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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：高彩霞辛畅陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室150069哈尔滨

标准化SPF猪群是生命科学研究的重要支撑条件之一，在畜牧兽医生产实践中也发挥着重要作用。大白猪和长白猪是最普遍的主导瘦肉型商业品系，在实验动物方面的研究鲜有报道。本文介绍了 SPF大白猪和长白猪基础群的引进，探讨了猪群的标...

标准化SPF猪群是生命科学研究的重要支撑条件之一，在畜牧兽医生产实践中也发挥着重要作用。大白猪和长白猪是最普遍的主导瘦肉型商业品系，在实验动物方面的研究鲜有报道。本文介绍了 SPF大白猪和长白猪基础群的引进，探讨了猪群的标准化研究和应用前景，其研究不仅丰富了我国实验动物资源，也为畜禽疫病防控技术研发提供核心支持。

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RIG-Ⅰ介导PCV2感染小鼠诱导天然免疫应答的研究

RIG-Ⅰ介导PCV2感染小鼠诱导天然免疫应答的研究

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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：孟庆文许曼黄立平邵玉乐曾为俊王辉鲁国涛刘长明陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室150069哈尔滨

猪圆环病毒2型(PCV2)为环状单链DNA病毒，是引起PMWS的主要病原，导致严重的免疫抑制，给猪业生产造成重大的经济损失.RIG-Ⅰ是细胞质RNA传感器，除识别病毒RNA外，还能检测DNA病毒的入侵.为探究RIG-Ⅰ在PCV2感染诱导的RIG-Ⅰ信号通路...

猪圆环病毒2型(PCV2)为环状单链DNA病毒，是引起PMWS的主要病原，导致严重的免疫抑制，给猪业生产造成重大的经济损失.RIG-Ⅰ是细胞质RNA传感器，除识别病毒RNA外，还能检测DNA病毒的入侵.为探究RIG-Ⅰ在PCV2感染诱导的RIG-Ⅰ信号通路、Ⅰ型干扰素及炎性细胞因子中的作用，本研究分别将30只8周龄野生型(WT)ICR雌鼠与30只RIG-Ⅰ-/-小鼠各随机分成两组(感染组和对照组)，腹腔接种PCV2a/LG株，在接种后第3、7、14、21和28 d分别测量小鼠体重，采集小鼠肺、脾组织.

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CRISPR/Cpf1介导DDX21基因敲除载体活性检测

CRISPR/Cpf1介导DDX21基因敲除载体活性检测

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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：鲁国涛张子博田璐李昂陈洪岩孟庆文中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

目的：旨在建立一种简单、快捷、高效、稳定的家鸡基因组编辑系统,为研究基因功能及模型建立奠定基础.方法：根据鸡DDX21基因序列设计选择4个gRNA,构建Cpf1/gRNA敲除表达载体并转染状态良好的DF-1细胞,经流式细胞仪收集表达红色荧光蛋...

目的：旨在建立一种简单、快捷、高效、稳定的家鸡基因组编辑系统,为研究基因功能及模型建立奠定基础.方法：根据鸡DDX21基因序列设计选择4个gRNA,构建Cpf1/gRNA敲除表达载体并转染状态良好的DF-1细胞,经流式细胞仪收集表达红色荧光蛋白的阳性细胞,T7E1酶切法选择高效的敲除载体,TA克隆测序法评估其介导DDX21基因敲除的效率.结果：结果表明4个gRNA序列正确插入表达载体中;T7E1酶切结果显示Cpf1/gRNA1基因靶向敲除活性最高,TA测序分析发现其敲除活性为33.3％.结论：本研究初步建立了CRISPR/Cpf1系统介导的基因编辑技术,结果表明CRISPR/Cpf1能够稳定介导鸡DF-1细胞上的基因组编辑,这为进一步揭示DDX21基因功能、建立DDX21基因敲除的细胞系和鸡体模型提供了理论基础和科学依据.

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利用CRISPR/Cpf1技术构建HEK293细胞DDX21基因稳定敲除株及功能鉴定

利用CRISPR/Cpf1技术构建HEK293细胞DDX21基因稳定敲除株及功能鉴...

