检索结果-内蒙古大学图书馆

畜牧兽医学报 2023年第2期54卷 494-503页

作者：何豪杰薛美冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪消化道传染病创新团队哈尔滨150069

核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白1(NLRP1)是NOD样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,NLRs)家族的成员,是人们发现的第一个能形成炎性小体的蛋白。NLRP1的激活可引起半胱氨酸蛋白酶-1前体(pro-caspase-1)的活化并进一步促进炎性因子的成熟和释放,在天然免疫中发挥着重要作用。NLRP1的结构在不同种属间存在差异,目前能引起NLRP1激活的机制,主要包括通过蛋白酶体途径降解并激活NLRP1、通过抑制DPP9激活NLRP1以及弓形虫和部分代谢抑制剂激活NLRP1等。某些病毒蛋白或RNA也能够激活NLRP1,其具体激活机制以及NLRP1在抗病毒感染中发挥的作用尚未明确,还有待于进一步研究。

关键词： NLRP1 炎性小体病毒激活机制

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基于人ANP32A蛋白的C型流感病毒聚合酶纯化及PB2蛋白单克隆抗体的高效制备

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生物工程学报 2022年第8期38卷 3041-3048页

作者：屈玉杏郭兴韩佳岐张振宇王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室马传染病与慢病毒病创新团队黑龙江哈尔滨150069

C型流感病毒是感染人的重要呼吸道病原,也可感染猪、狗等动物。聚合酶是C型流感病毒复制的核心,是研究病毒复制机制的重要靶标。然而目前没有商品化针对C型流感病毒聚合酶的单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb),一定程度制约了相关研... 详细信息

C型流感病毒是感染人的重要呼吸道病原,也可感染猪、狗等动物。聚合酶是C型流感病毒复制的核心,是研究病毒复制机制的重要靶标。然而目前没有商品化针对C型流感病毒聚合酶的单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb),一定程度制约了相关研究的开展。为了制备C型流感病毒碱性聚合酶2(polymerase basic protein 2,PB2)的MAb,本研究依据人酸性核磷酸蛋白32A(human acidic nuclear phosphoprotein 32 family member A,huANP32A)与流感病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)相互作用的特性,利用免疫共沉淀技术在真核表达系统中通过融合Flag标签的huANP32A(huANP32A-Flag)纯化并富集C型流感病毒RdRp(PB1、PB2、P3),并以之作为免疫原免疫BALB/c小鼠,利用间接ELISA与Western blotting方法筛选出6株(7B11-5、8A4-5、13D9-6、8D4-1、8D4-3、9F9-4)能稳定分泌识别PB2 MAb的阳性杂交瘤细胞株。经鉴定7B11-5、8A4-5、8D4-1和8D4-3抗体亚型为IgG1型,13D9-6抗体亚型为IgG2a型,9F9-4抗体亚型为IgG3,轻链均为κ链。进一步选取1株效价高的杂交瘤细胞8D4-1来制备腹水,测定收集的小鼠腹水抗体效价为1︰64000。Western blotting结果显示,制备的MAb能够与C型流感病毒PB2发生特异性免疫反应;激光共聚焦试验结果表明,该MAb可准确检测C型流感病毒PB2的亚细胞定位。本研究通过huANP32A蛋白高效富集了C型流感病毒的RdRp,并以该复合物为抗原制备的PB2 MAb具有较好的特异性,为C型流感病毒聚合酶检测、结构分析及机制研究奠定了基础。

关键词： C型流感病毒 PB2 huANP32A 单克隆抗体

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2020-2021年中国部分活禽市场中classⅠ类新城疫病毒的分子特征遗传演化和耐热性分析

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中国兽医科学 2023年第4期53卷 491-498页

作者：张春玮孙军峰张智颖陈林娜刘添仪韩宗玺刘胜旺中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽呼吸道传染病创新团队黑龙江哈尔滨150069

对2020—2021年期间分离自10个省(自治区)活禽市场不同宿主与部分环境中的新城疫病毒(NDV)进行鉴定,获得了31株classⅠ类NDV。F基因分子特征分析显示,classⅠ类NDV F基因中起始密码子存在突变,导致产生不同长度的编码序列。氨基酸序列... 详细信息

