检索结果-内蒙古大学图书馆

基于人ANP32A蛋白的C型流感病毒聚合酶纯化及PB2蛋白单克隆抗体的高效制备

生物工程学报 2022年第8期38卷 3041-3048页

作者：屈玉杏郭兴韩佳岐张振宇王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室马传染病与慢病毒病创新团队黑龙江哈尔滨150069

C型流感病毒是感染人的重要呼吸道病原,也可感染猪、狗等动物。聚合酶是C型流感病毒复制的核心,是研究病毒复制机制的重要靶标。然而目前没有商品化针对C型流感病毒聚合酶的单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb),一定程度制约了相关研... 详细信息

C型流感病毒是感染人的重要呼吸道病原,也可感染猪、狗等动物。聚合酶是C型流感病毒复制的核心,是研究病毒复制机制的重要靶标。然而目前没有商品化针对C型流感病毒聚合酶的单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb),一定程度制约了相关研究的开展。为了制备C型流感病毒碱性聚合酶2(polymerase basic protein 2,PB2)的MAb,本研究依据人酸性核磷酸蛋白32A(human acidic nuclear phosphoprotein 32 family member A,huANP32A)与流感病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)相互作用的特性,利用免疫共沉淀技术在真核表达系统中通过融合Flag标签的huANP32A(huANP32A-Flag)纯化并富集C型流感病毒RdRp(PB1、PB2、P3),并以之作为免疫原免疫BALB/c小鼠,利用间接ELISA与Western blotting方法筛选出6株(7B11-5、8A4-5、13D9-6、8D4-1、8D4-3、9F9-4)能稳定分泌识别PB2 MAb的阳性杂交瘤细胞株。经鉴定7B11-5、8A4-5、8D4-1和8D4-3抗体亚型为IgG1型,13D9-6抗体亚型为IgG2a型,9F9-4抗体亚型为IgG3,轻链均为κ链。进一步选取1株效价高的杂交瘤细胞8D4-1来制备腹水,测定收集的小鼠腹水抗体效价为1︰64000。Western blotting结果显示,制备的MAb能够与C型流感病毒PB2发生特异性免疫反应;激光共聚焦试验结果表明,该MAb可准确检测C型流感病毒PB2的亚细胞定位。本研究通过huANP32A蛋白高效富集了C型流感病毒的RdRp,并以该复合物为抗原制备的PB2 MAb具有较好的特异性,为C型流感病毒聚合酶检测、结构分析及机制研究奠定了基础。

关键词： C型流感病毒 PB2 huANP32A 单克隆抗体

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

基于单个B细胞抗体基因扩增技术筛选马IgG1单克隆抗体

引用

中国生物工程杂志 2022年第4期42卷 17-23页

作者：陈阳刘彤张佳琦廖化新林跃智王晓钧王亚玉暨南大学生命科学技术学院广州510632 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队哈尔滨150069

在马的免疫学研究领域中,由于目前市场上缺乏商业化的马IgG单克隆抗体,使得对马的B细胞研究受到很大阻碍,IgG是B细胞受体(BCR)的重要构成成分,与B细胞分化成熟相关。为了获得马IgG特异性单克隆抗体,利用单个B细胞扩增技术进行抗体筛选... 详细信息

在马的免疫学研究领域中,由于目前市场上缺乏商业化的马IgG单克隆抗体,使得对马的B细胞研究受到很大阻碍,IgG是B细胞受体(BCR)的重要构成成分,与B细胞分化成熟相关。为了获得马IgG特异性单克隆抗体,利用单个B细胞扩增技术进行抗体筛选。首先,将马IgG蛋白(EqIgG1-C)密码子优化后合成到真核表达载体pcDNA3.4上,纯化出抗原蛋白。随后,使用蛋白质免疫小鼠,分离脾细胞后利用流式细胞术分离特异性单个B细胞,扩增出抗体重链和轻链的可变区基因,用overlapping PCR方法扩增出线性化的完整抗体,并进行鉴定。结果从80个B细胞中获得了27株特异性重组单克隆抗体,并挑选出3株线性结合活性最强的抗体基因构建到表达载体上,共转染Expi293F^(TM)细胞后表达纯化,经过ELISA和Western blot验证,显示获得的抗体可以和EqIgG1-C蛋白有良好的结合作用。使用该方法可以省时高效的获得特异性抗体,为马的免疫学研究提供了重要研究工具,为鼠单克隆抗体筛选提供了技术拓展。

