检索结果-内蒙古大学图书馆

中国农业科学 2007年第10期40卷 2343-2349页

作者：祁小乐高宏雷高玉龙邓小芸步志高王晓燕王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室哈尔滨150001

【目的】建立高效鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)拯救平台,为深入研究该病毒基因组的结构与功能奠定基础。【方法】在IBDVGt株全基因组中引入分子标签(A节段:EcoR V酶切位点;B节段:PstI酶切位点)。在基因组两端分别引入锤头状核酶结构(Ham... 详细信息

【目的】建立高效鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)拯救平台,为深入研究该病毒基因组的结构与功能奠定基础。【方法】在IBDVGt株全基因组中引入分子标签(A节段:EcoR V酶切位点;B节段:PstI酶切位点)。在基因组两端分别引入锤头状核酶结构(HamRz)和丁肝病毒核酶结构(HdvRz)。将带有分子标签和核酶结构的IBDV基因组插入载体pCAGGS的β肌动蛋白启动子下游,构建IBDV感染性克隆pCAGGmGtAHRT和pCAGGmGtBHRT,LipofectamineTM2000介导共转染DFI细胞,进行病毒拯救研究。【结果】构建的IBDV感染性克隆可在DFI、Vero/E6、Vero/P12等3种细胞上高效拯救出病毒。RT-PCR、间接免疫荧光、电镜等均检测到了拯救的IBDV,且存在分子标签。拯救毒在CEF上能产生特有的砂砾状CPE,且TCID50与亲本毒差异不显著,具有相似的生物学特征。【结论】构建的RNA聚合酶ⅢBDV拯救系统高效、稳定、简便、经济,且具有良好的细胞普适性。

关键词：传染性法氏囊病病毒感染性分子克隆病毒拯救分子标签核酶

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猪肺炎霉形体p52基因重组腺病毒的构建及其免疫特性

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中国兽医科学 2009年第8期39卷 712-717页

作者：曹培丽李媛陈超郭丹王亮乔祖建辛九庆中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

为构建携带猪肺炎霉形体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)p52基因的重组腺病毒,从Mhp J株扩增p52基因,克隆到穿梭载体pShuttle-CMV中,经PmeⅠ线性化后,电转化入BJ5183菌内,与其含有的骨架载体pAdEasy-1同源重组,再与脂质体混合转染AD-29... 详细信息

为构建携带猪肺炎霉形体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)p52基因的重组腺病毒,从Mhp J株扩增p52基因,克隆到穿梭载体pShuttle-CMV中,经PmeⅠ线性化后,电转化入BJ5183菌内,与其含有的骨架载体pAdEasy-1同源重组,再与脂质体混合转染AD-293细胞,包装成完整的腺病毒,经RT-PCR、间接免疫荧光鉴定后扩增,收集病毒液,免疫BALB/c小鼠,并分析了体液免疫、黏膜免疫和细胞免疫效果。结果表明,重组质粒pShuttle-CMV-P52插入片段为1 202 bp;同源重组成功;重组腺病毒可以正确表达目的蛋白,效价达1×106TCID50/mL。重组病毒经肌肉注射和滴鼻均可诱导小鼠产生血清和肺匀浆液特异性IgG、SIgA,但不能诱导特异的淋巴细胞增殖。证实,成功构建了表达p52基因的重组腺病毒,该病毒可诱发小鼠产生特异的体液免疫和黏膜免疫,但不产生细胞免疫应答。

关键词：猪肺炎霉形体 p52基因重组腺病毒免疫应答

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凝胶层析和离子交换层析结合法纯化高盐发酵液中谷氨酰胺转胺酶

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分析化学 2012年第8期40卷 1225-1230页

作者：张莉丽张兰威杜明韩雪易华西张英春张艳禾马微哈尔滨工业大学食品科学与工程学院东北农业大学食品学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室

