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鸡gga-miR-7b靶基因VDAC1-3’UTR双荧光素酶报告基因质粒的构建

基因组学与应用生物学 2020年第2期39卷 533-538页

作者：肖春婷廉传江易诚陈洪岩东北农业大学生命科学学院哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069 东北林业大学生命科学学院哈尔滨150040

本研究以鸡gga-miR-7b作为研究对象,为了明确与肿瘤形成相关的关键基因VDAC1(Voltage-dependent anion channel 1)是否为gga-miR-7b的靶基因,深入研究gga-miR-7b对VDAC1基因的调控作用,本研究运用TargetScan和miRBD生物学软件预测了gga-miR-7b与VDAC1 m RNA的3’端非编码区(3’UTR)存在种子结合位点(GTCTTCC),并使用PCR克隆以及同源重组突变的方法构建VDAC1-3’UTR野生型和突变型双荧光素酶报告基因重组质粒,经SacⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定及测序结果显示,片段大小符合且序列正确;成功构建了VDAC1-3’UTR野生型和突变型双荧光素酶报告基因重组质粒并命名为pmirGLOVDAC1-wt3’UTR和pmirGLO-VDAC1-mut3’UTR。本研究结果进一步为gga-miR-7b候选靶基因VDAC1的鉴定以及功能研究提供理论依据。

关键词：马立克氏病 gga-miR-7b VDAC1基因 pmirGLO-VDAC1-wt-3’UTR pmirGLO-VDAC1-mut-3’UTR

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抗菌肽Sublancin对蛋鸡免疫功能的影响研究

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中国预防兽医学报 2020年第3期42卷 268-273页

作者：田丽娜王秀荣李广兴东北农业大学动物医学学院/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为研究抗菌肽Sublancin对蛋鸡免疫功能的调节作用,本研究将216只海兰褐壳蛋鸡随机分为对照组(饲喂基础饲粮,C组)、低剂量抗菌肽组(饲喂基础饲粮+100 mg/kg Sublancin,L组)、中剂量抗菌肽组(饲喂基础饲粮+200 mg/kg Sublancin,M组)和高... 详细信息

为研究抗菌肽Sublancin对蛋鸡免疫功能的调节作用,本研究将216只海兰褐壳蛋鸡随机分为对照组(饲喂基础饲粮,C组)、低剂量抗菌肽组(饲喂基础饲粮+100 mg/kg Sublancin,L组)、中剂量抗菌肽组(饲喂基础饲粮+200 mg/kg Sublancin,M组)和高剂量抗菌肽组(饲喂基础饲粮+300 mg/kg Sublancin,H组)进行抗菌肽调控蛋鸡免疫的实验。实验持续30 d,分别在饲喂Sublancin后第1 d、15 d和30 d用ELISA试剂盒检测每组鸡血清中免疫球蛋白IgA、IgG和IgM含量;检测肝脏和脾脏指数;利用免疫印迹法检测每组鸡脾脏中干扰素γ(IFN-γ)表达;利用ELISA试剂盒检测每组鸡血清中IL-2、IL-4和IL-6含量。结果显示:与C组比较,L组、M组和H组鸡血清中IgA、IgG和IgM含量、肝脏和脾脏指数、脾脏中IFN-γ的表达、血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量在饲喂Sublancin后第1 d均无显著变化(p>0.05),在饲喂Sublancin后第15 d和第30 d均显著升高(p<0.05);与L组比较,M组和H组中上述检测指标在饲喂Sublancin后第15 d和第30 d均显著升高(p<0.05);与M组比较,H组中上述检测指标在饲喂Sublancin后第15 d和第30 d均无显著变化(p>0.05)。实验表明饲粮中添加抗菌肽Sublancin可以显著增强蛋鸡免疫力,其添加浓度在100 mg/kg^200 mg/kg时,作用效果有剂量依赖性;但添加浓度在200 mg/kg^300 mg/kg时,作用效果与浓度无关。本研究为家禽养殖业中功能性饲料添加剂的开发及抗菌肽Sublancin在养殖业中的应用提供了新的参考依据。

