检索结果-内蒙古大学图书馆

中国预防兽医学报 2018年第10期40卷 940-944页

作者：程玉笛党光辉李鹤李哲刘虹秀宋宁宁刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150069

为筛选出最佳的预防副结核病的候选疫苗,本研究评价了副结核分枝杆菌(MAP)培养上清、MAP细胞壁和MAP灭活菌体的免疫保护效果。将160只6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为8组,每组20只,分别为PBS组、菌影(Ghost)组、弗氏不完全佐剂(IFA)组、上... 详细信息

为筛选出最佳的预防副结核病的候选疫苗,本研究评价了副结核分枝杆菌(MAP)培养上清、MAP细胞壁和MAP灭活菌体的免疫保护效果。将160只6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为8组,每组20只,分别为PBS组、菌影(Ghost)组、弗氏不完全佐剂(IFA)组、上清+Ghost组、上清+IFA组、细胞壁+Ghost组、细胞壁+IFA组和灭活苗组,分别经皮下注射免疫后在不同的时间点采集小鼠尾静脉血,利用间接ELISA检测小鼠血清中抗体效价。三免后以5×10~8cfu/只剂量进行腹腔攻毒。结果显示:细胞壁+IFA组小鼠的抗体水平明显高于其它组(p<0.001),细胞壁+Ghost组次之(p<0.001);除阴性对照组外,各组小鼠IgG1的滴度均高于IgG2a (p<0.001);细胞壁+IFA组和细胞壁+Ghost组的小鼠脾脏淋巴细胞培养上清中IFN-γ、IL-4和IL-10的含量显著高于其它实验组(p<0.001);细胞壁+IFA组IL-2的含量明显高于其它实验组(p<0.001),细胞壁+Ghost组次之(p<0.01);细胞壁+IFA组小鼠的肝脏、脾脏和小肠组织的荷菌量显著少于其它实验组(p<0.01),细胞壁+Ghost组次之(p<0.05),表明MAP细胞壁可以刺激机体产生较高水平的抗体,机体的免疫反应倾向于体液免疫,且细胞壁对攻毒小鼠的保护效果最好。本研究为反刍动物副结核病疫苗的研制提供了实验依据。

关键词：副结核分枝杆菌培养上清细胞壁灭活苗

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一株新城疫病毒野鸟分离株的生物学特性研究

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中国预防兽医学报 2018年第9期40卷 847-850页

作者：梁甜甜孙军峰韩宗玺刘胜旺刘怀然中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽呼吸道病研究团队黑龙江哈尔滨150069

野鸟是新城疫病毒(NDV)重要的自然宿主,在NDV的传播和进化中起着重要作用。Mallard/CH/HLJ127/06是2006年分离自黑龙江省野鸟的一株NDV。本研究对其进行了全基因组序列测定、遗传进化分析、抗原相关性分析;并测定了病毒株毒力指标及致... 详细信息

野鸟是新城疫病毒(NDV)重要的自然宿主,在NDV的传播和进化中起着重要作用。Mallard/CH/HLJ127/06是2006年分离自黑龙江省野鸟的一株NDV。本研究对其进行了全基因组序列测定、遗传进化分析、抗原相关性分析;并测定了病毒株毒力指标及致病性特点。结果显示Mallard/CH/HLJ127/06属于class II中的基因VII型病毒株。F蛋白裂解位点为^(112)RRQKRF^(117)。抗原相关性分析表明Mallard/CH/HLJ127/06与基因VII型代表性病毒株之间没有显著的抗原性差异。致病指数MDT (最小致死剂量病毒致死鸡胚的平均时间)值为68 h,ICPI (脑内接种致病指数)值为1.975。致病性试验结果显示,SPF鸡感染Mallard/CH/HLJ127/06后表现明显的临床症状,在感染鸡的脑、气管、肺脏、腺胃、盲肠扁桃体、肾脏和肝脏中均能够检测到病毒的RNA。本研究为进一步研究野鸟在NDV流行病学中的作用及对我国新城疫的防控提供了依据。

