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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：闫文卓周洁胡建华刘铁龙张圆圆赵丽丽陈洪岩陆涛峰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069 上海实验动物研究中心上海201203 河南省济源市动物卫生监督所河南济源454650

[目的 ]建立猫细小病毒(feline panleukopenia virus,FPV)抗体ELISA检测方法,应用于临床样品中FPV抗体的检测.[方法]利用猫肾传代细胞(CRFK)增殖FPV病毒,回收的培养物经纯化后制备FPV抗原,通过对纯化抗原和山羊抗猫IgG-HRP的最佳工作浓...

[目的 ]建立猫细小病毒(feline panleukopenia virus,FPV)抗体ELISA检测方法,应用于临床样品中FPV抗体的检测.[方法]利用猫肾传代细胞(CRFK)增殖FPV病毒,回收的培养物经纯化后制备FPV抗原,通过对纯化抗原和山羊抗猫IgG-HRP的最佳工作浓度进行确定,建立FPV抗体ELISA检测方法,并进行特异性、敏感性、稳定性进行测定.[结果]抗原和二抗的最佳工作浓度分别为5μg/mL和1∶ 6000,批次内和批次间的变异系数分别为8.68％和7.14％,检测临床血清的灵敏度大于1∶5000,且与猫疱疹病毒 1 型(feline herpesvirus 1,FHV-1)和猫杯状病毒(feline calicivurus,FCV)均无交叉反应,与国外试剂盒符合率达到90.7％.结论 ]建立的抗体ELISA方法重复性、稳定性良好,特异性和敏感性良好,可用于猫FPV抗体检测.

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具有中和活性的鸭肠炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定

具有中和活性的鸭肠炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定

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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：王怡平张忠伟蒲路莎赵丽丽陈洪岩吉林省松原市宁江区畜牧业管理局吉林松原 138001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

为制备抗鸭肠炎病毒(DEV)的单克隆抗体(MAb)并对其生物学活性进行鉴定,本研究采用蔗糖密度梯度离心法提纯DEV鸭胚成纤维细胞适应毒,以此作为抗原免疫BALB/c小鼠,随后取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,有限稀释法克隆杂交瘤细胞株,经间...

为制备抗鸭肠炎病毒(DEV)的单克隆抗体(MAb)并对其生物学活性进行鉴定,本研究采用蔗糖密度梯度离心法提纯DEV鸭胚成纤维细胞适应毒,以此作为抗原免疫BALB/c小鼠,随后取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,有限稀释法克隆杂交瘤细胞株,经间接ELISA筛选,获得了 1株稳定分泌抗DEV MAb的杂交瘤细胞株2E3.鉴定结果显示,该MAb为IgM亚类,ELISA效价可达到1∶105以上;间接免疫荧光试验(IFA)中MAb可与细胞中增殖的DEV结合,Western Blot试验中MAb不与变性病毒蛋白作用,表明该MAb可能是构象表位的单抗;病毒中和试验表明,该MAb具有较强的病毒中和活性.本试验获得的一株具有DEV中和活性的MAb杂交瘤细胞株,为建立DEV的检测方法和DEV的相关研究提供了材料支持.

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鉴别禽致病性大肠杆菌与禽非致病性大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及初步应用

鉴别禽致病性大肠杆菌与禽非致病性大肠杆菌多重PCR检测方法的建...

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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：王怡平孙畅赵丽丽陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069 牡丹江师范学院生命科学与技术学院牡丹江 157011

为建立一种快速鉴别禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)和禽非致病性大肠杆菌(Avian non-pathogenic Escherichia coli,ANPEC)的多重PCR检测方法,本研究针对APEC的iss、cvaC、irp2、iucD、iroN和tsh共6个毒力基因的序列进行分析,分别设计合成6对特异性引物,通过正交组合法优化引物比例和梯度法确定最佳退火温度,并进一步完善了方法的敏感性、特异性和判定标准,建立了一种快速灵敏检测APEC的多重PCR检测方法,并初步应用该方法对本实验室102株大肠杆菌样本鉴定和分群。结果显示：该多重PCR方法对菌液最低检测浓度为5×107 cfu/mL;对其他种属的4株革兰氏阳性菌和5株革兰氏阴性菌无扩增。检测实验室保存的鸭源APEC和ANPEC各10株,通过比较两者所含毒力基因的分布情况及数量,建立多重PCR判定标准即所含毒力基因数大于等于3者为APEC阳性菌株。初步应用该方法检测实验室分离保存的23株APEC和79株ANPEC,同时进一步验证了其准确性。结果表明：APEC检出率为100％,ANPEC的检出率亦为100％。以上结果充分说明本研究建立的多重PCR方法特异性强、灵敏度高、简便快捷,可进一步应用于禽类的APEC和ANPEC快速鉴别诊断和APEC的分子流行病学调查。

