检索结果-内蒙古大学图书馆

中国兽医科学 2022年第3期52卷 292-297页

作者：于志亚杨鸣发马云云康洪涛姜骞刘家森李广兴曲连东东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为建立快速、灵敏的发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)检测方法,根据GenBank中发热伴血小板减少综合征病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)基因的保守序列设计引物和探针。通过对反应体系和反应条件的优化,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR检... 详细信息

为建立快速、灵敏的发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)检测方法,根据GenBank中发热伴血小板减少综合征病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)基因的保守序列设计引物和探针。通过对反应体系和反应条件的优化,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法。当质粒标准品浓度为4.22×10^(2)~4.22×10^(9)copies/μL时,荧光定量标准曲线C;值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数可达0.9998。该方法对发热伴血小板减少综合征病毒最低检测限为4.22×10^(1)copies/μL,灵敏度是常规RT-PCR方法的100倍;该方法可特异性地检测出SFTSV,而对同科其他病毒检测结果均为阴性;批内、批间变异系数均小于2%。对采集的200只蜱进行检测,阳性检出率为3.5%,而常规RT-PCR方法的阳性检出率为2%。研究结果表明,本研究建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、灵敏性高、重复性好,为发热伴血小板减少综合征的检测提供了技术手段。

关键词：发热伴血小板减少综合征病毒 TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR

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副结核分枝杆菌胞外GDSL脂肪酶MAP_2739的酶学特性研究

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中国预防兽医学报 2023年第4期45卷 331-338页

作者：王建国陈凡若鹿萍臧鑫鑫党光辉姜艳艳崔宁冯婷婷张嘉俊王慧崔莹莹崔子寅刘思国黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 辽宁中医药大学辽宁沈阳110847

本实验室前期研究发现了未见报道的副结核分枝杆菌(MAP)GDSL脂肪酶家族蛋白MAP_2739。为进一步分析MAP_2739的酶学特性,本实验利用生物信息学网站和软件对MAP_2739保守结构域、二级结构、3D同源建模等分析,进一步确认其属于GDSL脂肪酶... 详细信息

本实验室前期研究发现了未见报道的副结核分枝杆菌(MAP)GDSL脂肪酶家族蛋白MAP_2739。为进一步分析MAP_2739的酶学特性,本实验利用生物信息学网站和软件对MAP_2739保守结构域、二级结构、3D同源建模等分析,进一步确认其属于GDSL脂肪酶家族蛋白。以MAP参考株基因组DNA为模板,PCR扩增获得map_2739目的基因约891 bp,克隆于表达载体pET-22b中,构建重组质粒pET-22b-map_2739,转化大肠杆菌感受态细胞,经IPTG诱导表达、蛋白复性、Ni-TNA柱亲和层析纯化后,利用SDS-PAGE分析目的蛋白的表达及纯化效果,并通过western blot鉴定。结果显示,获得了以包涵体形式表达的经复性的纯化重组MAP_2739蛋白(rMAP_2739)。利用该蛋白制备兔多克隆抗体,通过ELISA方法检测,多抗血清效价为1∶51200。经差速离心法分离MAP参考株组分,利用该多克隆抗体为一抗,通过western blot检测,结果显示在细胞壁、细胞膜和细胞浆均出现35 ku的特异性条带,表明MAP_2739为胞外蛋白。以对硝基苯基酯(p-NPs)为底物进行酶活测定,结果显示MAP_2739蛋白为脂肪酶,可水解短链和长链脂肪酸,其最适酶反应pH值为9.0,且rMAP_2739蛋白经巴氏消毒法预处理后,仍具有脂肪酶活性。以重组质粒pET-22b-map_2739为模板,利用各定点突变引物,经PCR扩增各突变的map_2739基因,并测序后转化大肠杆菌感受态细胞,通过western blot鉴定蛋白表达及纯化情况,并进行了酶活测定分析,结果显示获得各定点突变纯化蛋白,确定S46和D204为MAP_2739的酶活性位点。综上所述,本研究首次证明MAP_2739是MAP胞外GDSL脂肪酶,该结果为进一步研究其在MAP致病中的作用机制奠定了基础。