关键词：抗菌肽 Sublancin 蛋鸡免疫功能

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中国预防兽医学报 2020年第5期42卷 500-505页

作者：赵雅芝潘巧王显兵郝文君刘桐王秀梅辛九庆吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物支原体病创新团队黑龙江哈尔滨150069

为探究宿主TRIM9基因通过调控牛支原体(Mycoplasma bovis,***)脂质相关膜蛋白(LAMPs)诱导胎牛肺(EBL)细胞释放致炎细胞因子IL-1β的相关机制,本研究通过*** LAMPs刺激EBL细胞后,利用荧光定量PCR(qPCR)方法检测细胞中TRIM9和IL-1β基因... 详细信息

为探究宿主TRIM9基因通过调控牛支原体(Mycoplasma bovis,***)脂质相关膜蛋白(LAMPs)诱导胎牛肺(EBL)细胞释放致炎细胞因子IL-1β的相关机制,本研究通过*** LAMPs刺激EBL细胞后,利用荧光定量PCR(qPCR)方法检测细胞中TRIM9和IL-1β基因的转录水平,结果显示TRIM9基因转录水平上调2.9倍,IL-1β基因转录水平上调2.5倍。构建pEGFP-C1-TRIM9荧光报告质粒并转染EBL细胞,利用共聚焦显微镜观察TRIM9在EBL细胞中的定位,结果显示TRIM9蛋白能够瞬时表达于EBL细胞浆。通过将构建的pCMV-C-HA-TRIM9重组质粒和si-TRIM9干扰质粒共转染EBL细胞,经2μg/mL *** LAMPs刺激12 h后,采用qPCR和ELISA检测IL-1β的转录水平和表达情况,结果显示,与*** LAMPs刺激正常EBL细胞组相比,过表达TRIM9组中IL-1β在转录水平和蛋白表达水平均无明显变化,而敲低TRIM9组中IL-1β转录水平和蛋白表达水平均显著上调(分别上调33倍和30倍)。同时利用western blot检测p65蛋白磷酸化水平,分析NF-κB信号通路激活情况,结果显示,与*** LAMPs刺激正常EBL细胞组相比,TRIM9蛋白过表达组NF-κB信号通路激活水平无明显变化,而敲低TRIM9组p65磷酸化水平提高,促进NF-κB信号通路激活。综上结果表明敲低TRIM9基因能够促进*** LAMPs通过NF-κB信号通路诱导EBL细胞释放IL-1β。本研究为进一步明确宿主蛋白参与抗牛支原体天然免疫应答的机制奠定基础。

关键词：牛支原体脂质相关膜蛋白 TRIM9 NF-κB信号通路 IL-1β

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表达PCV-2 Cap和PPV-1 VP2蛋白的重组PRV的构建及鉴定

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黑龙江畜牧兽医 2019年第5期 16-22,175页

作者：谢永兴夏德利黄立平危艳武吴洪丽朱红振冯力刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069

为了构建表达猪圆环病毒2型(PCV-2)Cap蛋白和猪细小病毒1型(PPV-1)VP2蛋白的重组伪狂犬病病毒(PRV)及鉴定其免疫原性,试验采用经典同源重组技术构建重组病毒,利用密码子优化的VP2基因(VP2_(opti))和含PRV gG蛋白信号肽序列的VP2_(opti)... 详细信息