采用凝胶层析和离子交换层析相结合的方法分离纯化高盐培养基中的谷氨酰胺转胺酶,优化的凝胶层析的条件,上样量6 mL,流速为0.25 mL/min;离子交换层析的上样量50 mL,流速为3 mL/min。酶被纯化了4.22倍,比活力达17.33 U/mg蛋白,回收率为77... 详细信息

采用凝胶层析和离子交换层析相结合的方法分离纯化高盐培养基中的谷氨酰胺转胺酶,优化的凝胶层析的条件,上样量6 mL,流速为0.25 mL/min;离子交换层析的上样量50 mL,流速为3 mL/min。酶被纯化了4.22倍,比活力达17.33 U/mg蛋白,回收率为77.5%。液相色谱-串联质谱鉴定、蛋白质数据库比对结果表明,纯酶与AAN01353是同种蛋白质。

关键词：谷氨酰胺转胺酶分离纯化液相色谱-串联质谱凝胶层析离子交换层析

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副猪嗜血杆菌血清5型TbpA蛋白的表达及其免疫原性分析

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中国预防兽医学报 2012年第3期34卷 238-240页

作者：李建军胡明明朱晓凯李艳玲张艳禾谢芳王春来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

为原核表达副猪嗜血杆菌血清5型TbpA蛋白,本研究利用特异性引物扩增tbpA基因,并将其克隆到pMD18-T载体中进行序列测定。再将其亚克隆于pET-28a中构建重组表达质粒pET-tbpA。将其转化受体菌*** BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳和wes... 详细信息

为原核表达副猪嗜血杆菌血清5型TbpA蛋白,本研究利用特异性引物扩增tbpA基因,并将其克隆到pMD18-T载体中进行序列测定。再将其亚克隆于pET-28a中构建重组表达质粒pET-tbpA。将其转化受体菌*** BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳和western blot分析表明,表达的重组蛋白约106 ku,并以包涵体形式存在。表达的重组蛋白经纯化后,免疫6周龄昆明小鼠制备免疫血清,ELISA分析表明制备的血清抗体效价在1∶3 200以上,表明TbpA具有良好的免疫原性。

关键词：副猪嗜血杆菌 tbpA基因原核表达

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牛分枝杆菌Spoligotyping和VNTR-MIRU的基因分型研究

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中国预防兽医学报 2009年第2期31卷 114-116,126页

作者：杜艳芬林靖凯刘思国王春来刘慧芳司微王聃赵海玲中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室细菌病研究室黑龙江哈尔滨150001

为了探讨间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)和数目可变串联重复序列-结核分枝杆菌散在分布重复单元(VNTR-MIRU)基因分型法用于国内牛分枝杆菌的基因分型研究,初步了解我国牛分枝杆菌基因型种类、分布以及2种方法在我国应用的可行性。... 详细信息

为了探讨间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)和数目可变串联重复序列-结核分枝杆菌散在分布重复单元(VNTR-MIRU)基因分型法用于国内牛分枝杆菌的基因分型研究,初步了解我国牛分枝杆菌基因型种类、分布以及2种方法在我国应用的可行性。本研究收集东北、西北、华北、华南4个地区分离的10株牛分枝杆菌分离株,分别采用Spoligotyping和VNTR-MIRU对这些分离株进行基因分型,比较两种方法的分型效果,评价其在牛分枝杆菌基因分型中的应用。结果表明,使用Spoligotyping方法,10株牛分枝杆菌呈现出4种基因型,使用VNTR-MIRU方法,10株分离株也呈现4种基因型;当两种方法联合使用时,可以分为5种基因型,其中的2个菌株具有独特的基因型,显示来自不同地区的牛分枝杆菌存在主要的流行型为BCG家族。将Spoligotyping和VNTR-MIRU联合使用,可有效提高牛结核病的分子流行病学调查和病原学的监测效果。

关键词：牛分枝杆菌 Spoligotyping VNTR MIRU 基因分型

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牛分枝杆菌mpb64基因在Vero细胞中的瞬时表达

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中国免疫学杂志 2007年第4期23卷 320-321页