关键词：副结核分枝杆菌 GDSL脂肪酶 MAP_2739 酶学特性

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兔源多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌多重PCR检测方法的建立

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实验动物科学 2023年第4期40卷 10-16页

作者：张贺陶坤盛陈见兴王豪杰陈洪岩王玉娥夏长友中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室实验动物与比较医学创新团队哈尔滨150069

目的建立兔源多杀性巴氏杆菌(Pm)、金黄色葡萄球菌(Sa)和肺炎克雷伯菌(Kp)的多重PCR方法。方法本研究参考Pm kmt1基因、Sa nuc基因和Kp kh1基因的保守区域,设计3对特异性引物,以温度梯度PCR法确定最适退火温度(Tm),采用控制单一变量法... 详细信息

目的建立兔源多杀性巴氏杆菌(Pm)、金黄色葡萄球菌(Sa)和肺炎克雷伯菌(Kp)的多重PCR方法。方法本研究参考Pm kmt1基因、Sa nuc基因和Kp kh1基因的保守区域,设计3对特异性引物,以温度梯度PCR法确定最适退火温度(Tm),采用控制单一变量法优化引物浓度,构建kmt1、nuc和kh1基因的重组质粒标准品pMDPm、pMD-Sa和pMD-Kp,确定最小检测量;以兔源支气管败血波氏杆菌和产气荚膜梭菌等9种病原体核酸样本确定多重PCR法的特异性;通过批间和批内实验验证其重复性;经检测疑似感染的临床样本与已报道的检测方法进行比较,评估其临床应用效果。结果最适退火温度为54.5℃;扩增kmt1和nuc基因的引物最适浓度均为1μL(10μmol/L),扩增kh1基因的引物最适浓度为0.5μL(10μmol/L);pMD-Pm最低检测限为20.6 copies/μL,pMDSa最低检测限为18.2 copies/μL,pMD-Kp最低检测限为23.2 copies/μL,表明其灵敏性高;该方法仅对Pm、Sa和Kp有特异性扩增条带,对其他病原体均无扩增条带,表明特异性较强;批间和批内检测结果一致,表明重复性较好;经临床样本检测Pm、Sa和Kp单独的阳性率分别为62.92%、25.84%和49.43%,与已报道的检测方法结果一致。结论本研究成功建立了一种能够同时快速检测兔源多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的多重PCR方法。

关键词：多杀性巴氏杆菌金黄色葡萄球菌肺炎克雷伯菌多重PCR

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猫疱疹病毒ERA-LFD检测技术的建立与应用

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中国兽医科学 2022年第1期52卷 11-18页

作者：刘迪许鑫燕郑亚婷杨育鹏康洪涛姜骞杨鸣发刘家森曲连东中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

为建立一种快速检测猫疱疹病毒(FHV)的酶促恒温扩增-横向流动试纸条(ERA-LFD)方法,根据GenBank上FHV TK基因保守区域序列,设计多对ERA特异性引物用于筛选最佳引物对及探针,以现场快速检测FHV。灵敏性试验表明,该方法的检测限为7.86×... 详细信息

为建立一种快速检测猫疱疹病毒(FHV)的酶促恒温扩增-横向流动试纸条(ERA-LFD)方法,根据GenBank上FHV TK基因保守区域序列,设计多对ERA特异性引物用于筛选最佳引物对及探针,以现场快速检测FHV。灵敏性试验表明,该方法的检测限为7.86×10^(1)copies/μL,比普通PCR的检测下限高10倍,与实时荧光定量PCR方法的检测限相当。特异性试验表明,该检测方法与猫细小病毒、猫杯状病毒、猫传染性腹膜炎病毒等无交叉反应。重复性试验表明,组内的变异系数在1.15%~4.76%之间,组间变异系数在2.09%~2.66%之间,均小于5%。对30份临床样品进行检测,该方法的阳性检出数为6,包含用普通PCR方法的检出的5份阳性病料。对临床检测为阳性的ERA扩增产物进行测序,BLAST对比结果证实为FHV毒株。综上所述,建立的ERA-LFD方法可用于猫疱疹病毒的快速检测及流行病学调查。