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实验用SPF大白猪和长白猪母系遗传结构分析

实验用SPF大白猪和长白猪母系遗传结构分析

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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：高彩霞辛畅权金强陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室150069黑龙江省哈尔滨市香坊区哈平路678号中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室150069黑龙江省哈尔滨市香坊区哈平路678号东北农业大学生命科学学院 150030黑龙江省哈东北农业大学生命科学学院 150030黑龙江省哈尔滨市香坊区木材街59号

无特定病原体(specific pathogen free,SPF)大白猪(Sus scrofa)和长白猪(Sus scrofa)作为重要的实验动物,已净化了 14种病原,生殖生理和血液生理生化特性基本稳定,与其他实验用小型猪相比差异不大;且群体遗传分化较小,遗传结构稳定,作...

无特定病原体(specific pathogen free,SPF)大白猪(Sus scrofa)和长白猪(Sus scrofa)作为重要的实验动物,已净化了 14种病原,生殖生理和血液生理生化特性基本稳定,与其他实验用小型猪相比差异不大;且群体遗传分化较小,遗传结构稳定,作为实验动物初步用于疫病研究具有较好的效果.然而众所周知,猪群个体差异所表现的遗传多样性对实验结果会产生较大的影响,可导致动物实验重复性差,数据结果离散度高,因此对其进行遗传学质量控制研究十分必要.为分析实验用SPF大白猪、长白猪的线粒体 DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)控制区(displacement-loop region,D-loop 区)遗传多样性,揭示其母系遗传结构,本研究提取SPF大白猪和长白猪基因组DNA,同时以我国地方品种巴马小型猪和融水小型猪为对照,应用PCR技术扩增其mtDNA D-loop区,进行测序比对.结果显示,PCR扩增长度约为1500 bp左右,与预期结果一致.107个样本中共检测到40个多态位点,其中有34个转换,6个颠换,转换频率远高于颠换,由此界定为13个单倍型,与地方品种相比,大白猪和长白猪单倍型数较少,分别含有3种和2种特有单倍型,只有1个共享单倍型H4.两猪群中各存在1个优势单倍型,频率分别为17.76％和28.97％.将13种单倍型序列提交到GenBank,并获得相应检索号MH113789-MH113801.单倍型多样度(Hd)分析,融水小型猪单倍型多样度最高(0.767),长白猪最低(0.429),大白猪和巴马小型猪分别为0.566和0.503.此外,中介网络关系图显示13种单倍型分为3个不同进化枝,与系统进化树结果相同.大部分大白猪、长白猪与欧洲猪种亲缘关系较近;大部分巴马小型猪、融水小型猪与亚洲本地猪种亲缘关系较近;而2个大白猪单倍型、共享单倍型与琉球野猪遗传距离较近,聚集在同一分支.这也符合大白猪和长白猪是引进品种,而巴马小型猪和融水小型猪是我国自主培育的地方品种特征.本研究表明与我国地方猪品种相比,实验用SPF大白猪和长白猪种群的单倍型数较少,各存在1个优势单倍型,遗传多样性低,具有清晰的母系遗传结构.总之,SPF大白猪和长白猪mtDNAD-loop区遗传特征的分析进一步明确了其母系遗传结构,为继续对SPF大白猪和长白猪的实验动物标准化研究奠定了基础,也丰富了实验动物资源,有利于实验动物科学的研究.

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Ⅰ型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法二重RT-PCR检测方法的建立

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中国兽医科学 2018年第4期48卷 456-463页

作者：徐丽晶赵丽丽刘海燕王怡平陈洪岩东北农业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为了建立一种能同时检测I型鸭肝炎病毒（duck hepatitis virustype I，DHV—I）和鸭瘟病毒（duckplague virus，DPV）的检测方法，根据GrenBank中DHV-I和DPV的基因保守序列．设计合成两对特异性引物，扩增得到DHV—I和DPV片段，大小分别... 详细信息