对2020—2021年期间分离自10个省(自治区)活禽市场不同宿主与部分环境中的新城疫病毒(NDV)进行鉴定,获得了31株classⅠ类NDV。F基因分子特征分析显示,classⅠ类NDV F基因中起始密码子存在突变,导致产生不同长度的编码序列。氨基酸序列分析结果显示,大部分毒株的F蛋白具有典型的弱毒株裂解位点基序,但个别毒株的裂解位点存在特征性的突变。F蛋白中融合肽、N-连接的糖基化位点、中和表位以及七肽重复区域在这31个毒株之间高度保守,而信号肽区域中存在众多的氨基酸替换。HN蛋白中仅N-连接的糖基化位点在31个毒株之间保守,中和表位和七肽重复区域均存在氨基酸替换。此外,首次发现了HN编码区长度为1728 nt的突变毒株。遗传进化分析显示,与其他国家和地区的毒株不同,我国的classⅠ类NDV形成了独特的进化分支,即基因亚型1.1.2。耐热性测定结果显示,classⅠ类NDV分离株表现出不同程度的耐热特性。本研究结果为我国classⅠ类NDV的遗传变异和生物学特性研究奠定了基础。

关键词：新城疫病毒分子特征遗传进化热稳定性

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猪丁型冠状病毒S1-CTD相互作用宿主蛋白的筛选和鉴定

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畜牧兽医学报 2022年第7期53卷 2260-2267页

作者：汤荣锋范前进郭龙军张鑫石达时洪艳陈建飞冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪消化道传染病创新团队哈尔滨150069

猪丁型冠状病毒纤突蛋白S1亚基C端结合域(S1-CTD)是诱导中和抗体产生的主要区域,为研究与其相互作用的宿主蛋白,采用HEK-293T真核表达系统表达并纯化了S1-CTD,提取了猪回肠上皮细胞膜蛋白,通过免疫共沉淀筛选了可能与S1-CTD相互作用的... 详细信息

猪丁型冠状病毒纤突蛋白S1亚基C端结合域(S1-CTD)是诱导中和抗体产生的主要区域,为研究与其相互作用的宿主蛋白,采用HEK-293T真核表达系统表达并纯化了S1-CTD,提取了猪回肠上皮细胞膜蛋白,通过免疫共沉淀筛选了可能与S1-CTD相互作用的蛋白并进行质谱分析,发现32个疑似相互作用的宿主蛋白。构建其中可能与S1-CTD互作的蛋白KIF1 binding protein(KIFBP)的真核表达质粒,通过免疫共沉淀和激光共聚焦验证上述宿主蛋白与S1-CTD是否存在相互作用,结果表明KIFBP和S1-CTD之间存在相互作用,共同转染时在细胞质共定位。进一步研究表明,过表达KIFBP能够有效降低病毒RNA水平和病毒滴度,其中mRNA水平降低了约70%,病毒滴度降低了10^(1.6)TCID_(50)。综上,本研究筛选并鉴定出一种与PDCoV S1-CTD相互作用的宿主蛋白KIFBP,为了解PDCoV的致病机制提供了理论基础。

关键词：猪丁型冠状病毒 S1-CTD蛋白相互作用 KIFBP

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猪氨基肽酶N病毒结合受体核心区对TGEV在ST细胞中复制影响的研究

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中国预防兽医学报 2023年第1期45卷 1-8页

作者：史鑫琪季朝阳陈晓彤张子博张鑫郭慧娟田璐王洪峰陈洪岩王靖飞冯力夏长友孟庆文中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/实验动物与比较医学创新团队/国家禽类实验动物资源库黑龙江哈尔滨150069 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪消化道传染病创新团队黑龙江哈尔滨150069 哈尔滨维科生物技术开发公司黑龙江哈尔滨150069 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物病原与病理形态学创新团队黑龙江哈尔滨150069

为研究与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)结合的猪氨基肽酶N(pAPN)受体核心区对TGEV复制以及细胞功能的影响,本研究检索并分析pAPN与TGEV的结合位点,结果显示,敲除pAPN aa668~aa963对其酶活性无影响。因此,利用CRISPR/Cas9技术构建pAPN与TGEV... 详细信息