关键词：猫疱疹病毒 ERA-LFD 快速检测

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牛冠状病毒N蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

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中国动物传染病学报 2024年第6期32卷 120-127页

作者：梁彤曹存王芳姜志刚于德斌徐晓静崔久辉贾斌尹鑫常继涛中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室牛羊传染病研究创新团队哈尔滨150069 哈尔滨维科生物技术有限公司研发部哈尔滨150069 内蒙古农业大学兽医学院呼和浩特010010 呼伦贝尔农垦谢尔塔拉农牧场有限公司呼和浩特021012 黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院齐齐哈尔161005

为表达牛冠状病毒(BCoV)N蛋白并制备抗N蛋白单克隆抗体,将N蛋白表达基因克隆至原核表达载体pCold-GST,利用大肠杆菌BL21(DE3)表达出N蛋白。SDS-PAGE结果显示,N蛋白主要以可溶性形式表达,分子量约为77 kDa,亲和纯化后纯度为90%。Western ... 详细信息

为表达牛冠状病毒(BCoV)N蛋白并制备抗N蛋白单克隆抗体,将N蛋白表达基因克隆至原核表达载体pCold-GST,利用大肠杆菌BL21(DE3)表达出N蛋白。SDS-PAGE结果显示,N蛋白主要以可溶性形式表达,分子量约为77 kDa,亲和纯化后纯度为90%。Western blot进一步鉴定发现,重组N蛋白与全病毒多克隆抗体具有良好的反应原性。经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,以该纯化蛋白免疫Balb/c小鼠,进行融合、筛选获得3株单克隆抗体,分别命名为1D11、5C2和2B11。细胞上清单克隆抗体效价均达1∶320,3株单克隆抗体均属IgG亚类,Western blot与IFA鉴定3株单克隆抗体与真核表达的N蛋白具有特异性反应。该研究内容为进一步研究N蛋白的结构、功能及建立快速诊断BCoV方法奠定了基础。

关键词：牛冠状病毒原核表达 N蛋白单克隆抗体

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病毒载体疫苗免疫效力的增强策略

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中国预防兽医学报 2022年第10期44卷 1116-1124页

作者：张心雨吴红霞王涛潘力付强孙元仇华吉佛山科学技术学院生命科学与工程学院广东佛山528231 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

自从人类首次发现痘苗病毒可以用于预防天花以来,疫苗一直在疾病防控中发挥着至关重要的作用。随着免疫学与分子生物学理论和技术的发展及应用,疫苗的安全性、有效性、稳定性等得到全面提高。基于基因工程技术的病毒载体疫苗与传统疫苗... 详细信息

自从人类首次发现痘苗病毒可以用于预防天花以来,疫苗一直在疾病防控中发挥着至关重要的作用。随着免疫学与分子生物学理论和技术的发展及应用,疫苗的安全性、有效性、稳定性等得到全面提高。基于基因工程技术的病毒载体疫苗与传统疫苗相比,安全性、靶向性和可控性更高,且适于研制多价或多联疫苗,因此成为疫苗研发的热点。但该类疫苗存在免疫效力低等问题,仍需改进。本文分别通过对目的基因和病毒载体的改造,以及免疫策略的改进等方面总结了几种提高病毒载体疫苗免疫效力的策略,为相关疫苗的研究提供参考。

关键词：免疫效力疾病防控病毒载体疫苗痘苗病毒传统疫苗疫苗研发基因工程技术免疫学

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表达荧光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因重组非洲猪瘟病毒的构建