为了建立一种能同时检测I型鸭肝炎病毒（duck hepatitis virustype I，DHV—I）和鸭瘟病毒（duckplague virus，DPV）的检测方法，根据GrenBank中DHV-I和DPV的基因保守序列．设计合成两对特异性引物，扩增得到DHV—I和DPV片段，大小分别为399bp和232bp。据此建立了双重PCR检测方法，并将反应条件进行了优化。结果显示，该方法特异性强，能同时扩增出DHV—I和DPV目的条带，而对其他常见的水禽病病原的扩增结果均为阴性。该方法灵敏度高，最低能检出5．3PgI型鸭肝炎病毒和2．7pg鸭瘟病毒的RNA或DNA。采用该方法对在江苏省徐州地区所采集的166份鸭肛拭子进行检测，DHV—I阳性率为1．2％：DPV阳性率为26％。同时。利用该方法对建立的DHV—I和DPV雏鸭感染模型的肝组织和肝组织接种的鸭胚尿囊液进行检测，结果均为阳性．与常规PCR和RT—PCR检测结果一致。上述结果表明。本研究建立的一步法二重RT—PCR方法可以用于DHV—I和DPV快速准确的诊断。

关键词： I型鸭肝炎病毒鸭瘟病毒一步法二重RT—PCR

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鉴别禽致病性大肠杆菌与禽非致病性大肠杆菌的多重PCR检测方法的建立及初步应用

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中国兽医科学 2018年第11期48卷 1358-1364页

作者：王怡平孙畅赵丽丽陈洪岩中国农业科学院、哈尔滨兽医研究所、兽医生物技术国家重点实验室、黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150069 牡丹江师范学院生命科学与技术学院黑龙江牡丹江157011

为建立一种快速鉴别禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli,APEC）与禽非致病性大肠杆菌（avian non-pathogenic Escherichia coli,ANPEC）的多重PCR检测方法,本研究针对APEC的iss、cvaC、irp2、iucD、iroN和tsh共6个毒力基因的序列进行分析,分别设计合成6对特异性引物,通过正交组合法优化引物比例和梯度法确定最佳退火温度,并进一步完善方法的敏感性、特异性和判定标准,建立了一种快速灵敏检测APEC的多重PCR检测方法,并初步应用该方法对本实验室102株大肠杆菌样本进行鉴定和分群。结果显示,该多重PCR方法对菌液最低检测浓度为5×10^7CFU/m L;对其他种属的4株革兰阳性菌和5株革兰阴性菌无扩增。检测实验室保存的鸭源APEC和ANPEC各10株,通过比较两者所含毒力基因的分布情况及数量,建立了多重PCR判定标准即所含毒力基因数大于等于3者为APEC阳性菌株。初步应用该方法检测实验室分离保存的23株APEC和79株ANPEC,同时进一步验证了其准确性。结果表明,APEC检出率为100%,ANPEC的检出率亦为100%。以上结果充分说明本研究建立的多重PCR特异性强、灵敏度高、简便快捷,可进一步应用于禽类的APEC与ANPEC的快速鉴别诊断和APEC的分子流行病学调查。

关键词：禽致病性大肠杆菌禽非致病性大肠杆菌多重PCR

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鸭γ干扰素在体外细胞中抗鸭肠炎病毒作用的研究

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中国兽医科学 2018年第11期48卷 1365-1373页

作者：李思琪尹海畅王怡平金建丽陈洪岩赵丽丽中国农业科学院、哈尔滨兽医研究所、兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150069 牡丹江师范学院生命科学与技术学院黑龙江牡丹江157011

为初步探究鸭γ干扰素（IFNγ）抗病毒作用,本研究从鸭胚成纤维细胞（duck embryo fibroblast,DEF）中扩增出鸭γ干扰素（IFNγ） cDNA。将鸭IFNγ基因分别与真核表达载体PCAGG及原核表达载体p ET-32a连接,获得重组质粒PCAGG-IFNγ及pET... 详细信息