关键词：马IgG 单个B细胞PCR 抗体筛选技术单克隆抗体

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

甲型流感病毒NS1蛋白与宿主蛋白eIF3f相互作用促进病毒复制的研究

引用

中国预防兽医学报 2019年第10期41卷 999-1003页

作者：林朝辉张振宇徐菱任会玲王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队

甲型流感病毒(IAV)非结构蛋白1(NS1)是一种重要的毒力因子,其通过与多种宿主细胞因子相互作用抑制宿主细胞天然免疫反应和调控流感病毒复制。为筛选与NS1相互作用的宿主蛋白,本研究利用H1N1亚型流感病毒NS1蛋白作为“诱饵”蛋白,经过Fla... 详细信息

甲型流感病毒(IAV)非结构蛋白1(NS1)是一种重要的毒力因子,其通过与多种宿主细胞因子相互作用抑制宿主细胞天然免疫反应和调控流感病毒复制。为筛选与NS1相互作用的宿主蛋白,本研究利用H1N1亚型流感病毒NS1蛋白作为“诱饵”蛋白,经过Flag pull-down联合质谱分析筛选得到4个与NS1可能相互作用的宿主蛋白eIF3f、ENO1、CCAR2和PSB2。对筛选得到的宿主蛋白评分分析后,针对宿主蛋白eIF3f进行双分子荧光互补分析(BiFC)试验验证NS1蛋白与eIF3f蛋白的相互作用,结果显示eIF3f蛋白与NS1蛋白存在相互作用,并且在HEK293T细胞中瞬时过表达的eIF3f促进了H1N1亚型流感病毒的复制。本研究为进一步探究eIF3f蛋白在流感病毒复制中发挥的生物学功能奠定了基础。

关键词：甲型流感病毒 NS1蛋白 eIF3f蛋白蛋白相互作用

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

2014年国际马传染病疫情动态

引用

中国预防兽医学报 2015年第3期37卷 238-240页

作者：马建刘影王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队黑龙江哈尔滨150001

根据世界动物卫生组织（OIE）官方发布的疫情通报,主要参考疫病信息周报（Weekly disease information）、及时通报和跟踪报告（Immediate notifications and follow-ups）检索项中的信息[1],并参考2013年国际马传染病疫情动态[2],对收... 详细信息

根据世界动物卫生组织（OIE）官方发布的疫情通报,主要参考疫病信息周报（Weekly disease information）、及时通报和跟踪报告（Immediate notifications and follow-ups）检索项中的信息[1],并参考2013年国际马传染病疫情动态[2],对收入OIE疫病目录中的马传染性疾病在2014年的疫情动态进行了回顾,并按病毒、

关键词：疫情动态检索项马属动物寄生虫性隔离检疫临床发病 EIAV 炭疽芽孢杆菌自体疫苗病马

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

转录因子JunD在HIV-1前病毒DNA转录调控中的作用研究

引用

中国预防兽医学报 2019年第4期41卷 333-337页

作者：孙君帅林朝辉徐菱马建王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队

人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)潜伏感染的形成与AP-1家族蛋白的转录调节作用密切相关。为研究AP-1家族成员JunD分子在HIV-1潜伏感染形成中的作用,本研究基于可支持HIV-1复制的T细胞系Jurkat,构建敲除JunD和稳定(过)表达JunD的细胞系;拯救H... 详细信息

人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)潜伏感染的形成与AP-1家族蛋白的转录调节作用密切相关。为研究AP-1家族成员JunD分子在HIV-1潜伏感染形成中的作用,本研究基于可支持HIV-1复制的T细胞系Jurkat,构建敲除JunD和稳定(过)表达JunD的细胞系;拯救HIV-1假病毒并分别感染对照细胞、JunD敲除以及JunD稳定表达的细胞系,通过荧光素酶技术检测HIV-1前病毒DNA转录水平的变化。结果显示,与对照组相比,JunD敲除显著抑制了HIV-1的复制,而过表达JunD则促进了HIV-1的复制。该结果表明,JunD参与了HIV-1前病毒DNA的转录调控,并可能由此影响HIV-1在宿主细胞内的复制。本实验为研究激活HIV-1细胞潜伏感染的靶点提供了实验数据。

关键词： HIV-1 前病毒DNA 转录调控 JunD蛋白 Jurkat细胞系

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

稳定表达人、马Tetherin蛋白的MDCK细胞系的构建及其限制流感病毒活性的研究

引用

中国预防兽医学报 2018年第7期40卷 626-629页

作者：王美月张振宇王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

为评估人、马Tetherin(hu Tetherin、eq Tetherin)限制流感病毒的活性,本研究将huTetherin、eqTetherin克隆于慢病毒表达载体pLPCX中,分别构建重组质粒pLPCX-HA-hu Tetherin、pLPCX-HA-eqTetherin,并构建pLPCX-HA作为阴性对照。将上述构建的重组质粒,pVSV-G以及pcGP共转染293T细胞,获得假病毒后感染MDCK细胞,并利用嘌呤霉素筛选、纯化,建立稳定表达huTetherin和eqTetherin的MDCK细胞系。经western blot鉴定显示,该细胞系中huTetherin和eqTetherin可稳定表达。以反向遗传救获的马流感病毒(A/equine/Jilin/1/1989)(JL89)感染这两种细胞系,结果显示eqTetherin和huTetherin均对该流感病毒株具有显著限制作用。该研究为进一步评价和探索huTetherin和eqTetherin限制流感病毒的作用和机制奠定了基础。