关键词：野鸟新城疫病毒基因Ⅶ型生物学特性

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CRISPR/Cpf1介导DDX21基因敲除载体活性检测

CRISPR/Cpf1介导DDX21基因敲除载体活性检测

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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：鲁国涛张子博田璐李昂陈洪岩孟庆文中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

目的：旨在建立一种简单、快捷、高效、稳定的家鸡基因组编辑系统,为研究基因功能及模型建立奠定基础.方法：根据鸡DDX21基因序列设计选择4个gRNA,构建Cpf1/gRNA敲除表达载体并转染状态良好的DF-1细胞,经流式细胞仪收集表达红色荧光蛋... 详细信息

目的：旨在建立一种简单、快捷、高效、稳定的家鸡基因组编辑系统,为研究基因功能及模型建立奠定基础.方法：根据鸡DDX21基因序列设计选择4个gRNA,构建Cpf1/gRNA敲除表达载体并转染状态良好的DF-1细胞,经流式细胞仪收集表达红色荧光蛋白的阳性细胞,T7E1酶切法选择高效的敲除载体,TA克隆测序法评估其介导DDX21基因敲除的效率.结果：结果表明4个gRNA序列正确插入表达载体中;T7E1酶切结果显示Cpf1/gRNA1基因靶向敲除活性最高,TA测序分析发现其敲除活性为33.3％.结论：本研究初步建立了CRISPR/Cpf1系统介导的基因编辑技术,结果表明CRISPR/Cpf1能够稳定介导鸡DF-1细胞上的基因组编辑,这为进一步揭示DDX21基因功能、建立DDX21基因敲除的细胞系和鸡体模型提供了理论基础和科学依据.

关键词： CRISPR/Cpf1 基因敲除 DF-1细胞 DDX21

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利用重组慢病毒载体共表达Cas9-sgRNA构建TLR4基因敲除DF1细胞系

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中国兽医科学 2018年第8期48卷 958-964页

作者：庞中兵王伟刘赛宝王辉陈洪岩孟庆文中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室

Toll样受体4（TLR4）是TLRs家族成员之一,可识别革兰阴性菌细胞壁脂多糖（LPS）和某些病毒蛋白,进而激活天然免疫应答,在细菌和病毒感染性疾病的发生过程中起重要作用。本研究靶向禽源TLR4基因第一外显子,设计、构建了2个sg RNA的CRISPR... 详细信息

Toll样受体4（TLR4）是TLRs家族成员之一,可识别革兰阴性菌细胞壁脂多糖（LPS）和某些病毒蛋白,进而激活天然免疫应答,在细菌和病毒感染性疾病的发生过程中起重要作用。本研究靶向禽源TLR4基因第一外显子,设计、构建了2个sg RNA的CRISPR/Cas9双质粒表达系统,转染禽DF1细胞。流式细胞仪分选、测序验证了在家禽DF1细胞系成功敲除了TLR4基因。然后利用GV393慢病毒表达载体,构建了CAG启动子启动Cas9的共表达载体Lv-CAG-Cas9-U6-sg RNA。通过转染、流式分选、培养单细胞克隆、靶基因组测序以及Western-blot检测,筛选获得1株TLR4基因敲除的DF1细胞系。结果表明,TLR4基因敲除细胞系与野生型细胞生长动力学无显著差异。本研究验证了共表达Cas9和sg RNA可以在禽源细胞系实现基因编辑,为利用重组慢病毒共表达Cas9和sg RNA策略探索构建敲除鸡模型研究奠定了理论基础和科学依据,也为研究禽TLR4基因功能、家禽天然免疫应答机制提供了细胞模型。

关键词： CRISPR/Cas9 DF1细胞系 TLR4 慢病毒表达载体基因敲除

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我国职业人群对布鲁菌病防控的认知情况及影响因素分析

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中华地方病学杂志 2018年第9期37卷 716-720页

作者：刘平曾恒刘春国王靖飞高璐徐全刚李娟康京丽孙向东中国动物卫生与流行病学中心青岛266032 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