为了构建表达猪圆环病毒2型(PCV-2)Cap蛋白和猪细小病毒1型(PPV-1)VP2蛋白的重组伪狂犬病病毒(PRV)及鉴定其免疫原性,试验采用经典同源重组技术构建重组病毒,利用密码子优化的VP2基因(VP2_(opti))和含PRV gG蛋白信号肽序列的VP2_(opti)基因分别构建重组质粒pMD18T-LR(TK)-VP2_(opti)和pMD18T-LR(TK)-VP2_(opti)(SP)。用已构建的重组病毒rPRV-TK^-/gE^-/gG^-/3Cap^+为骨架,以EGFP为标签经同源重组获得重组病毒。采用IPMA法鉴定Cap蛋白和VP2蛋白抗原在重组病毒感染的PK-15细胞中的表达,采用IFA法鉴定VP2蛋白在重组病毒感染的PK-15细胞中的表达与定位。用这2株重组病毒免疫小鼠,通过检测血清中PRV、PCV-2和PPV-1抗体水平对构建的重组病毒在小鼠体内的免疫原性进行评价。结果表明:经同源重组获得重组病毒rPRV-TK^-/VP2^+/gE^-/gG^-/2Cap^+和rPRV-TK^-/VP2^+(SP)/gE^-/gG^-/2Cap^+;在重组病毒感染的PK-15细胞中均能检测到阳性Cap蛋白和VP2蛋白抗原;重组病毒rPRV-TK^-/VP2^+/gE^-/gG^-/2Cap^+表达的VP2蛋白定位于细胞浆和细胞核,而重组病毒rPRV-TK^-/VP2^+(SP)/gE^-/gG^-/2Cap^+表达的VP2蛋白定位于细胞浆;用这2株重组病毒免疫小鼠能够检测到PRV中和抗体;用灭活的重组病毒免疫小鼠后可产生低水平的Cap和VP2抗体,而重组病毒活毒免疫的小鼠未检测到相应抗体。说明这2株重组病毒在体外能够表达Cap蛋白和VP2蛋白,PRV gG蛋白信号肽序列的加入促进了VP2蛋白从细胞核的释放。

关键词：猪圆环病毒2型 Cap蛋白猪细小病毒1型 VP2蛋白重组伪狂犬病病毒重组质粒免疫原性

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A型流感病毒感染雪貂造模的研究进展

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中国实验动物学报 2019年第2期27卷 254-260页

作者：马树杰张博孔宇飞关云涛中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069

A型流感病毒(influenza A virus,IAV)感染人和动物,严重威胁公共卫生安全。动物模型在IAV研究中发挥着重要作用,不同的动物模型具有不同的优点和限制性。本文比较了雪貂与小鼠、豚鼠和非人灵长类动物模型的优点和限制性,突出说明雪貂在... 详细信息

A型流感病毒(influenza A virus,IAV)感染人和动物,严重威胁公共卫生安全。动物模型在IAV研究中发挥着重要作用,不同的动物模型具有不同的优点和限制性。本文比较了雪貂与小鼠、豚鼠和非人灵长类动物模型的优点和限制性,突出说明雪貂在IAV研究中的重要性,并就雪貂在IAV致病性、传播和疫苗研发中的研究进展做了总结,以期为IAV的基础和应用研究提供参考。

关键词： A型流感病毒雪貂动物模型致病性传播疫苗研发

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黑龙江某规模化牛场副结核分枝杆菌的分离与鉴定

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中国预防兽医学报 2020年第11期42卷 1177-1180页

作者：蔡珠明党光辉臧鑫鑫邵明珠唐阳阳崔子寅宋宁宁刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150069 吉林农业大学动物科技学院吉林长春130118

为检测黑龙江某规模化牛场副结核病的感染情况,本研究采集了35头副结核分枝杆菌(MAP)抗体阳性牛(有腹泻表现)的直肠刮取物,采用IS900-PCR鉴定样品中的MAP,将该PCR扩增为阳性的样品通过细菌分离培养、菌落形态学观察、多重PCR鉴定MAP的亚... 详细信息

为检测黑龙江某规模化牛场副结核病的感染情况,本研究采集了35头副结核分枝杆菌(MAP)抗体阳性牛(有腹泻表现)的直肠刮取物,采用IS900-PCR鉴定样品中的MAP,将该PCR扩增为阳性的样品通过细菌分离培养、菌落形态学观察、多重PCR鉴定MAP的亚型,通过IS1311基因序列同源性比对并对分离菌进行遗传进化分析,同时对其进行多态性分型鉴定,进一步确定分离株的亚型。结果显示,35份直肠刮取物样本中,31份经IS900-PCR扩增阳性,分离培养得到的3株分离菌菌落形态与分枝杆菌相似,多重PCR的鉴定谱型均与MAP K-10参考株一致,其在遗传进化上与多株MAP具有高度的亲缘性,经IS1311多态性分型鉴定3株分离菌均为牛型MAP,分别命名为MAP-HLJB160、MAP-HLJB175、MAP-HLJB177。本研究为黑龙江地区副结核病的预防和流行病学调查提供数据支撑。