关键词：人、马Tetherin MDCK细胞系流感病毒

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

2013年国际马传染病疫情动态

引用

中国预防兽医学报 2014年第10期36卷 825-828页

作者：马建刘影王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队黑龙江哈尔滨150001

根据世界动物卫生组织（OIE）官方发布的疫情通报,主要是参考疫病信息周报（Weekly Disease Information）和及时通报与跟踪报道（Immediate notifications and follow-ups）检索项中的信息[1-2],对OIE疫病目录中列入的马传染性疾病在2... 详细信息

根据世界动物卫生组织（OIE）官方发布的疫情通报,主要是参考疫病信息周报（Weekly Disease Information）和及时通报与跟踪报道（Immediate notifications and follow-ups）检索项中的信息[1-2],对OIE疫病目录中列入的马传染性疾病在2013年世界范围内的疫情动态进行了全面回顾,并按病毒、细菌和寄生虫性传染病分类总结.

关键词：疫情动态传染病世界动物卫生组织国际疫情通报传染性疾病世界范围寄生虫性

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

稳定表达马属动物SAMHD1蛋白的U937细胞系的建立及其抗病毒活性初步研究

引用

中国预防兽医学报 2017年第10期39卷 831-835页

作者：郭苗苗尹鑫姚秋成胡哲王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

为研究马属动物SAMHD1的抗病毒活性,本研究构建了稳定表达马SAMHD1(eqSAMHD1)、驴SAMHD1(doSAMHD1)的U937细胞系。利用pLPCX慢病毒表达载体构建重组质粒pLPCX-doSAMHD1-HA和pLPCX-eqSAMHD1-HA。将重组质粒和假病毒包装重组质粒(pCgp和pVSV-G)共转染于293T细胞中,制备表达SAMHD1的假病毒,将其感染人急性单核细胞白血病细胞系U937,利用嘌呤霉素筛选,建立了稳定表达doSAMHD1和eqSAMHD1的U937细胞系。经western blot鉴定,该细胞系能够稳定表达doSAMHD1和eqSAMHD1蛋白。将人类免疫缺陷病毒(HIV)和马传染性贫血病毒(EIAV)的假病毒感染该细胞系,结果显示表达eqSAMHD1和doSAMHD1的细胞系均能够显著抑制HIV假病毒复制,限制倍数分别为17~19倍和14~18倍;两种细胞系也能够抑制EIAV假病毒复制,限制倍数分别为3~4倍和2~3倍。该细胞系的建立为进一步评价和研究马属动物SAMHD1的抗病毒机制奠定了基础。

关键词：马驴 SAMHD1 U937细胞系 HIV-1 EIAV

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

稳定表达Cas9蛋白的HeLa细胞系的建立

引用

中国预防兽医学报 2020年第9期42卷 893-898页

作者：刘燕飞那雷王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

为建立基于CRISPR-Cas9技术的基因敲除细胞文库,本研究利用慢病毒载体pMD2.G、pSPAX2(HIV-1的gag-pol表达质粒)和lentiCRISPR v2-Hyg包装慢病毒,感染HeLa细胞2 d后用400μg/mL潮霉素培养液筛选两周,获得稳定表达Cas9蛋白的多克隆细胞系... 详细信息

为建立基于CRISPR-Cas9技术的基因敲除细胞文库,本研究利用慢病毒载体pMD2.G、pSPAX2(HIV-1的gag-pol表达质粒)和lentiCRISPR v2-Hyg包装慢病毒,感染HeLa细胞2 d后用400μg/mL潮霉素培养液筛选两周,获得稳定表达Cas9蛋白的多克隆细胞系。利用流式细胞分选系统分选及western blot鉴定获得9株HeLa-Cas9单克隆细胞系。为获得具有高效率敲除内源基因的HeLa细胞系,利用同时表达绿色荧光蛋白(GFP)和GFP sgRNA的慢病毒感染HeLa-Cas9单克隆细胞系,经1μg/mL嘌呤霉素培养液筛选一周,流式细胞术检测表达绿色荧光蛋白细胞的百分比,以计算HeLa细胞株的敲除效率,进而建立了一株稳定表达Cas9蛋白的具有高敲除效率的HeLa单克隆细胞系。该细胞的Cas9敲除效率为87%,CCK-8检测结果表明其具有很好的细胞活性。本研究获得的具有高敲除效率的稳定表达Cas9蛋白的HeLa细胞系可以用于CRISPR敲除文库的转导,建立基因敲除细胞文库,为筛选参与特定功能的未知蛋白提供细胞平台。