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病毒学报 2021年第5期37卷 1128-1134页

作者：康力周仕君宋洁李江南翁长江中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室基础免疫创新团队哈尔滨150069

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染家猪和野猪引起的一种高致病性传染病,家猪感染ASFV强毒株后死亡率接近100%。为了研究ASFV的致病机制,利用绿色荧光蛋白(EGFP)作为报告基因构... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染家猪和野猪引起的一种高致病性传染病,家猪感染ASFV强毒株后死亡率接近100%。为了研究ASFV的致病机制,利用绿色荧光蛋白(EGFP)作为报告基因构建重组病毒已经广泛应用,但易于定量检测且适用于高通量筛选的重组ASFV目前没有报道。本研究以ASFV HLJ/18分离株为亲本病毒,采用CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组技术将表达Gaussia荧光素酶(Gluc)和EGFP的报告基因表达盒插入到ASFV的K145R基因的位置,构建可以同时表达Gluc和EGFP的重组ASFV(rASFV⁃Gluc⁃EGFP)。通过PCR鉴定、Gluc和EGFP表达的检测,确定获得的重组ASFV能够感染猪肺泡巨噬细胞且表达Gluc和EGFP。对构建的重组病毒和亲本病毒进行生长曲线比较,结果表明插入的报告基因不影响病毒在猪肺泡巨噬细胞中的复制。F5、F10和F15代重组病毒基因鉴定和报告基因表达检测结果表明,重组病毒能稳定表达插入的双报告基因。本研究成功构建了表达Gluc和EGFP的重组ASFV,可以针对报告基因进行定量检测和高通量筛选,为ASFV的感染和致病机制研究奠定坚实的基础。

关键词：非洲猪瘟病毒(ASFV) 重组病毒报告基因荧光素酶

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非洲猪瘟病毒的免疫逃逸策略

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微生物学报 2021年第2期61卷 249-262页

作者：孙茂文王涛孙元杨玉莹仇华吉长江大学动物科学学院湖北荆州434023 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种猪烈性传染病。目前无商品化的ASF疫苗,一旦发病,仅能依靠快速扑杀进行防控,严重威胁我国养猪及相关行业的健康发展。ASF疫苗研发面临的... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种猪烈性传染病。目前无商品化的ASF疫苗,一旦发病,仅能依靠快速扑杀进行防控,严重威胁我国养猪及相关行业的健康发展。ASF疫苗研发面临的主要困难是对ASFV的毒力相关基因、致病及其免疫逃逸机制知之甚少。本文对ASFV的免疫逃逸研究进行了总结,探讨了ASFV免疫逃逸基因及其编码蛋白的功能,以便加深对ASFV及其免疫逃逸策略的认知,为致病机制研究和疫苗研发提供借鉴。

关键词：非洲猪瘟病毒免疫逃逸天然免疫适应性免疫

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猪源GSDMA蛋白多克隆抗体的制备与初步应用

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中国预防兽医学报 2022年第12期44卷 1311-1316,1331页

作者：李帅宋洁周仕君刘佳李江南翁长江中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/基础免疫创新团队黑龙江哈尔滨150069 黑龙江省免疫学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

Gasdermin A(GSDMA)作为Gasdermin(GSDM)蛋白家族的一员,参与细胞的炎症反应,其经切割产生的片段可以诱导细胞焦亡。为制备猪GSDMA(pGSDMA)多克隆抗体,本研究构建了重组表达质粒pET-21apGSDMA,转化BL21(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导,表... 详细信息

