检索结果-内蒙古大学图书馆

农业生物技术学报 2019年第1期27卷 97-107页

作者：辛畅高彩霞权金强马璐璐陈洪岩东北农业大学生命科学学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室

无特定病原体(specific pathogen free, SPF)大白猪(Sus scrofa)和长白猪作为重要的实验动物,其遗传学质量控制研究十分必要。为分析实验用SPF大白猪、长白猪的线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)控制区(displacement-loop region, D-loop区)遗传多样性,揭示其母系遗传结构,本研究提取SPF大白猪和长白猪基因组DNA,同时以我国地方品种巴马小型猪和融水小型猪为对照,应用PCR技术扩增其mtDNA D-loop区,进行测序比对。结果显示,107个样本中共检测到40个多态位点,分为13个单倍型,与地方品种相比,大白猪和长白猪单倍型数较少,分别含有3种和2种特有单倍型,只有1个共享单倍型H4。两猪群中各存在1个优势单倍型。单倍型多样度(Hd)分析,融水小型猪单倍型多样度最高(0.767),长白猪最低(0.429),大白猪和巴马小型猪分别为0.566和0.503。此外,中介网络关系图和系统进化树发现大白猪和长白猪与欧洲猪种亲缘关系较近。本研究表明实验用SPF大白猪和长白猪种群的单倍型数较少,各存在1个优势单倍型,遗传多样性低,具有清晰的母系遗传结构。研究结果有利于进一步的实验动物标准化以及遗传质量控制研究。

关键词：无特定病原体(SPF)猪 mtDNA 控制区母系遗传结构

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敲除RIG-I基因的PK-15细胞系的建立及RIG-I对猪圆环病毒2型感染的作用

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中国动物传染病学报 2019年第5期27卷 14-21页

作者：许曼黄立平邵玉乐夏德利曾为俊王辉鲁国涛刘长明陈洪岩王金泉孟庆文新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830052 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建敲除RIG-I基因的PK-15细胞,初步探究视黄酸诱导基因I(retinoic acid-inducible gene-I,RIG-I)对猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染的作用。本研究根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计了针对猪RIG-I基因的2条sgRNA,构建重组载体pUC19-RIG-I-sgRNA1和pUC19-RIG-I-sgRNA2,转染PK-15细胞,通过流式细胞仪分选单细胞、测序、Western blot检测RIG-I敲除情况。PCV2感染细胞后,通过荧光定量PCR分析RIG-I及其下游分子mRNA水平,IPMA方法及TaqMan定量PCR检测病毒增殖水平。结果显示,筛选出的1株RIG-I基因缺失37 bp的PK-15细胞,Western blot检测RIG-I蛋白不表达。PCV2感染正常PK-15细胞48 h和72 h后,RIG-I mRNA水平上调,表明PCV2可激活RIG-I。敲除RIG-I基因,可下调MAVS、STING、IRF3、IFN-β的mRNA水平,抑制PCV2在PK-15细胞中复制,初步表明RIG-I信号通路促进PCV2在PK-15细胞中复制。本研究为PCV2感染的天然免疫机制研究提供了良好的细胞模型。

关键词： CRISPR/Cas9基因编辑视黄酸诱导基因Ⅰ信号通路 PK-15 猪圆环病毒2型

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敲除RIG-I基因流感病毒高产MDCK细胞系的建立及功能研究

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中国家禽 2019年第11期41卷 12-17页

作者：曾为俊许曼王辉鲁国涛邵玉乐陈洪岩刘建华孟庆文新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

利用CRISPR/Cas9技术构建RIG-I基因敲除MDCK细胞株,并验证其生物学功能。试验设计并构建了2个靶向RIG-I基因的导向RNA(sgRNA)表达载体,与pCAG-Cas9-EGFP表达载体共转染MDCK细胞,采用PAGE胶基因型检测、定点测序和Western blot筛选细胞株... 详细信息

