测正确的接合子进行药敏试验,同时对接合子的细菌素基因簇和供体菌的可移动遗传元件经PCR鉴定,并对整合性接合元件进行基因序列分析。结果显示,供体菌xj-144携带红霉素耐药基因ermB和四环素耐药基因tetO,与受体菌BAA和JH2-2株分别进行滤膜接合转移试验后正确获得了接合子BM-1和JM-1,接合效率分别为8×10;和8×10^(-7)。药敏试验结果显示,供体菌xj-144对红霉素和四环素耐药,受体菌BAA和JH2-2株对红霉素和四环素均敏感,接合子BM-1和JM-1均对红霉素和四环素耐药。且接合子经PCR均扩增出了猪链球菌细菌素的suicin65基因簇;同时,从供体菌和接合子中均经PCR扩增到转座子整合酶int基因;序列分析结果显示,细菌素基因簇与耐药基因ermB、tetO共定位于一个新的整合性接合元件ICESsuxj-144中。上述结果首次证实了猪链球菌细菌素基因可以跨种属水平转移,并且该基因的水平转移与转座子有密切关系,本研究为进一步探究细菌素基因的转移提供了参考依据。

关键词：猪链球菌细菌素接合转移基因水平转移转座子

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马传染性贫血病毒弱毒疫苗致弱及免疫保护机制研究进展

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生命科学 2021年第1期33卷 26-35页

作者：王雪峰张相敏林跃智杜承王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069

马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus, EIAV)弱毒疫苗是中国科学家在20世纪70年代研制成功的世界上首例慢病毒疫苗,是迄今为止唯一在临床大规模应用的慢病毒弱毒疫苗。EIAV弱毒疫苗的成功应用不仅消除了该疫病对马业的威胁... 详细信息

马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus, EIAV)弱毒疫苗是中国科学家在20世纪70年代研制成功的世界上首例慢病毒疫苗,是迄今为止唯一在临床大规模应用的慢病毒弱毒疫苗。EIAV弱毒疫苗的成功应用不仅消除了该疫病对马业的威胁,而且在学术上突破了慢病毒不能免疫的理论。该疫苗克服了灭活疫苗免疫原性差的难点,能有效地提供对同源和异源毒株的免疫保护。因此,在分子水平上阐明EIAV弱毒疫苗的减毒机理和免疫保护机制对于研究慢病毒免疫保护具有极其重要的科学意义。作者所在的研究团队多年来一直从事EIAV弱毒疫苗的致弱机理及其诱导免疫保护机制的研究,解析了EIAV弱毒疫苗及其强毒株的基因组进化特征、揭示了疫苗致弱规律和疫苗有效组成、提出了"EIAV弱毒疫苗可能起源于EIAV准种的一个小分支"的假说;发现EIAV弱毒疫苗可有效激活天然免疫和特异性免疫,早期诱导的高水平细胞免疫与免疫保护呈正相关;证明了疫苗株的抗原多样性组成是其诱导保护性免疫应答的关键因素。相关研究成果拓展了慢病毒疫苗研究理论和实践认知,可为其他慢病毒尤其是HIV-1免疫原的设计以及免疫保护理论提供有价值的参考。

关键词：马传染性贫血病毒疫苗慢病毒免疫准种

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猪链球菌细菌素的筛选及理化特性分析

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中国预防兽医学报 2022年第4期44卷 363-368,376页

作者：王凌利杨亲祝瑶杨文琳曹俊刘思国张万江中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150069

为研究猪链球菌(SS)产生的细菌素,本研究以不同省份分离到的200株SS为研究对象,采用琼脂扩散法筛选具有抑菌作用的菌株;通过CGE网站进行ST型分型,利用PCR方法进行血清型分型;选出的菌株利用PCR方法检测细菌素相关基因;然后用BAGEL4对细... 详细信息