Gasdermin A(GSDMA)作为Gasdermin(GSDM)蛋白家族的一员,参与细胞的炎症反应,其经切割产生的片段可以诱导细胞焦亡。为制备猪GSDMA(pGSDMA)多克隆抗体,本研究构建了重组表达质粒pET-21apGSDMA,转化BL21(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导,表达并纯化了重组pGSDMA蛋白。将纯化的该重组蛋白免疫小鼠制备pGSDMA多克隆抗体(pAb),并进行western blot和间接免疫荧光试验鉴定。结果显示,pGSDMA pAb能够特异性地识别外源表达的pGSDMA蛋白和猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中内源表达的pGSDMA蛋白。利用该pAb检测猪主要组织器官中pGSDMA蛋白的表达,结果显示其能识别猪不同组织器官中的pGSDMA蛋白,且pGSDMA在猪心脏中的表达量最低,在肝、脾、肺和肾中的表达量较高。利用该pAb检测不同剂量高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)感染PAMs中p GSDMA的表达,结果显示pGSDMA蛋白的表达量随着病毒感染剂量的增加而降低,表明pGSDMA在HP-PRRSV感染过程中发挥相关生物学作用。本研究首次制备了pGSDMA pAb,为深入探究pGSDMA生物学功能奠定了基础。

关键词： GSDMA 原核表达多克隆抗体高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒

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内蒙古地区牛冠状病毒的分离鉴定及S1基因遗传进化分析

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黑龙江畜牧兽医 2023年第19期 82-87,141页

作者：梁彤曹存于德斌王芳姜志刚徐晓静刘春东尹鑫常继涛中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/牛羊传染病研究创新团队哈尔滨150069 哈尔滨维科生物技术有限公司研发部哈尔滨150069 内蒙古农业大学兽医学院呼和浩特010010 北大荒完达山乳业股份有限公司哈尔滨150036

为了对内蒙古地区患腹泻疾病的犊牛进行病原学鉴定,并进一步丰富我国牛冠状病毒(BCoV)的种质资源和流行病学数据,试验采用PCR扩增、间接免疫荧光试验、增殖动态检测、透射电镜观察等方法确定9份新生犊牛腹泻粪便样本的病原学特征,同时... 详细信息

为了对内蒙古地区患腹泻疾病的犊牛进行病原学鉴定,并进一步丰富我国牛冠状病毒(BCoV)的种质资源和流行病学数据,试验采用PCR扩增、间接免疫荧光试验、增殖动态检测、透射电镜观察等方法确定9份新生犊牛腹泻粪便样本的病原学特征,同时通过序列比对分析与GenBank中具有代表性的BCoV S1基因组序列的同源性,利用MEGA 7.0.14软件构建S1基因组系统进化树。结果表明:9份样本中有2份为BCoV N基因阳性,PCR扩增得到大小约为730 bp的目的条带;用阳性样本接种HRT-18G细胞并进行3次传代培养,可见细胞出现以变圆、融合形成合胞体、融合细胞脱落为主要特征的典型细胞病变;分离株能够与兔抗BCoV N蛋白的多克隆抗体发生特异性反应,透射电镜观察可见有囊膜、表面有纤突、直径约为120 nm的病毒粒子;将分离获得的BCoV毒株命名为HM-XC,该分离株感染HRT-18G细胞的病毒含量为1×10^(5.75)TCID_(50)/0.1 mL;分离株HM-XC S1基因的核苷酸序列与我国青海省牦牛源毒株BCoV Yak/BCoV-China/QH1的相似性最高,为99.61%,与近年来辽宁省流行毒株的相似性为96.4%~99.0%,与美国经典参考毒株BCoV Mebus的相似性较低,为96.3%;与相似性最高的Yak/BCoV-China/QH1毒株相比,分离株HM-XC的S1蛋白存在7个氨基酸突变,分别是H115D、S186W、Y509H、V528A、N531D、L563S和I640T。说明内蒙古地区牛场中已有BCoV的流行,并且在犊牛腹泻粪便中分离获得BCoV内蒙古流行毒株,分离株具有我国新流行BCoV株的序列特征。

关键词：牛冠状病毒分离鉴定 S1蛋白编码基因序列分析

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