作者：宫强刘思国张秀华郭设平王春来刘建东王勇迟磊赵昆中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室动物细菌室哈尔滨150001

牛结核病作为一种严重的人畜共患病已越来越受到人们的重视,尽管大多数国家不提倡用疫苗来预防牛结核病,但由于牛结核病病原体牛分枝杆菌与结核杆菌基因组同源性高达99%以上,因此研制针对牛结核病的DNA疫苗对于牛结核病的预防和开发人... 详细信息

牛结核病作为一种严重的人畜共患病已越来越受到人们的重视,尽管大多数国家不提倡用疫苗来预防牛结核病,但由于牛结核病病原体牛分枝杆菌与结核杆菌基因组同源性高达99%以上,因此研制针对牛结核病的DNA疫苗对于牛结核病的预防和开发人结核病新型疫苗无疑具有重要的意义[1,2].本研究构建了牛分枝杆菌分泌蛋白mpb64的真核表达质粒pcMPB64,对其在Vero细胞中的表达进行了研究,为DNA疫苗的研制提供了理论依据.

关键词：牛分枝杆菌 Vero细胞基因组瞬时表达牛结核病新型疫苗人畜共患病 DNA疫苗

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禽呼肠孤病毒σC基因在杆状病毒表达系统中的表达及其活性鉴定

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病毒学报 2011年第4期27卷 353-357页

作者：孙美玉秦立廷高玉龙祁小乐高宏雷王永强王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

本研究利用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建重组禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)σC基因的杆状病毒,感染sf9细胞获得表达重组蛋白。首先,将ARVσC基因克隆至pFastBacHTA载体,构建重组供体载体pFσC,将其转化大肠杆菌DHl0Bac感受态细胞... 详细信息

本研究利用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建重组禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)σC基因的杆状病毒,感染sf9细胞获得表达重组蛋白。首先,将ARVσC基因克隆至pFastBacHTA载体,构建重组供体载体pFσC,将其转化大肠杆菌DHl0Bac感受态细胞,使σC基因整合到Bacmid穿梭载体中,获得重组穿梭载体BacmidσC。通过脂质体介导将其转染到sf9昆虫细胞中,获得重组杆状病毒rBacσC。通过Western Blot、间接免疫荧光试验(IFA)进行检测,结果显示:σC蛋白在重组杆状病毒rBacσC感染的sf9昆虫细胞中获得正确表达,分子质量约为37kD,表达的σC蛋白具有良好的反应活性。

关键词：禽呼肠孤病毒 σC基因 sf9细胞杆状病毒

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高致病性PRRSV与PCV2共感染协同致病性研究

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中国农业科学 2012年第18期45卷 3859-3872页

作者：范培虎危艳武郭龙军吴洪丽黄立平刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

【目的】为阐明高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的协同致病作用,澄清两种病毒不同时间顺序共感染与其协同致病力之间的关系。【方法】选取35日龄阴性健康猪30头,随机分6组,PCV2/HP-PRRSV顺序共感染组、H... 详细信息

【目的】为阐明高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的协同致病作用,澄清两种病毒不同时间顺序共感染与其协同致病力之间的关系。【方法】选取35日龄阴性健康猪30头,随机分6组,PCV2/HP-PRRSV顺序共感染组、HP-PRRSV/PCV2顺序共感染组、HP-PRRSV+PCV2同时共感染组、HP-PRRSV感染组、PCV2感染组、未接种对照组。感染后每天测量体温、观察临床症状,每周称量体重、采血。用流式细胞仪检测血液中的CD3+CD4+CD8-、CD3+CD4-CD8+、γδT、NK细胞及粒细胞和单核细胞变化;免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)检测这两种病毒抗体变化;用ELISA法检测血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-2、GM-CSF细胞因子变化;用荧光定量PCR法检测血清和组织中病毒载量。对各组试验猪进行组织病理学观察。【结果】HP-PRRSV/PCV2顺序共感染组临床症状最严重,死亡率达60%;组织和血清中病毒载量显著高于其它组,抗体滴度明显低于其它组;淋巴细胞亚群及细胞因子(尤以TNF-α)变化也最为明显。【结论】HP-PRRSV和PCV2之间存在协同致病作用,且猪群先感染HP-PRRSV后感染PCV2可明显提高猪群发病率和死亡率。本研究对临床HP-PRRSV和PCV2的综合防制提供科学依据。