利用CRISPR/Cas9技术构建RIG-I基因敲除MDCK细胞株,并验证其生物学功能。试验设计并构建了2个靶向RIG-I基因的导向RNA(sgRNA)表达载体,与pCAG-Cas9-EGFP表达载体共转染MDCK细胞,采用PAGE胶基因型检测、定点测序和Western blot筛选细胞株;通过荧光定量PCR检测H9N2亚型禽流感病毒(AIV)感染后MAVS、IRF3、IFN-β、IL-6、Mx1 mRNA表达水平和病毒基因拷贝数,测定TCID50。结果表明:获得两株稳定敲除RIG-I基因的MDCK细胞(MDCK-RIG-I-/-),Western blot检测RIG-I蛋白不表达;荧光定量PCR结果显示病毒感染后MDCK-RIG-I-/-的MAVS、IRF3、IFN-β、IL-6、Mx1 mRNA表达水平显著降低,表明RIG-I基因敲除后RIG-I-Ⅰ型干扰素信号通路受阻;病毒基因拷贝数、TCID50测定结果显示,差异最高可分别达到野生型MDCK的2.16倍、3.19倍,表明RIG-I基因敲除后流感病毒复制增加。该研究利用CRISPR/Cas9技术建立了敲除RIG-I基因流感病毒MDCK细胞株,为研究RIG-I天然免疫应答机制奠定基础;该技术方法和策略也为流感疫苗生产及产业更新换代提供候选细胞株。

关键词： RIG-I CRISPR/Cas9 MDCK细胞系基因敲除 H9N2亚型流感病毒

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利用CRISPR/Cas9技术敲除TLR3基因及其影响NDV复制的研究

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中国兽医科学 2019年第9期49卷 1128-1135页

作者：邵玉乐许曼王辉曾为俊鲁国涛赵丽丽陈洪岩刘建华孟庆文新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

TLR3是Toll样受体家族成员之一,在天然免疫与适应性免疫应答中均发挥重要作用。为探究TLR3在NDV感染中的作用机制,本研究针对犬TLR3基因设计了2个sgRNA,构建重组质粒,转染MDCK细胞,经PCR、测序、Western-blot检测敲除情况,CCK-8方法检... 详细信息

TLR3是Toll样受体家族成员之一,在天然免疫与适应性免疫应答中均发挥重要作用。为探究TLR3在NDV感染中的作用机制,本研究针对犬TLR3基因设计了2个sgRNA,构建重组质粒,转染MDCK细胞,经PCR、测序、Western-blot检测敲除情况,CCK-8方法检测细胞增殖速度;新城疫病毒La Sota毒株感染细胞,荧光定量PCR分析病毒增殖水平和TLR3、TLR7、MDA5、IFN-β和IFIT1的m RNA水平。结果,筛选出1株TLR3基因缺失7 bp的MDCK细胞。Western-blot结果显示,TLR3蛋白不表达,其增殖速度与野生型MDCK细胞无显著差异。新城疫病毒La Sota毒株感染MDCK-WT细胞后,TLR3的m RNA含量在四个时间点均显著上调(P<0.01),表明新城疫病毒La Sota毒株可激活TLR3。再以新城疫病毒La Sota毒株感染MDCK-TLR3-/-细胞,IFN-β和IFIT1的m RNA含量在感染后第12小时和第24小时显著降低(P<0.01),病毒拷贝数在感染后第6、12和24小时显著高于WT组(P<0.01),表明TLR3在NDV介导的IFN-β反应和IFIT1的表达中具有重要作用,能够抑制NDV的复制。TLR7和MDA5的m RNA含量在感染后第6小时和第12小时显著上调(P<0.01),IFN-β和IFIT1的m RNA含量在感染后第48小时表达显著上调(P<0.01),NDV的拷贝数在第48小时在两组间显著性差异消失,提示TLR3缺失后TLR7和MDA5对其具有代偿作用。上述研究结果对NDV介导的天然免疫应答及疾病防控等研究具有重要意义。

关键词： TLR3 MDCK CRISPR/Cas9 新城疫病毒

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TLR4^-/- DF1细胞系感染NDV后免疫机制的初步研究

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中国预防兽医学报 2019年第12期41卷 1244-1250页

作者：王辉鲁国涛许曼曾为俊邵玉乐赵丽丽陈洪岩刘建华孟庆文新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为初步探究鸡TLR4在抗病毒感染天然免疫中发挥的作用,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术针对鸡TLR4基因的功能域,设计、构建了CRISPR/Cas9双质粒表达系统,转染鸡DF1细胞;经流式细胞仪分选、测序及western blot鉴定筛选得到TLR4^-/- DF... 详细信息