目的掌握我国羊养殖人员和基层兽医对布鲁菌病（简称布病）防控相关的知识、态度和行为（知信行）情况，分析影响知信行水平的关键因素。方法 2017年3 - 9月，在我国7个省份选取1 067名羊养殖人员和401名基层兽医作为研究对象，进行问... 详细信息

目的掌握我国羊养殖人员和基层兽医对布鲁菌病（简称布病）防控相关的知识、态度和行为（知信行）情况，分析影响知信行水平的关键因素。方法 2017年3 - 9月，在我国7个省份选取1 067名羊养殖人员和401名基层兽医作为研究对象，进行问卷调查。用百分比描述知信行的每个条目，将每个调查对象的知信行总分转化成百分制，采用两独立样本的非参数检验比较不同群体的知信行水平差异。结果羊养殖人员和基层兽医中，对布病防控相关的知信行整体认知率分别为64.2%和80.1%。另有17.3%（185／1 067）羊养殖人员和12.2%（49／401）基层兽医未听说过或不了解布病。两类从业人员对布病防控相关知识的知晓率分别为62.6%和79.0%，其中75.8%的羊养殖人员和83.8%基层兽医对布病防控持积极态度，54.1%和77.6%对布病防控有较好的行为习惯。未来希望获取布病防控相关信息的途径中，电视的占比上升幅度最大，其次是网络和广播。在羊养殖人员中，来自于一类地区，年龄≤45岁，文化程度在初中及以上，养殖年限〈 5年及家中羊群感染过布病者，具有更高的知信行水平（U = 4.85、3.08、3.29、2.20、6.62，P 〈 0.05或〈 0.01）。在基层兽医中，文化程度为大专及以上者具有更高的知信行水平（U = 4.29，P 〈 0.01）。结论我国羊养殖人员和基层兽医对布病防控相关知识和行为仍需提高和加强，在宣传方式改进，宣传内容和形式优化，新媒体运用等方面有待进一步改进。

关键词：布鲁杆菌病职业人群认知影响因素

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应用Gelatin和3D培养验证细胞粘附对传染性支气管炎病毒在体外培养细胞中增殖的影响

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中国预防兽医学报 2018年第12期40卷 1089-1094页

作者：王娜娜韩宗玺山丹邵昱昊刘胜旺李海中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽呼吸道传染病创新团队黑龙江哈尔滨150069

除传染性支气管炎病毒(IBV) Beaudette株外,其它IBV均难以在体外细胞系中传代培养。为研究限制IBV体外传代培养的影响因素,本研究应用流式细胞术检测IBV经典株M41囊膜与宿主细胞膜融合程度,结果显示M41可以在体外培养条件下侵入鸡细胞系... 详细信息

除传染性支气管炎病毒(IBV) Beaudette株外,其它IBV均难以在体外细胞系中传代培养。为研究限制IBV体外传代培养的影响因素,本研究应用流式细胞术检测IBV经典株M41囊膜与宿主细胞膜融合程度,结果显示M41可以在体外培养条件下侵入鸡细胞系LMH和DF-1,但荧光定量PCR检测显示侵入的M41无法增殖。进一步通过对比分析M41易感组织气管、非易感组织脾脏及LMH细胞全基因组转录谱数据,结果显示宿主细胞粘附、细胞周期、p53及SRC可能是M41在体外培养细胞中增殖的宿主决定因素。本研究通过在2D培养体系中预先孵育Gelatin和3D培养两种方式来调节细胞粘附的物理环境,结果显示两种方法均可以促进M41在体外培养细胞中的增殖;利用多种经典的细胞周期抑制剂及p53和SRC活性调控分子预先处理LMH和DF1,显示细胞周期、p53活性及SRC活性对IBV体外增殖无显著影响。表明细胞粘附特性是影响IBV体外增殖的重要因素。本研究为IBV体外细胞培养体系的建立奠定了实验基础。

关键词：传染性支气管炎病毒全基因组转录谱分析病毒增殖 3D细胞培养

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H7N9流感病毒人源分离株与禽源分离株复制特性研究

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中国预防兽医学报 2018年第5期40卷 371-374页