关键词：牛副结核分枝杆菌 IS1311 亚型鉴定

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抗猫细小病毒嵌合抗体基因在昆虫细胞中的表达与鉴定

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中国预防兽医学报 2019年第6期41卷 632-636页

作者：薛雨佳宋彩玲赵爽爽李彤彤王文静张云刘明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

为降低单克隆抗体(MAb)在犬体内的免疫原性,本研究克隆了具有中和猫、犬细小病毒(FPV、CPV)活性的MAb(3EB)的轻、重链可变区基因及犬天然抗体(NAb)轻、重链恒定区基因,通过融合PCR获得鼠-犬嵌合抗体基因。构建能够表达嵌合抗体的重组质... 详细信息

为降低单克隆抗体(MAb)在犬体内的免疫原性,本研究克隆了具有中和猫、犬细小病毒(FPV、CPV)活性的MAb(3EB)的轻、重链可变区基因及犬天然抗体(NAb)轻、重链恒定区基因,通过融合PCR获得鼠-犬嵌合抗体基因。构建能够表达嵌合抗体的重组质粒,经昆虫杆状病毒表达系统对重组嵌合抗体进行表达。SDS-PAGE和western blot试验显示鼠-犬嵌合抗体重链为55ku、轻链为25ku。间接免疫荧光试验显示该嵌合抗体能够与抗犬IgG和FPV特异性结合。上述结果表明,嵌合抗体保留了原MAb3EB对病毒特异结合能力的基础上,将鼠源恒定区替换为犬源NAb的恒定区。病毒中和试验表明嵌合抗体保留了3EB对FPV、CPV的中和活性。本研究首次通过昆虫杆状病毒表达系统表达了抗FPV、CPV的嵌合抗体,降低了原MAb的免疫原性,对FPV、CPV病临床治疗用抗体药物的研制具有重要指导意义。

关键词：基因工程嵌合抗体猫细小病毒昆虫杆状病毒表达系统

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猪IL-21的真核表达及其与CD40L共刺激抗体分泌的活性研究

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中国预防兽医学报 2019年第5期41卷 501-504,533页

作者：杨贝贝符芳薛美冯力刘平黄中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

为研究猪白介素21(IL-21)的生物学功能,本研究在猪IL-21基因(456 bp)的3’端加上猪Ig G Fc标签序列后,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建重组质粒pcDNA-IL-21-Fc。将该重组质粒转染293T细胞瞬时表达后,利用protein A亲和纯化介... 详细信息

为研究猪白介素21(IL-21)的生物学功能,本研究在猪IL-21基因(456 bp)的3’端加上猪Ig G Fc标签序列后,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建重组质粒pcDNA-IL-21-Fc。将该重组质粒转染293T细胞瞬时表达后,利用protein A亲和纯化介质纯化转染上清中的目的蛋白,并检测其纯度与生物学活性。结果显示,构建的重组质粒pcDNA-IL-21-Fc能够在293T细胞中表达相对分子量约为44 ku的猪IL-21融合蛋白;亲和纯化后的猪IL-21融合蛋白能够与CD40L协同呈剂量依懒性地刺激猪外周血淋巴细胞(PBMCs)分泌Ig G。本研究为进一步探究猪IL-21在适应性免疫应答中的作用提供依据。

关键词：猪IL-21 真核表达蛋白纯化抗体分泌

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金黄色葡萄球菌杀白细胞素基因敲除菌株的构建及生长特性分析

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中国预防兽医学报 2020年第11期42卷 1104-1108页

作者：刘文宇祝瑶王长珍杨亲栾天王凌利刘思国周学章张万江中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150069 宁夏大学生命科学学院宁夏银川750021