为初步探究鸡TLR4在抗病毒感染天然免疫中发挥的作用,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术针对鸡TLR4基因的功能域,设计、构建了CRISPR/Cas9双质粒表达系统,转染鸡DF1细胞;经流式细胞仪分选、测序及western blot鉴定筛选得到TLR4^-/- DF1细胞系;利用新城疫病毒(NDV)感染TLR4^-/- DF1细胞系,采用绝对荧光定量PCR检测NDV拷贝数,相对荧光定量PCR检测TLR4下游接头蛋白、细胞因子及干扰素基因的转录水平。结果显示:与野生型DF1细胞相比,NDV感染6 h、16 h和36 h的TLR4^-/- DF1细胞中病毒基因拷贝数显著升高(p<0.05),16 h升高了2.95倍,感染6 h、16 h和24 h下游接头蛋白MyD88基因转录水平下降,感染16 h促炎因子IL-1β下降了48.5%(p<0.01),IL-8下降了62.5%(p<0.01),I型干扰素转录水平下降。以上结果表明:NDV感染诱导的天然免疫应答可能是通过MyD88途径诱导高水平促炎性因子和I型干扰素(IFN-α、IFN-β)的表达,从而抑制NDV的增殖,TLR4在NDV感染引起的天然免疫应答和疾病防控研究中具有重要意义。同时,本研究TLR4^-/- DF1细胞系的建立可用于病毒引起的炎性因子风暴及天然免疫抗病毒作用的探究。

关键词： TLR4 CRISPR/Cas9系统 DF1 基因敲除 NDV

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具有中和活性的鸭肠炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定

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中国兽医科学 2019年第8期49卷 977-982页

作者：王怡平张忠伟蒲路莎赵丽丽陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150069 吉林省松原市宁江区畜牧业管理局吉林松原138001

为制备抗鸭肠炎病毒(DEV)的单克隆抗体(MAb)并对其生物学活性进行鉴定,本研究采用蔗糖密度梯度离心法提纯DEV鸭胚成纤维细胞适应毒,以此作为抗原免疫BALB/c小鼠,随后取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,有限稀释法克隆杂交瘤细胞株,经间... 详细信息

为制备抗鸭肠炎病毒(DEV)的单克隆抗体(MAb)并对其生物学活性进行鉴定,本研究采用蔗糖密度梯度离心法提纯DEV鸭胚成纤维细胞适应毒,以此作为抗原免疫BALB/c小鼠,随后取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,有限稀释法克隆杂交瘤细胞株,经间接ELISA筛选,获得了1株稳定分泌抗DEV MAb的杂交瘤细胞株2E3。鉴定结果显示,该MAb为Ig M亚类,ELISA效价可达到1∶10~5以上;间接免疫荧光试验(IFA)中MAb可与细胞中增殖的DEV结合,Western-blot试验中MAb不与变性病毒蛋白作用,表明该MAb可能是构象表位的单抗;病毒中和试验表明,该MAb具有较强的病毒中和活性。上述结果表明,本试验获得的一株具有DEV中和活性的MAb杂交瘤细胞株为建立DEV的检测方法和DEV的相关研究提供了材料支持。

关键词：鸭肠炎病毒单克隆抗体中和活性

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Gga-miR-7b和靶基因SNCA在两品系鸡脾脏中的表达分析

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江苏农业学报 2019年第4期35卷 874-879页

作者：肖春婷廉传江易诚陈洪岩东北农业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150069 东北林业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150040

为确定gga-miR-7b与SNCA的靶向关系以及检测他们在MDV超强毒株Md5感染SPF抗性鸡(B21单倍型)和易感鸡(B19单倍型)后5 d、14 d、25 d脾脏中的表达量。利用TargetScan、miRBD软件预测gga-miR-7b的靶基因,通过双荧光素酶报告基因检测系统体... 详细信息

为确定gga-miR-7b与SNCA的靶向关系以及检测他们在MDV超强毒株Md5感染SPF抗性鸡(B21单倍型)和易感鸡(B19单倍型)后5 d、14 d、25 d脾脏中的表达量。利用TargetScan、miRBD软件预测gga-miR-7b的靶基因,通过双荧光素酶报告基因检测系统体外验证gga-miR-7b与SNCA之间的靶向关系。qRT-PCR检测SNCA和gga-miR-7b在B21、B19感染Md5脾脏中的表达量。荧光素酶活性结果显示,gga-miR-7b与SNCA-wt-3′UTR共转染后显著抑制萤火虫荧光素酶活性(P<0.05),对SNCA-mut-3′UTR活性无显著影响。qRT-PCR结果显示,SNCA在B21、B19中,Md5感染5 d均显著上调表达(P<0.05),Md5感染25 d时SNCA在B21中极显著上调表达(P<0.01),在B19中极显著下调表达(P<0.01)。gga-miR-7b在Md5感染14 d,在B21中显著上调表达而在B19中显著下调表达(P<0.05),Md5感染25 d,gga-miR-7b在B21、B19中均极显著上调表达(P<0.01)。综上所述,SNCA是gga-miR-7b的靶基因。gga-miR-7b和SNCA可能与MD抗性/易感性以及MD肿瘤转化有关。