作者：郭晶李媛媛裴兰英邓国华施建忠陈化兰李旭勇聊城大学农学院山东聊城252000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为了解H7N9流感病毒的生物学特性,本研究对H7N9流感病毒人源分离株(AH1)和禽源分离株(CK53)复制特性进行了系统比较研究。序列分析显示,AH1和CK53病毒在进化关系上同源性较高,仅有8个氨基酸位点差异。两株病毒分别接种禽类细胞DF1和CEF... 详细信息

为了解H7N9流感病毒的生物学特性,本研究对H7N9流感病毒人源分离株(AH1)和禽源分离株(CK53)复制特性进行了系统比较研究。序列分析显示,AH1和CK53病毒在进化关系上同源性较高,仅有8个氨基酸位点差异。两株病毒分别接种禽类细胞DF1和CEF,人类细胞A549和Calu-3,检测其复制能力,结果显示在33℃和37℃两种温度条件下,两种病毒在禽类细胞中复制能力相似,但在人类细胞中AH1复制能力强于CK53。CK53在哺乳动物细胞连续培养5代后出现包含PB2/E^(627)K在内共5个氨基酸位点的突变,显示禽源分离株在哺乳动物细胞复制过程中可以迅速获得适应性突变。突变病毒CK53-P5在A549细胞中复制水平明显强于CK53,其复制能力与AH1差异不明显。本研究进一步揭示了H7N9流感病毒人源分离株与禽源分离株的生物学特性差异,为深入了解其致病分子机制提供了实验依据。

关键词： H7N9 流感病毒复制细胞

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两株H6亚型禽流感病毒全基因组序列测定及遗传进化分析

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中国预防兽医学报 2018年第4期40卷 275-278页

作者：李旭勇李玉保刘文强马树杰崔鹏飞孙香雪潘玉迪陈化兰郭晶聊城大学农学院山东聊城252000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为研究2016年在活禽交易市场鸭体内分离的2株H6亚型禽流感病毒(AIV)[分别是A/duck/Jiangxi/88/2016(H6N6)(简称DK/88/16)和A/duck/Jiangxi/219/2016(H6N2)(简称DK/219/16)]分子特征及遗传进化规律,本实验对其进行了全基因组扩增和测序,并进行了遗传进化分析。结果显示,2株病毒间HA基因同源性较低,仅为94.5%,但与我国近年分离的H6亚型病毒株保持较高同源性。DK/88/16和DK/219/16的NA基因分别与我国近年流行的流感病毒N6和N2基因保持较高同源性。对2株病毒的内部基因分析显示,其内部基因的来源较为复杂,其中DK/88/16的内部基因PA来源于我国最近流行的H5N2或H5N6病毒,显示该株病毒为新的重组病毒。对2株病毒的分子特征分析显示,除M1蛋白的30和215位点及NS1蛋白的42位点具有增强病毒对小鼠致病力的分子特征外,其余均保持低致病力分子特征。以上结果表明,H6N2和H6N6亚型AIV在我国鸭群中持续存在,并不断的遗传重组,需要进行持续的流行病学监测。

关键词：禽流感病毒 H6亚型基因遗传分析

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肝脏特异性Pten基因敲除小鼠模型的制备及鉴定

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兽医导刊 2019年第4期 210-212,242页

作者：刘宏扬黄丽张昆丽翁长江杨玉莹长江大学动物科学学院湖北荆州434025 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所基础免疫创新团队/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

目的为研究抑癌基因Pten在肝脏中的生物学功能,利用Cre/Loxp基因敲除技术建立肝脏特异性Pten基因敲除小鼠模型。方法将Ptenflox/flox小鼠与肝脏特异性表达Alb-Cre重组酶的小鼠进行交配,对F1代小鼠进行鉴定,筛选出基因型为Ptenflox/+/Alb... 详细信息

