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中国畜牧兽医 2014年第2期41卷 70-74页

作者：迟延彬陈建飞时洪艳张鑫石达李长龙韩斅陈洪岩冯力东北农业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、兽医生物技术国家重点实验室、猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

试验旨在制备A群G11血清型猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)VP7蛋白的单克隆抗体,并鉴定其免疫学特性。将A群G11血清型PoRVVP7基因克隆至pGEX-6P-1载体,然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,IPTG诱导表达GST-VP7融合蛋白。分离纯化融合... 详细信息

试验旨在制备A群G11血清型猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)VP7蛋白的单克隆抗体,并鉴定其免疫学特性。将A群G11血清型PoRVVP7基因克隆至pGEX-6P-1载体,然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,IPTG诱导表达GST-VP7融合蛋白。分离纯化融合蛋白GST-VP7并免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,利用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞并进行有限稀释法克隆化筛选。经3次筛选,最终得到1株能与GST-VP7蛋白反应的特异性、稳定分泌抗体的阳性细胞克隆。Western blotting鉴定结果显示该单克隆抗体具有良好的免疫原性及特异性;MTT法中和试验结果显示其具有中和活性;分泌的单克隆抗体亚型为IgG2b。本试验结果表明A群PoRV VP7蛋白在大肠杆菌中成功表达且制备了单克隆抗体,可用于PoRV VP7蛋白结构和功能的研究,也为猪轮状病毒病的预防、诊断和治疗等研究奠定基础。

关键词： A群猪轮状病毒 VP7基因单克隆抗体

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猪小肠上皮细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

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中国畜牧兽医 2014年第10期41卷 33-37页

作者：徐天石达陈建飞谷凤丽时洪艳张鑫冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150030

为了更系统的研究病毒在猪肠道内侵入及致病的分子机制,本试验以猪小肠上皮细胞（intestinal epithelial cells,IEC）为模型,应用RNeasy Min Kit从猪IEC中提取细胞总RNA,反转录后,利用SMART技术合成双链cDNA（ds-cDNA）,通过同源重组的... 详细信息

为了更系统的研究病毒在猪肠道内侵入及致病的分子机制,本试验以猪小肠上皮细胞（intestinal epithelial cells,IEC）为模型,应用RNeasy Min Kit从猪IEC中提取细胞总RNA,反转录后,利用SMART技术合成双链cDNA（ds-cDNA）,通过同源重组的方法构建猪IEC酵母双杂交cDNA文库。结果显示,文库的滴度为8.4×108 CFU/mL,插入的ds-cDNA片段大小为0.5~2.0kb,平均长度约为1.1kb,文库重组率为100%。此文库为筛选与猪腹泻病毒相互作用的宿主蛋白及进一步阐明病毒的致病机制奠定了基础,为研制有效的药物或疫苗提供了依据。

关键词：猪腹泻病毒猪小肠上皮细胞酵母双杂交 cDNA文库

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VeroE6细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

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中国畜牧兽医 2014年第3期41卷 124-127页

作者：迟延彬石达朱庆贺陈建飞时洪艳张鑫李长龙韩斅刘宁赵鑫冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150030

为寻找与猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）相互作用的VeroE6细胞蛋白，深入研究病毒感染机制，本试验建立了一个VeroE6细胞酵母杂交cDNA文库。采用Trizol试剂从培养的VeroE6细胞中提取细胞总RNA，通过SMART技术... 详细信息

为寻找与猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）相互作用的VeroE6细胞蛋白，深入研究病毒感染机制，本试验建立了一个VeroE6细胞酵母杂交cDNA文库。采用Trizol试剂从培养的VeroE6细胞中提取细胞总RNA，通过SMART技术合成双链cDNA，并利用同源重组的方法构建VeroE6细胞的酵母cDNA文库。结果显示，文库滴度为9．7×10^8 CFU／mL，插入的双链cDNA片段大小为0．5～3kb，平均长度约为1．6kb，文库重组率为87％，此文库可以用来筛选与病毒相互作用的VeroE6蛋白。该文库的构建为发现和研究与PEDV结构蛋白相互作用的宿主细胞蛋白奠定基础。

关键词：猪流行性腹泻病毒 Vero E6细胞 cDNA文库 SMART技术酵母双杂交

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副猪嗜血杆菌单克隆抗体的制备及其B细胞抗原表位的鉴定

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中国预防兽医学报 2014年第5期36卷 400-403页

作者：杨玉菊郑楠符芳柴政姜福成王香玲张雪云王卓李曦中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 哈尔滨学院黑龙江哈尔滨150086 黑龙江八一农垦大学黑龙江大庆163319 哈尔滨师范大学黑龙江哈尔滨150080

为筛选具有临床诊断价值的副猪嗜血杆菌（***）单克隆抗体（MAb）,本研究采用*** 5型强毒株（HPS-5）免疫BALB/c小鼠,利用常规细胞融合技术制备了一株稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株.Western blot结果表明该MAb能够特异性识别所有***标准菌... 详细信息