为构建金黄色葡萄球菌杀白细胞素(PVL)基因敲除的菌株,本研究以pBT2温敏型质粒为载体,构建金黄色葡萄球菌PVL基因敲除质粒pBT2-ΔPVL,并经酶切鉴定。将其转化至金黄色葡萄球菌RN4220中经其修饰后电转化至金黄色葡萄球菌ATCC 49775中,在3... 详细信息

为构建金黄色葡萄球菌杀白细胞素(PVL)基因敲除的菌株,本研究以pBT2温敏型质粒为载体,构建金黄色葡萄球菌PVL基因敲除质粒pBT2-ΔPVL,并经酶切鉴定。将其转化至金黄色葡萄球菌RN4220中经其修饰后电转化至金黄色葡萄球菌ATCC 49775中,在30℃和42℃多次交替传代并经红霉素抗性筛选,构建PVL基因敲除菌株,经PCR和测序鉴定后命名为ΔPVL。以pLI50穿梭质粒为载体,构建金黄色葡萄球菌PVL基因回补质粒pLI50-PVL,按照同样方法将其转化至敲除菌株ΔPVL中,构建PVL基因回补菌株CΔPVL。将ΔPVL在TSB培养基中连续传代培养后,经PCR检测敲除菌株体外的遗传稳定性;分别绘制敲除菌株ΔPVL和回补菌株CΔPVL的生长曲线,检测其体外生长特性。结果显示,正确构建了两种质粒pBT2-ΔPVL、pLI50-PVL和两种菌株ΔPVL、CΔPVL。敲除菌株ΔPVL连续传代未发生回复突变,具有良好的遗传稳定性。生长特性结果显示敲除菌株生长速率显著低于野生菌株,表明PVL基因在金黄色葡萄球菌的生长调节中发挥着一定的作用。本研究为进一步研究金黄色葡萄球菌PVL的功能及致病机制奠定了基础。

关键词：杀白细胞素同源重组遗传稳定性

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H7N9禽流感DNA疫苗的免疫保护效力研究

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中国预防兽医学报 2019年第9期41卷 935-939页

作者：梁真洁潘俊慧于晓菲陈普成曾显营柳金雄施建忠邓国华姜永萍陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

为检测H7N9禽流感病毒(AIV) DNA疫苗的免疫保护效力,本研究将H7N9禽流感疫苗株A/Chicken/Guangxi/SD098/2017 (H7N9)[CK/GX/SD098/17 (H7N9)]的HA基因密码子优化后,定向克隆至载体pCAGGS中构建重组质粒pCA-SD098。将pCA-SD098转染至293T细胞后,采用间接免疫荧光(IFA)和western blot检测,结果显示,HA蛋白可以在293T细胞中正确表达。分别利用15μg和20μg重组质粒pCA-SD098免疫3周龄SPF鸡,3周后以相同的剂量和方式加强免疫,加强免疫一周后通过鼻腔分别感染105EID50的同源高致病性AIV (HPAIV)CK/GX/SD098/17 (H7N9)和异源低致病性AIV (LPAIV) A/Chicken/Chongqing/SD057/2017 (H7N9)[CK/CQ/SD057/17 (H7N9)],攻毒10 d内记录免疫鸡发病和死亡情况,检测免疫鸡HI抗体水平,并于攻毒后第3 d、第5 d和第7 d无菌采集所有鸡的喉头和泄殖腔拭子,采用红细胞凝集试验(HA)检测病毒的滴度。结果显示,重组质粒pCA-SD098免疫后可以诱导SPF鸡产生较高水平的HI抗体,15μg pCA-SD098剂量免疫鸡后能够完全抵御H7N9 HPAIV的致死性攻击,20μg pCA-SD098剂量可以有效阻断H7N9 LPAIV的感染。攻毒后,所有免疫鸡无发病、无死亡、无排毒,本研究为质粒pCA-SD098作为防控H7N9禽流感的候选DNA疫苗提供了实验依据。

关键词： H7N9禽流感 DNA疫苗免疫保护效力

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