关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒猪圆环病毒2型共感染协同致病性

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鸭肠炎病毒UL6基因的分子特征

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病毒学报 2006年第5期22卷 391-396页

作者：陈淑红韩宗玺邵昱昊刘胜旺孔宪刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室

为了研究鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus，DEV）UL6的特征，以DEV Clone-03株基因组DNA为模板，用靶基因步移PCR方法扩增得到UL6基因区域2534bp的DNA片段。结果发现，DEVC lone-03 UL6基因由2373个核苷酸组成，编码一条790个氨基酸... 详细信息

为了研究鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus，DEV）UL6的特征，以DEV Clone-03株基因组DNA为模板，用靶基因步移PCR方法扩增得到UL6基因区域2534bp的DNA片段。结果发现，DEVC lone-03 UL6基因由2373个核苷酸组成，编码一条790个氨基酸残基组成的多肽。与14株已报道的具有全UL6同源基因序列的疱疹病毒参考株进行比较，DEV Clone-03株与α疱疹病毒的核苷酸和氨基酸同源性较之与8疱疹病毒和γ疱疹病毒要高。氨基酸序列比较显示，DEV Clone-03 UL6基因具有α疱疹病毒UL6同源基因5个保守区域。UL6基因推导的氨基酸系统发育进化树分析发现，DEV Clone-03与α疱疹病毒属一个群，在α疱疹病毒中与马立克氏病病毒（Marek’s disease herpesvirus，MDV）更接近。同时，序列分析发现，在201～222和425～441等氨基酸位，α疱疹病毒参考毒株均有不同程度的缺失，而DEV Clone-03表现出独有的完整性。

关键词：鸭肠炎病毒靶基因步移PCR UL6基因分子特征

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传染性喉气管炎病毒基因疫苗免疫效应

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畜牧兽医学报 2007年第2期38卷 175-183页

作者：王利丽王云峰孙惠玲杨春富都兴洋王玫步志高童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室

以传染性喉气管炎病毒(ILTV)WG株gB和gD基因为目的基因构建真核表达质粒pCAGG-gB和pCAGG-gD。将75只SPF鸡随机分为7组,经肌肉注射接种pCAGG-gB、pCAGG-gD、pCAGG-gB+pCAGG-gD、pCAGG-gB+rFPV-ILTVgB以及rFPV-ILTVgB,并设有生理盐水和空载体(pCAGG)对照组。免疫2周后以500EID50ILTV WG株强毒进行攻击,以评价ILTV基因疫苗以及基因疫苗和重组病毒联合应用对SPF鸡的免疫保护作用。血清抗体的检测表明:在免疫后的2周,各免疫组的鸡只均产生了特异性的ILTV抗体,外周血CD4+T、CD8+T、TCRγδ+T细胞明显高于对照组,并且pCAGG-gB和pCAGG-gD分别诱导了高水平的IL-18和IFN-γ的表达。ILTV强毒攻击后,非免疫鸡全部发病,并在第2天出现死亡。而各质粒免疫组均获得了一定的保护(保护率44%),两种质粒联合免疫(pCAGG-gB和pCAGG-gD)和重组病毒(rFPV-ILTVgB)与质粒(pCAGG-gB)联合免疫的免疫组的保护率(56%)高于单独免疫组,产生高水平细胞因子表达的免疫组的保护率高于对照组。重组鸡痘病毒免疫组的保护率(69%)最高。这些结果表明ILTV的DNA疫苗能够诱导鸡体产生特异性免疫应答,并能对传染性喉气管炎强毒的攻击提供一定的免疫保护。

关键词：鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV) DNA疫苗免疫效力

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