关键词： Cas9蛋白 HeLa细胞系基因敲除效率

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

基于ANP32蛋白的B型流感病毒聚合酶的纯化及其单克隆抗体的高效制备

引用

中国预防兽医学报 2022年第2期44卷 162-168页

作者：纪玉洁郭兴张振宇王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

为同时制备B型流感病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)各亚基(PB1、PB2、PA)的单克隆抗体(MAb),本研究利用融合有flag标签的鼠源酸性核磷酸蛋白32B羧基末端结构域[muANP32B(111-C)-flag]与RdRp之间特异性的强亲和作用,将表达IBV RdRp各亚基(... 详细信息

为同时制备B型流感病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)各亚基(PB1、PB2、PA)的单克隆抗体(MAb),本研究利用融合有flag标签的鼠源酸性核磷酸蛋白32B羧基末端结构域[muANP32B(111-C)-flag]与RdRp之间特异性的强亲和作用,将表达IBV RdRp各亚基(PB1、PB2、PA)的质粒与表达鼠muANP32B(111-C)-flag的质粒共转染ANP32A/ANP32B双敲除的293T细胞(DKO细胞),36 h后通过免疫沉淀(IP)试验,富集并纯化RdRp(由PB1、PB2、PA亚基组成),经SDS-PAGE检测获得了纯度较高的ANP32B(111-C)-RdRp复合物。以纯化的该复合物免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA方法筛选能稳定分泌IBV RdRp和ANP32B(111-C)特异性MAb的杂交瘤细胞株。利用western blot鉴定各杂交瘤细胞株分泌MAb所结合的RdRp亚基。从获得的各种MAb中分别选取效价最高的1株制备小鼠腹水,利用间接ELISA方法测定各腹水的效价。将表达A、B、C、D型流感病毒RdRp各亚基(PB1、PB2、PA)的质粒分别转染293T细胞,24 h后裂解细胞,利用所制备的RdRp各MAb经western blot鉴定其交叉反应性;分别将表达不同物种ANP32B蛋白的质粒转染DKO细胞,24 h后利用制备的muANP32B(111-C)MAb经western blot鉴定。上述试验结果显示,共筛选到27株阳性杂交瘤细胞。Western blot结果显示,获得了多株稳定分泌PB1亚基、PB2亚基、PA亚基及muANP32B(111-C)MAb的杂交瘤细胞株;间接ELISA结果显示,上述各类MAb制备的小鼠腹水最高效价为1:1.28×10^(5)~1:6.4×10^(4),分别命名为1D10、1E9、2E9、6C7。Western blot结果显示,制备的IBV RdRp各单亚基MAb均能与IBV RdRp对应单亚基蛋白发生特异性反应,而不与A、C、D型流感病毒RdRp对应的单亚基反应,表明各MAb对IBV的特异性较强;其中MAb 6C7可以识别鼠、人、鸡、牛、猪、犬的ANP32B蛋白及鸡的ANP32A蛋白,表明该MAb的物种广谱性较好,可用于不同物种ANP32蛋白的检测。将MDCK细胞感染IBV,并分别以转染IBV RdRp各亚基质粒的293T细胞作为阳性对照;培养鼠源SP2/0细胞,并以转染muANP32B质粒的DKO细胞作为阳性对照,利用制备的MAb分别经激光共聚焦试验检测病毒RdRp各亚基在MDCK细胞及muANP32B在SP2/0细胞中的定位。结果显示,各MAb均能够与细胞中病毒RdRp各单亚基及SP2/0细胞中的内源性muANP32B蛋白反应,出现相应荧光。且PB1、PA亚基及内源性muANP32B主要定位在细胞质,PB2亚基主要定位在细胞核。本研究首次利用ANP32(111-C)蛋白富集IBV RdRp,并采用免疫ANP32(111-C)-RdRp复合物的方式同时获得了针对IBV RdRp 3个亚基和ANP32(111-C)蛋白的4株MAb,且能识别出多种与IBV感染相关的关键互作蛋白,可为IBV相关研究及检测提供有效的技术支持。

关键词： B型流感病毒 RNA依赖性RNA聚合酶 ANP32蛋白单克隆抗体

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：

通借通还

建议与咨询 留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

请选择保存的检索档案： 新增检索档案 确定 取消

请选择收藏分类： 新增自定义分类 确定 取消

通借通还

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：