为研究与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)结合的猪氨基肽酶N(pAPN)受体核心区对TGEV复制以及细胞功能的影响,本研究检索并分析pAPN与TGEV的结合位点,结果显示,敲除pAPN aa668~aa963对其酶活性无影响。因此,利用CRISPR/Cas9技术构建pAPN与TGEV结合位点敲除细胞系,经PCR和western blot鉴定结果显示,正确构建一株敲除pAPN aa668~aa963的ST细胞系,即敲除pAPN 15-21外显子,命名为KO-ST-15。采用CCK-8和细胞划痕方法检测KO-ST-15细胞的增殖和细胞迁移活性,结果显示,敲除pAPN 15-21外显子对ST细胞增殖和迁移活性均无显著影响。利用RT-qPCR和IFA检测KO-ST-15感染TGEV后病毒复制拷贝数和N蛋白的表达,结果显示,敲除pAPN 15-21外显子可极显著抑制TGEV在ST细胞系中的复制(P<0.001)。利用RT-qPCR检测KO-ST-15感染TGEV后炎症相关基因转录水平变化,结果显示,TGEV感染后KO-ST-15中的IL-6、IL-8和NLRP3(NOD-like receptor protein 3)mRNA转录水平无显著变化,但RIG-I和MDA5的转录水平显著上调(P<0.05)。上述结果首次表明,敲除pAPN15-21外显子能够极显著抑制TGEV在ST细胞中的复制,但细胞KO-ST-15的正常生理功能无变化,TGEV不能进入敲除pAPN 15-21外显子的细胞中引起炎症反应,该结果为进一步培育抗病育种猪提供参考依据和候选方案。

关键词：猪氨基肽酶N 猪传染性胃肠炎病毒 CRISPR/Cas9 ST细胞

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细胞hnRNP M蛋白与病毒基因组相互作用对塞内卡病毒复制影响的研究

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中国预防兽医学报 2022年第3期44卷 263-268,283页

作者：曹志远魏丹丹王海伟孙超于力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/牛羊传染病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

为研究核不均一核糖核蛋白M(hnRNP M)在塞内卡病毒(SVA)复制过程中的作用,本研究构建了重组质粒pCAGGS-HA-hnRNP M,将该重组质粒转染至BHK-21细胞后经western blot检测,结果显示其可在细胞中正确表达hnRNP M蛋白。通过在BHK-21细胞中转... 详细信息

为研究核不均一核糖核蛋白M(hnRNP M)在塞内卡病毒(SVA)复制过程中的作用,本研究构建了重组质粒pCAGGS-HA-hnRNP M,将该重组质粒转染至BHK-21细胞后经western blot检测,结果显示其可在细胞中正确表达hnRNP M蛋白。通过在BHK-21细胞中转染pCAGGS-HA-hnRNP M过表达或转染shRNA-hnRNP M敲低hnRNP M表达后感染SVA,利用western blot检测SVA结构蛋白VP2和病毒TCID50,分析hnRNP M对SVA复制的影响,结果显示,与对照组比较,过表达hnRNP M蛋白可极显著抑制SVA在BHK-21细胞中的复制(P<0.01),而敲低hnRNP M蛋白能极显著促进SVA在BHK-21细胞中的复制(P<0.01)。进一步利用RNA免疫共沉试验在SVA感染的BHK-21细胞中获得免疫沉淀复合物,提取其RNA后利用SVA基因组特异性引物进行PCR检测,结果显示宿主细胞hnRNP M蛋白和SVA基因组RNA存在相互作用。通过激光共聚焦试验检测SVA基因组和hnRNP M的定位情况,结果显示SVA感染宿主细胞后hnRNP M从细胞核转移至细胞质中,并与SVA基因组RNA在细胞质中共定位。通过双荧光素酶报告基因试验分别在过表达hnRNP M和敲低hnRNP M的细胞中检测SVA内部核糖体进入位点(IRES)的活性,结果显示过表达hnRNP M蛋白能够抑制SVA IRES介导的翻译活性,而下调hnRNP M蛋白的表达则能够促进IRES的活性。上述研究结果首次证实了宿主细胞蛋白hnRNP M与SVA基因组存在相互作用,其可通过抑制IRES的翻译活性进一步抑制SVA复制。本研究为深入研究SVA复制的分子调控机制奠定了基础。

关键词：塞内卡病毒内部核糖体进入位点核不均一核糖核蛋白M 抑制作用

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基于单个B细胞抗体基因扩增技术筛选马IgG1单克隆抗体

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中国生物工程杂志 2022年第4期42卷 17-23页

作者：陈阳刘彤张佳琦廖化新林跃智王晓钧王亚玉暨南大学生命科学技术学院广州510632 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队哈尔滨150069