为研究猪链球菌(SS)产生的细菌素,本研究以不同省份分离到的200株SS为研究对象,采用琼脂扩散法筛选具有抑菌作用的菌株;通过CGE网站进行ST型分型,利用PCR方法进行血清型分型;选出的菌株利用PCR方法检测细菌素相关基因;然后用BAGEL4对细菌素相关基因进行全序列基因功能分析,同时采用PCR分段扩增其基因簇;并分析SS所产细菌素的理化特性。结果显示,从200株SS中筛选出了21株可产生抑菌物质的SS,它们分布于不同的ST型和血清型。其中菌株xj-144和38-3携带SS细菌素编码基因sss基因和suiA基因,经BAGEL4分析菌株xj-144仅存在一个与suicin 65核心肽相同的细菌素,并无其他潜在细菌素,其完整的基因簇含有10个ORFs,产生的细菌素排除有机酸、过氧化氢干扰后,其粗提取液具有一定的耐热性、酸碱耐受性和蛋白酶稳定性,并对部分病原菌具有抑菌作用。本研究为进一步研究SS细菌素奠定了一定的基础,为实现细菌素替代传统抗生素提供了科学参考。

关键词：细菌素猪链球菌羊毛硫细菌素基因簇

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利用sacB基因反向筛选法构建GFP分别融合于猪链球菌MapZ及PBP1b蛋白的融合菌株

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中国预防兽医学报 2022年第11期44卷 1149-1155页

作者：卫东陈平高广娟朱金鲁武柳君刘思国张跃灵中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150069

为在猪链球菌(***)中引入高效的反向筛选标记,本研究根据***密码子偏好性优化了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)蔗糖果聚糖酶基因sacB的密码子,并由公司合成后作为模板,采用PCR扩增sacB基因片段;采用PCR从相应模板中分别扩增***中的启... 详细信息

为在猪链球菌(***)中引入高效的反向筛选标记,本研究根据***密码子偏好性优化了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)蔗糖果聚糖酶基因sacB的密码子,并由公司合成后作为模板,采用PCR扩增sacB基因片段;采用PCR从相应模板中分别扩增***中的启动子序列(Peno)及含壮观霉素抗性基因(spc)的片段;再经重叠延伸PCR扩增融合基因片段Peno-sacB-spc(PSS)。以相应模板及引物分别经PCR扩增*** mapZ基因待融合位点上下游序列UP1和DN1及其pbp1b基因待融合位点上下游序列UP2和DN2、含正/反向筛选标记的片段PSS1和PSS2基因片段,以及用于替换PSS片段的绿色荧光蛋白(GFP)gfp1和gfp2基因片段;再分别通过重叠延伸PCR扩增构建中间菌株的融合片段UP1-PSS1-DN1、UP2-PSS2-DN2以及构建GFP融合菌株的融合片段UP1-GFP1-DN1、UP2-GFP2-DN2。采用同源重组的方法将UP1-PSS1-DN1和UP2-PSS2-DN2分别转化*** 05ZYH33菌株,经壮观霉素筛选引入PSS的中间菌株。PCR及测序鉴定结果表明获得了引入PSS片段的中间菌株PSS-mapZ和PSS-pbp1b。将WT、PSS-mapZ和PSS-pbp1b分别培养于含不同浓度蔗糖(10%、7.5%、5%和2.5%)的TSAS平板上,确定WT生长而PSS-mapZ和PSS-pbp1b中间菌株不生长的蔗糖浓度(用于筛选及构建GFP融合菌株)。通过比较分析最终确定反向筛选GFP融合菌株的最适蔗糖浓度约为7%。通过同源重组的方法分别将UP1-GFP1-DN1片段转化PSS-mapZ菌株、UP2-GFP2-DN2片段转化PSS-pbp1b菌株,分别经含7%蔗糖(生长)及含壮观霉素(不生长)的TSAS平板筛选。随机选择经筛选获得的100个单菌落计算筛选的阳性率。各取6个单菌落经PCR及测序鉴定。结果显示,筛选菌株的阳性率在52%~75%。PCR及测序结果显示,获得的两种重组菌株中的gfp基因片段确实分别替换了PSS-mapZ和PSS-pbp1b中的相应PSS,表明正确构建了融合GFP的重组菌株GFP-mapZ和GFPpbp1b。本研究首次构建了高效的正/反向筛选标记PSS,以及无痕的*** GFP-mapZ和GFP-pbp1b融合菌株,为快速无痕的***遗传操作及深入研究***相关分子机制奠定了基础。

关键词：猪链球菌无痕突变 sacB基因反向筛选标记

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