目的为研究抑癌基因Pten在肝脏中的生物学功能,利用Cre/Loxp基因敲除技术建立肝脏特异性Pten基因敲除小鼠模型。方法将Ptenflox/flox小鼠与肝脏特异性表达Alb-Cre重组酶的小鼠进行交配,对F1代小鼠进行鉴定,筛选出基因型为Ptenflox/+/Alb-Cre的子代小鼠,将其与Ptenflox/flox小鼠进行交配,筛选出基因型为Ptenflox/flox/Alb-Cre的F2代小鼠,将Ptenflox/flox/Alb-Cre小鼠与Ptenflox/flox小鼠进行交配,获得F3代基因敲除小鼠,Ptenflox/flox/Alb-Cre小鼠为本实验所构建的肝脏特异性Pten基因敲除小鼠,Ptenflox/flox小鼠为对照小鼠。提取小鼠基因组DNA,通过PCR方法鉴定不同子代小鼠的基因型;提取小鼠肝脏、肺以及肾脏组织的总RNA和蛋白,利用Real-TimePCR和WesternBlot技术检测Pten基因在小鼠不同脏器中的mRNA和蛋白质表达水平。结果获得敲除小鼠基因型为Ptenflox/flox/Alb-Cre,和对照小鼠相比,Ptenflox/flox/Alb-Cre小鼠在肺和肾脏中Pten基因的mRNA水平及蛋白水平无明显变化,仅在肝脏中Pten水平显著低于Ptenflox/flox型小鼠。结论本研究利用Cre/Loxp技术成功构建了肝脏特异性Pten基因敲除小鼠,为在体内进一步研究Pten基因的功能提供了重要动物模型。

关键词： Pten Cre/Loxp 基因敲除肝脏特异

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利用酵母随机展示技术对猪肺炎支原体P97上B细胞表位的筛选和鉴定

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畜牧兽医学报 2018年第7期49卷 1492-1499页

作者：刘璐郭杰朱可蒙王宁辛九庆刘玉芬刘恒贵哈尔滨师范大学生命科学与技术学院哈尔滨150025 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物支原体团队哈尔滨150069

构建猪肺炎支原体P97蛋白的酵母随机展示文库,并利用该文库筛选和鉴定P97蛋白上的特异性B细胞表位。设计特异性引物从Mhp基因组中扩增p97基因,通过PCR方法将基因内部的TGA密码子突变为TGG,用DNaseⅠ将p97突变基因随机消化成长度100~250b... 详细信息

构建猪肺炎支原体P97蛋白的酵母随机展示文库,并利用该文库筛选和鉴定P97蛋白上的特异性B细胞表位。设计特异性引物从Mhp基因组中扩增p97基因,通过PCR方法将基因内部的TGA密码子突变为TGG,用DNaseⅠ将p97突变基因随机消化成长度100~250bp的片段,回收产物经3′端加A处理后与用XcmⅠ酶切的酵母表达载体pCT-XcmⅠ连接,将连接产物转化酿酒酵母EBY100获得P97蛋白酵母随机展示文库。利用流式细胞分选技术筛选出文库中能与Mhp天然感染的猪阳性血清结合的阳性酵母克隆,并进一步鉴定其最小抗原表位。结果:1)克隆计数显示构建的随机文库库容量为2.86×106克隆,所有插入的片段随机分布,覆盖了全长的p97突变基因,文库经诱导后可以利用流式细胞仪检测到与Mhp天然感染的猪阳性血清反应的阳性克隆;2)随后对文库进行流式细胞分选,经鉴定选出184号一个抗原多肽。从短肽C端氨基酸逐个缺失后发现长度为15个氨基酸的184D(DEKTSSQKDPSTLRA)多肽为一个B细胞表位,该表位能与多份Mhp阳性猪血清反应。P97蛋白酵母随机展示文库可以用于抗原表位的筛选鉴定,184D多肽是P97上一个在宿主体内能普遍诱导抗体免疫应答的B细胞表位,本研究对于研发Mhp的表位疫苗和建立特异性诊断方法具有重要意义。

关键词：猪肺炎支原体 P97黏附蛋白酵母展示文库 B细胞表位

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