在马的免疫学研究领域中,由于目前市场上缺乏商业化的马IgG单克隆抗体,使得对马的B细胞研究受到很大阻碍,IgG是B细胞受体(BCR)的重要构成成分,与B细胞分化成熟相关。为了获得马IgG特异性单克隆抗体,利用单个B细胞扩增技术进行抗体筛选... 详细信息

在马的免疫学研究领域中,由于目前市场上缺乏商业化的马IgG单克隆抗体,使得对马的B细胞研究受到很大阻碍,IgG是B细胞受体(BCR)的重要构成成分,与B细胞分化成熟相关。为了获得马IgG特异性单克隆抗体,利用单个B细胞扩增技术进行抗体筛选。首先,将马IgG蛋白(EqIgG1-C)密码子优化后合成到真核表达载体pcDNA3.4上,纯化出抗原蛋白。随后,使用蛋白质免疫小鼠,分离脾细胞后利用流式细胞术分离特异性单个B细胞,扩增出抗体重链和轻链的可变区基因,用overlapping PCR方法扩增出线性化的完整抗体,并进行鉴定。结果从80个B细胞中获得了27株特异性重组单克隆抗体,并挑选出3株线性结合活性最强的抗体基因构建到表达载体上,共转染Expi293F^(TM)细胞后表达纯化,经过ELISA和Western blot验证,显示获得的抗体可以和EqIgG1-C蛋白有良好的结合作用。使用该方法可以省时高效的获得特异性抗体,为马的免疫学研究提供了重要研究工具,为鼠单克隆抗体筛选提供了技术拓展。

关键词：马IgG 单个B细胞PCR 抗体筛选技术单克隆抗体

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宿主蛋白核仁素与病毒基因组相互作用对牛肠道病毒复制影响的研究

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中国预防兽医学报 2022年第6期44卷 598-605页

作者：魏丹丹孙超常继涛于力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/牛羊传染病创新团队黑龙江哈尔滨1550069

为了探究宿主蛋白核仁素(NCL)对牛肠道病毒(BEV)复制的影响及其作用机制,本研究将构建的重组质粒pHA-NCL和NCL shRNA分别转染BHK-21细胞,采用western blot检测细胞中NCL的表达。结果显示,NCL在BHK-21细胞中分别获得了过表达和下调表达... 详细信息

为了探究宿主蛋白核仁素(NCL)对牛肠道病毒(BEV)复制的影响及其作用机制,本研究将构建的重组质粒pHA-NCL和NCL shRNA分别转染BHK-21细胞,采用western blot检测细胞中NCL的表达。结果显示,NCL在BHK-21细胞中分别获得了过表达和下调表达。在此基础上,将BEV以MOI 1感染上述过表达和下调NCL表达的BHK-21细胞,于感染8 h、10 h和12 h时收集上清液和细胞,采用qPCR、western blot(检细胞)分别检测病毒基因组RNA的复制水平、BEV结构蛋白VP1表达水平及通过上清液检测病毒滴度的变化。结果表明,过表达NCL明显促进BEV在BHK-21细胞中的复制,而下调NCL的表达则明显抑制BEV的复制。利用兔源NCL特异性抗体及同源IgG对感染BEV的BHK-21细胞进行RNA免疫共沉淀试验,并利用RT-PCR检测免疫复合物中BEV相应基因片段。结果显示,免疫复合物NCL抗体-NCL蛋白-病毒RNA免疫复合物中扩增出BEV目的基因片段,而IgG抗体对照组未扩增出任何条带,表明NCL与BEV基因组RNA存在相互作用。通过激光共聚焦试验观察BEV感染BHK-21细胞后不同时间(5 h和10 h)NCL蛋白的亚细胞定位,结果显示,BEV感染细胞后使NCL由核仁迁移至细胞质,并与病毒基因组在细胞质中共定位。利用同源重组试剂盒将线性化的pmirGLO及扩增的BEV内部核糖体进入位点(IRES)构建双荧光素酶报告质粒pmirGLO-BEV IRES,并经测序鉴定正确后分别转染NCL过表达和下调表达的BHK-21细胞,采用双荧光素酶试剂盒分别检测上述细胞中两种荧光素酶FLuc和RLuc(BEV IRES依赖性的)的活性。结果显示,与转染pHA的对照细胞相比,NCL过表达的BHK-21细胞中FLuc值无显著变化,而RLuc值显著升高(P<0.01);与转染shRNA NC的对照细胞相比,NCL表达下调的BHK-21细胞中,FLuc值无显著变化,而RLuc值显著降低(P<0.01)。表明,NCL正调控BEV IRES的翻译起始活性。本研究首次证实NCL与BEV基因组间存在相互作用,该互作可促进BEV IRES介导的病毒蛋白翻译活性,从而提高BEV的复制水平,为BEV复制的分子调控机制提供了新的见解。