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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：鲁国涛王辉曾为俊邵玉乐许曼陈洪岩孟庆文中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

利用CRISPR/Cpf1基因编辑技术构建DDX21基因稳定敲除的细胞株,并检测其生物学功能.设计、构建靶向DDX21基因向导RNA表达载体,与Cpf1表达载体共转染HEK293细胞,通过流式筛选、基因测序、Western印迹、细胞增殖能力检测鉴定细胞株;荧光定...

利用CRISPR/Cpf1基因编辑技术构建DDX21基因稳定敲除的细胞株,并检测其生物学功能.设计、构建靶向DDX21基因向导RNA表达载体,与Cpf1表达载体共转染HEK293细胞,通过流式筛选、基因测序、Western印迹、细胞增殖能力检测鉴定细胞株;荧光定量PCR检测病毒感染后模式识别受体(TLR-3、TLR-7、MDA-5)、Ⅰ型干扰素、IL-6以及抗病毒蛋白OAS mRNA水平表达情况.结果显示：成功筛选到两株DDX21基因敲除的细胞株,蛋白免疫印迹显示DDX21蛋白不表达;与野生型(Wildtype,WT)相比形成细胞单层的时间明显延长(P＜0.01);H9N2亚型禽流感病毒感染实验表明：模式识别受体TLR-3、MDA-5的mRNA表达水平上调,TLR-7表达水平无明显差异,IFN-α、IFN-β、IL-6及抗病毒蛋白OAS的mRNA表达水平下调,表明DDX21基因敲除阻断了DDX21-TRIF-MyD88信号通路;TCID50测定结果显示,差异最高可达到WT的3.01倍,表明DDX21基因敲除后流感病毒复制增加.本研究利用CRISPR/Cpf1系统获得两株DDX21基因稳定敲除的HEK293细胞株,为深入研究DDX21基因功能、病毒感染的天然免疫应答和调控研究奠定了基础.

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疱疹病毒逃避宿主递呈抗原性多肽的几种策略

疱疹病毒逃避宿主递呈抗原性多肽的几种策略

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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：佟相慧陈洪岩韩凌霞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

疱疹病毒是个古老而庞大的家族，为了对抗宿主的抵御进化出了独特的针对抗原递呈途径的免疫逃避机制，主要靶向抗原处理相关转运体(TAP)和MHCⅠ类分子。不同疱疹病毒可能采取相同的策略，而同一疱疹病毒也可能有多种方式。本文就目前已...

疱疹病毒是个古老而庞大的家族，为了对抗宿主的抵御进化出了独特的针对抗原递呈途径的免疫逃避机制，主要靶向抗原处理相关转运体(TAP)和MHCⅠ类分子。不同疱疹病毒可能采取相同的策略，而同一疱疹病毒也可能有多种方式。本文就目前已报道的疱疹病毒针对TAP介导的病毒肽转运过程和MHC Ⅰ类分子介导的病毒肽递呈过程的干扰，做一简单综述，希望对其他尚未阐明免疫逃避机制的疱疹病毒的研究有所帮助。

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利用重组慢病毒载体共表达Cas9-sgRNA构建TLR4基因敲除DF1细胞系

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中国兽医科学 2018年第8期48卷 958-964页

作者：庞中兵王伟刘赛宝王辉陈洪岩孟庆文中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室

Toll样受体4（TLR4）是TLRs家族成员之一,可识别革兰阴性菌细胞壁脂多糖（LPS）和某些病毒蛋白,进而激活天然免疫应答,在细菌和病毒感染性疾病的发生过程中起重要作用。本研究靶向禽源TLR4基因第一外显子,设计、构建了2个sg RNA的CRISPR... 详细信息

Toll样受体4（TLR4）是TLRs家族成员之一,可识别革兰阴性菌细胞壁脂多糖（LPS）和某些病毒蛋白,进而激活天然免疫应答,在细菌和病毒感染性疾病的发生过程中起重要作用。本研究靶向禽源TLR4基因第一外显子,设计、构建了2个sg RNA的CRISPR/Cas9双质粒表达系统,转染禽DF1细胞。流式细胞仪分选、测序验证了在家禽DF1细胞系成功敲除了TLR4基因。然后利用GV393慢病毒表达载体,构建了CAG启动子启动Cas9的共表达载体Lv-CAG-Cas9-U6-sg RNA。通过转染、流式分选、培养单细胞克隆、靶基因组测序以及Western-blot检测,筛选获得1株TLR4基因敲除的DF1细胞系。结果表明,TLR4基因敲除细胞系与野生型细胞生长动力学无显著差异。本研究验证了共表达Cas9和sg RNA可以在禽源细胞系实现基因编辑,为利用重组慢病毒共表达Cas9和sg RNA策略探索构建敲除鸡模型研究奠定了理论基础和科学依据,也为研究禽TLR4基因功能、家禽天然免疫应答机制提供了细胞模型。