关键词： gga-miR-7b SNCA 靶向关系表达分析

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实验用猪感染模型研究概况

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实验动物与比较医学 2019年第4期39卷 253-259页

作者：王玉娥张贺陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室

传统的生物医学模型动物在实验设施中易于管理,可快速高效地应用于人类疾病相关基因的基础研究,但在某些情况下,它们无法代表人类生理的复杂性。猪在解剖学和生理学上与人类相似度很高,在人类疾病的相关研究中的应用广泛。本综述回顾了... 详细信息

传统的生物医学模型动物在实验设施中易于管理,可快速高效地应用于人类疾病相关基因的基础研究,但在某些情况下,它们无法代表人类生理的复杂性。猪在解剖学和生理学上与人类相似度很高,在人类疾病的相关研究中的应用广泛。本综述回顾了猪作为人类传染性疾病及自身传染病模型的应用概况,并概述了疫病感染模型的表征及特性。

关键词：实验动物猪感染模型

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CRISPR/Cpf1介导DDX21基因敲除载体活性检测

CRISPR/Cpf1介导DDX21基因敲除载体活性检测

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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：鲁国涛张子博田璐李昂陈洪岩孟庆文中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

目的：旨在建立一种简单、快捷、高效、稳定的家鸡基因组编辑系统,为研究基因功能及模型建立奠定基础.方法：根据鸡DDX21基因序列设计选择4个gRNA,构建Cpf1/gRNA敲除表达载体并转染状态良好的DF-1细胞,经流式细胞仪收集表达红色荧光蛋... 详细信息

目的：旨在建立一种简单、快捷、高效、稳定的家鸡基因组编辑系统,为研究基因功能及模型建立奠定基础.方法：根据鸡DDX21基因序列设计选择4个gRNA,构建Cpf1/gRNA敲除表达载体并转染状态良好的DF-1细胞,经流式细胞仪收集表达红色荧光蛋白的阳性细胞,T7E1酶切法选择高效的敲除载体,TA克隆测序法评估其介导DDX21基因敲除的效率.结果：结果表明4个gRNA序列正确插入表达载体中;T7E1酶切结果显示Cpf1/gRNA1基因靶向敲除活性最高,TA测序分析发现其敲除活性为33.3％.结论：本研究初步建立了CRISPR/Cpf1系统介导的基因编辑技术,结果表明CRISPR/Cpf1能够稳定介导鸡DF-1细胞上的基因组编辑,这为进一步揭示DDX21基因功能、建立DDX21基因敲除的细胞系和鸡体模型提供了理论基础和科学依据.

关键词： CRISPR/Cpf1 基因敲除 DF-1细胞 DDX21

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实验用SPF大白猪和长白猪的标准化研究与应用前景

实验用SPF大白猪和长白猪的标准化研究与应用前景

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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：高彩霞辛畅陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室150069哈尔滨

标准化SPF猪群是生命科学研究的重要支撑条件之一，在畜牧兽医生产实践中也发挥着重要作用。大白猪和长白猪是最普遍的主导瘦肉型商业品系，在实验动物方面的研究鲜有报道。本文介绍了 SPF大白猪和长白猪基础群的引进，探讨了猪群的标... 详细信息

标准化SPF猪群是生命科学研究的重要支撑条件之一，在畜牧兽医生产实践中也发挥着重要作用。大白猪和长白猪是最普遍的主导瘦肉型商业品系，在实验动物方面的研究鲜有报道。本文介绍了 SPF大白猪和长白猪基础群的引进，探讨了猪群的标准化研究和应用前景，其研究不仅丰富了我国实验动物资源，也为畜禽疫病防控技术研发提供核心支持。

关键词： SPF 大白猪长白猪标准化应用前景

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