为初步探究鸭γ干扰素（IFNγ）抗病毒作用,本研究从鸭胚成纤维细胞（duck embryo fibroblast,DEF）中扩增出鸭γ干扰素（IFNγ） cDNA。将鸭IFNγ基因分别与真核表达载体PCAGG及原核表达载体p ET-32a连接,获得重组质粒PCAGG-IFNγ及pET-32a-IFNγ。转染PCAGG-IFNγ于DEF细胞后第24小时,接种鸭肠炎病毒（duck enteritis virus,DEV）。同时将pET-32a-IFNγ在大肠杆菌原核表达系统中进行蛋白表达,并用纯化产物处理DEF细胞,处理后第24小时接种DEV,分别采用Western-blot、TCID50测定方法和荧光定量PCR检测重组蛋白IFNγ对DEV复制的影响,并检测细胞中相关干扰素刺激因子（interferonstimulated genes,ISGs）基因包括抗黏液病毒基因（Myxovirus resistance,Mx）、泛素样2′-5′寡聚腺苷酸合成酶基因（2′-5′oligoadenylatesynthetases-like,OASL）、DEAD框蛋白50基因（DEAD-box protein 50,DDX50）的表达情况。结果发现,无论是真核表达的还是原核表达的重组IFNγ均能抑制DEV的复制,并引起ISGs基因表达的上调。本研究结果为进一步探索鸭IFNγ的抗病毒机制提供了基础数据。

关键词：鸭γ干扰素鸭胚成纤维细胞鸭肠炎病毒

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MHC单倍体型无特定病原体鸭的培育

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实验动物科学 2018年第4期35卷 14-20页

作者：王兴童孟兴佟相慧陈洪岩韩凌霞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物与比较医学团队兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

目的培育MHC单倍型无特定病原体单倍型鸭。方法以国家禽类实验动物种子中心培育并保存的无特定病原体(SPF)麻鸭为基础,根据位于主要组织相容性复合体(MHC)核心区域的鸭抗原处理相关转运体分子(TAP)双拷贝基因(Tap1和Tap2)的多态性,分别... 详细信息

目的培育MHC单倍型无特定病原体单倍型鸭。方法以国家禽类实验动物种子中心培育并保存的无特定病原体(SPF)麻鸭为基础,根据位于主要组织相容性复合体(MHC)核心区域的鸭抗原处理相关转运体分子(TAP)双拷贝基因(Tap1和Tap2)的多态性,分别利用Tap1基因组短串联重复序列(STR)、TAP2的肽结合区序列以及Tap2全基因组序列的基因型分型,连续选育主要组织相容性复合体(MHC)单倍型SPF鸭。结果 F0代和F1代鸭的STR结果完全一致;F2和F3代鸭的Tap1和Tap2基因组序列完全纯合。连续6个世代的Tap2基因组序列分析,B3群鸭有2个位点发生突变,B1、B2和B4遗传学稳定。结论成功建立了4个MHC单倍体型SPF鸭群B1、B2、B3和B4,为深入开展鸭的免疫遗传学研究提供了实验动物支撑条件。

关键词：鸭主要组织相容性复合体无特定病原体单倍体型抗原处理相关转运体

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兽用疫苗中替代方法的研究进展

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实验动物科学 2018年第1期35卷 67-71页

作者：王兴童韩凌霞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室实验动物与比较医学团队黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

本文介绍了兽用疫苗效力检验和安全检验中替代方法的应用及研究进展,并提出适合建立替代方法的兽用疫苗,以期为我国兽用疫苗替代方法研究提供思路。

关键词：兽用疫苗安全性检验效力检验替代

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伏马毒素B_1适配体的筛选及其快速定量检测方法的建立

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动物营养学报 2018年第9期30卷 3740-3750页

作者：周妍刁晨曦张圆圆陆涛峰赵丽丽陈洪岩东北农业大学生命科学学院哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069 牡丹江师范学院生命科学与技术学院牡丹江157011

本研究旨在获得伏马毒素B1特异性适配体并利用其和胶体金的作用建立伏马毒素B1的快速检测方法。通过非固定靶标的指数富集配体系统进化技术筛选获得伏马毒素B1的适配体,并用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法测定所获适配体的亲和力和特异性... 详细信息

本研究旨在获得伏马毒素B1特异性适配体并利用其和胶体金的作用建立伏马毒素B1的快速检测方法。通过非固定靶标的指数富集配体系统进化技术筛选获得伏马毒素B1的适配体,并用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法测定所获适配体的亲和力和特异性,建立基于适配体的胶体金快速定量检测方法。结果表明:筛选得到的伏马毒素B1适配体F102亲和力解离常数为(42.1±4.0)nmol/L;建立的胶体金检测方法简便、快速、特异性强;样品检测结果与液相色谱结果的相对误差低于15.7%。因此,本研究利用筛选得到的适配体建立了可用于谷物和饲料中伏马毒素B1含量的快速定量检测方法。

关键词：非固定靶标法 SELEX技术伏马毒素B1 适配体胶体金

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