关键词：牛肠道病毒核仁素内部核糖体进入位点病毒复制

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基于ANP32蛋白的B型流感病毒聚合酶的纯化及其单克隆抗体的高效制备

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中国预防兽医学报 2022年第2期44卷 162-168页

作者：纪玉洁郭兴张振宇王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

为同时制备B型流感病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)各亚基(PB1、PB2、PA)的单克隆抗体(MAb),本研究利用融合有flag标签的鼠源酸性核磷酸蛋白32B羧基末端结构域[muANP32B(111-C)-flag]与RdRp之间特异性的强亲和作用,将表达IBV RdRp各亚基(... 详细信息

为同时制备B型流感病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)各亚基(PB1、PB2、PA)的单克隆抗体(MAb),本研究利用融合有flag标签的鼠源酸性核磷酸蛋白32B羧基末端结构域[muANP32B(111-C)-flag]与RdRp之间特异性的强亲和作用,将表达IBV RdRp各亚基(PB1、PB2、PA)的质粒与表达鼠muANP32B(111-C)-flag的质粒共转染ANP32A/ANP32B双敲除的293T细胞(DKO细胞),36 h后通过免疫沉淀(IP)试验,富集并纯化RdRp(由PB1、PB2、PA亚基组成),经SDS-PAGE检测获得了纯度较高的ANP32B(111-C)-RdRp复合物。以纯化的该复合物免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA方法筛选能稳定分泌IBV RdRp和ANP32B(111-C)特异性MAb的杂交瘤细胞株。利用western blot鉴定各杂交瘤细胞株分泌MAb所结合的RdRp亚基。从获得的各种MAb中分别选取效价最高的1株制备小鼠腹水,利用间接ELISA方法测定各腹水的效价。将表达A、B、C、D型流感病毒RdRp各亚基(PB1、PB2、PA)的质粒分别转染293T细胞,24 h后裂解细胞,利用所制备的RdRp各MAb经western blot鉴定其交叉反应性;分别将表达不同物种ANP32B蛋白的质粒转染DKO细胞,24 h后利用制备的muANP32B(111-C)MAb经western blot鉴定。上述试验结果显示,共筛选到27株阳性杂交瘤细胞。Western blot结果显示,获得了多株稳定分泌PB1亚基、PB2亚基、PA亚基及muANP32B(111-C)MAb的杂交瘤细胞株;间接ELISA结果显示,上述各类MAb制备的小鼠腹水最高效价为1:1.28×10^(5)~1:6.4×10^(4),分别命名为1D10、1E9、2E9、6C7。Western blot结果显示,制备的IBV RdRp各单亚基MAb均能与IBV RdRp对应单亚基蛋白发生特异性反应,而不与A、C、D型流感病毒RdRp对应的单亚基反应,表明各MAb对IBV的特异性较强;其中MAb 6C7可以识别鼠、人、鸡、牛、猪、犬的ANP32B蛋白及鸡的ANP32A蛋白,表明该MAb的物种广谱性较好,可用于不同物种ANP32蛋白的检测。将MDCK细胞感染IBV,并分别以转染IBV RdRp各亚基质粒的293T细胞作为阳性对照;培养鼠源SP2/0细胞,并以转染muANP32B质粒的DKO细胞作为阳性对照,利用制备的MAb分别经激光共聚焦试验检测病毒RdRp各亚基在MDCK细胞及muANP32B在SP2/0细胞中的定位。结果显示,各MAb均能够与细胞中病毒RdRp各单亚基及SP2/0细胞中的内源性muANP32B蛋白反应,出现相应荧光。且PB1、PA亚基及内源性muANP32B主要定位在细胞质,PB2亚基主要定位在细胞核。本研究首次利用ANP32(111-C)蛋白富集IBV RdRp,并采用免疫ANP32(111-C)-RdRp复合物的方式同时获得了针对IBV RdRp 3个亚基和ANP32(111-C)蛋白的4株MAb,且能识别出多种与IBV感染相关的关键互作蛋白,可为IBV相关研究及检测提供有效的技术支持。