关键词： CRISPR/Cas9 DF1细胞系 TLR4 慢病毒表达载体基因敲除

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鸡OV启动子表达HA对禽流感病毒攻击提供完全保护

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中国生物工程杂志 2018年第7期38卷 67-74页

作者：李亚芳赵颖慧刘赛宝王伟曾为俊王金泉陈洪岩孟庆文新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

鸡卵清蛋白（ovalbumin,OV）基因5＇调控序列是构建鸡输卵管生物反应器的首选调控元件。以EGFP为报告基因,构建OV启动子真核表达载体,转染原代输卵管上皮细胞和CHO细胞,筛选得到1.1kb的高效OV启动子。构建1.1kb OV启动子表达H5N1亚型禽... 详细信息

鸡卵清蛋白（ovalbumin,OV）基因5＇调控序列是构建鸡输卵管生物反应器的首选调控元件。以EGFP为报告基因,构建OV启动子真核表达载体,转染原代输卵管上皮细胞和CHO细胞,筛选得到1.1kb的高效OV启动子。构建1.1kb OV启动子表达H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白真核表达载体pOV_（1.1k）-HA,转染CHO细胞。PCR、RT-PCR鉴定结果证明HA基因整合至CHO细胞基因组,并进行转录;SDS-PAGE、Western blot及HA试验结果证明HA蛋白在CHO细胞内的表达,并具有免疫反应性和血凝活性。以纯化的HA蛋白免疫4周龄SPF鸡,2周后加强免疫一次,加强免疫3周HI抗体水平为6.3log2;以10~6EID_（50）H5N1（A/Goose/Guangdong/1/96）亚型禽流感病毒鼻腔接种SPF鸡,免疫组100%存活,无排毒现象,对照组100%死亡。结果表明,筛选的1.1kb OV启动子可有效驱动HA蛋白表达,表达的HA蛋白免疫SPF鸡对禽流感病毒攻击提供完全保护;为鸡输卵管生物反应器表达保护性抗原和珍贵药物蛋白奠定了基础。

关键词：鸡卵清蛋白启动子 HA 禽流感病毒免疫保护输卵管生物反应器

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农用实验动物猪感染模型的研究概况

农用实验动物猪感染模型的研究概况

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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：王玉娥陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江省哈尔滨市香坊区哈平西路678号 150069

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肠道菌群在宿主免疫应答中的作用及机制研究进展

肠道菌群在宿主免疫应答中的作用及机制研究进展

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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：张贺王玉娥陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江省哈尔滨市香坊区哈平西路678号 150069

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鹅源星状病毒衣壳蛋白的原核表达

鹅源星状病毒衣壳蛋白的原核表达

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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：蒲路莎苏世博陈肖韩赵丽丽陈洪岩黑龙江八一农垦大学动物科技学院大庆158308 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

应用RT-PCR方法扩增了 GoAstV(Goose astrovirus)编码内衣壳ORF2蛋白的基因2115bp,将ORF2基因克隆至原核表达载体pET32a,并在大肠杆菌BL21中得到了表达.通过SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到了大小约106kDa的ORF2蛋白,与理论值相符.We...

应用RT-PCR方法扩增了 GoAstV(Goose astrovirus)编码内衣壳ORF2蛋白的基因2115bp,将ORF2基因克隆至原核表达载体pET32a,并在大肠杆菌BL21中得到了表达.通过SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到了大小约106kDa的ORF2蛋白,与理论值相符.Western-blotting结果显示,ORF2蛋白可被鼠抗GoAstV阳性血清识别.本实验利用原核表达系统成功高效地表达了 GoAstV ORF2蛋白,融合蛋白以包涵体形式存在.

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