关键词： B型流感病毒 RNA依赖性RNA聚合酶 ANP32蛋白单克隆抗体

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宿主细胞转录因子E2相关因子2对EIAV复制影响的初步研究

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中国预防兽医学报 2022年第2期44卷 119-125页

作者：马官芹王岩林跃智王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

转录因子E2相关因子2(Nrf2)是细胞重要的调节抗氧化应激的转录因子,其活性状态与病毒感染引起的炎症及免疫清除相关。为研究Nrf2对马传染性贫血病毒(EIAV)复制的影响,本研究通过CRISPR在线设计工具,靶向于Nrf2设计2条特异性sgRNAs,经程... 详细信息

转录因子E2相关因子2(Nrf2)是细胞重要的调节抗氧化应激的转录因子,其活性状态与病毒感染引起的炎症及免疫清除相关。为研究Nrf2对马传染性贫血病毒(EIAV)复制的影响,本研究通过CRISPR在线设计工具,靶向于Nrf2设计2条特异性sgRNAs,经程序性退火后连接到LentiCRISPRv2-GFP载体中构建重组质粒并分别经测序鉴定正确后,转染HEK293T细胞,24 h后通过western blot筛选沉默Nrf2基因效率最高的sgRNA,结果显示,2条sgRNAs均具有较高的沉默效率。将重组质粒LentiCRISPRv2-GFP-sgRNA-N1转染HEK293T细胞,利用流式细胞仪筛选表达GFP的单细胞克隆,并扩大培养后,经western blot和测序鉴定,筛选到2株不表达Nrf2的细胞,这2株细胞基因组均缺失一个碱基T,导致Nrf2基因发生移码突变而无法表达。选择其中一株细胞,将该细胞连续传代,选择第10代(G10)、15代(G15)、20代(G20)细胞经western blot鉴定其遗传稳定性,结果显示各代次细胞均未检测到Nrf2基因的表达,表明该敲除细胞系可稳定遗传,将其命名为HEK293T-Nrf2^(KO)细胞。将EIAV感染性克隆CMV_(3-8)及Nrf2基因回补的感染性克隆CMV_(3-8)+pVR_(1012)-flag-Nrf2分别转染HEK293T-Nrf2^(KO)细胞,24 h后收获细胞和上清,通过western blot分别检测细胞和上清中的病毒蛋白Gag及利用反转录酶活性试验(RT)检测上清中病毒的复制。western blot结果显示,与CMV_(3-8)转染的HEK293T细胞相比,转染CMV_(3-8)的HEK293T-Nrf2^(KO)细胞和上清中病毒蛋白Gag表达均上调约1.5倍,而转染CMV_(3-8)+pVR_(1012)-flag-Nrf2HEK293T-Nrf2^(KO)细胞和上清中的病毒蛋白Gag表达下调约50%;RT的检测结果与western blot的检测结果一致。结果表明Nrf2基因可以抑制EIAV在HEK293T细胞中的表达。通过将相关质粒转染HEK293T细胞包装EIAV假病毒,并将其分别感染HEK293T和HEK293T-Nrf2^(KO)细胞24 h后,分别检测病毒的荧光素酶信号,结果显示,与对照组相比,感染假病毒的细胞病毒复制能力显著增强。进一步表明,敲除Nrf2基因有助于病毒对细胞的感染。以上结果表明,Nrf2能够抑制EIAV在HEK293T细胞中的复制。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建的敲除Nrf2基因的HEK293T细胞系,可以用于研究宿主Nrf2对EIAV复制的影响,本研究首次证实了宿主Nrf2可以抑制EIAV的复制。本研究构建的HEK293T-Nrf2^(KO)细胞系为宿主Nrf2调控EIAV复制机制的研究提供了有效工具。

关键词： Nrf2 CRISPR/Cas9 敲除细胞系马传染性贫血病毒

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