为筛选具有临床诊断价值的副猪嗜血杆菌（***）单克隆抗体（MAb）,本研究采用*** 5型强毒株（HPS-5）免疫BALB/c小鼠,利用常规细胞融合技术制备了一株稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株.Western blot结果表明该MAb能够特异性识别所有***标准菌株;免疫共沉淀技术与蛋白质谱分析显示该MAb所识别的蛋白为ATP结合盒转运蛋白（ABCT）家族的寡肽透过酶（OppA）;利用MAb对噬菌体12肽库进行淘选,8个阳性噬菌体克隆展示有“KTPAE-R”保守序列,对应于*** SH29755株和SH0165株的469位～475位的氨基酸残基.对OppA氨基酸序列比对结果表明***与其它10种猪常见细菌病病原序列一致性为9.1％～74.5％,本研究结果为进一步研究***感染的病原学诊断建立了良好的基础.

关键词：副猪嗜血杆菌 ABCT OppA 病原学诊断

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蓝舌病病毒VP2蛋白展示口蹄疫病毒中和表位的研究

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中国预防兽医学报 2014年第9期36卷 731-734页

作者：罗小暖王芳崔玉东于力黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院黑龙江大庆163319 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/牛羊传染病研究创新团队黑龙江哈尔滨150001

为在蓝舌病病毒(BTV)VP2蛋白中鉴定展示表达外源B细胞表位的位点,本研究通过同源建模预测VP2蛋白的结构,采用SOE-PCR方法,将O型口蹄疫病毒编码保守的中和表位(8E8)序列分别插入BTV-8 VP2基因编码的两个不同loop区序列中,并分别构建了两... 详细信息

为在蓝舌病病毒(BTV)VP2蛋白中鉴定展示表达外源B细胞表位的位点,本研究通过同源建模预测VP2蛋白的结构,采用SOE-PCR方法,将O型口蹄疫病毒编码保守的中和表位(8E8)序列分别插入BTV-8 VP2基因编码的两个不同loop区序列中,并分别构建了两种嵌合VP2基因。将嵌合表位编码序列的VP2基因克隆于杆状病毒转移载体pFastBac HTb中,转化感受态细胞DH10Bac,筛选阳性重组杆粒rBacmid-VP2-8E8,转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBac-VP2-8E8。经western blot和间接免疫荧光验证,嵌合8E8表位的VP2蛋白在Sf9细胞中正确表达,并且8E8表位能够正确展示在VP2蛋白表面;VP2蛋白三聚体分析表明,嵌合8E8表位的VP2蛋白仍能形成三聚体。以上结果表明,BTV VP2蛋白至少存在两个插入位点,能够容纳12个氨基酸短肽的插入。该结果为BTV病毒样颗粒展示8E8表位的研究提供实验依据。

关键词：蓝舌病病毒 VP2蛋白 O型口蹄疫病毒8E8表位杆状病毒表达

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马动脉炎病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2014年第8期36卷 651-654页

作者：胡月戚亭赵世华关平原王晓钧内蒙古农业大学兽医学院/农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室内蒙古呼和浩特010018 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病与慢病毒创新团队黑龙江哈尔滨150001

为建立马动脉炎病毒(EAV)的快速检测方法,本实验以EAV N蛋白单克隆抗体(MAb)2B9为捕获抗体,辣根过氧化物酶(HRP)标记的EAV N蛋白MAb 2B3(HRP-2B3)为检测抗体,建立EAV双抗体夹心ELISA检测方法。结果显示,该方法的最佳工作条件为:MAb 2B9... 详细信息

为建立马动脉炎病毒(EAV)的快速检测方法,本实验以EAV N蛋白单克隆抗体(MAb)2B9为捕获抗体,辣根过氧化物酶(HRP)标记的EAV N蛋白MAb 2B3(HRP-2B3)为检测抗体,建立EAV双抗体夹心ELISA检测方法。结果显示,该方法的最佳工作条件为:MAb 2B9的包被浓度为2μg/mL,HRP-2B3的工作浓度为2μg/mL,以OD450nm≥0.124为阳性判定标准。该方法对马传染性贫血病毒、马疱疹病毒I型和IV型、马流感病毒等均无交叉反应,特异性好;最低检出限为病毒标准品200倍稀释(103.2TCID50),敏感性高。3次重复试验建立的标准曲线的相关系数(R2)均大于0.997。本实验建立的EAV双抗体夹心ELISA方法具有特异性好、敏感性高等优点,适于EAV的快速检测。

关键词：马动脉炎病毒双抗体夹心ELISA 单克隆抗体检测

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马动脉炎病毒Eva Green荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

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中国预防兽医学报 2014年第12期36卷 943-947页

作者：胡月戚亭胡哲关平原王晓钧内蒙古农业大学兽医学院/农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室内蒙古呼和浩特010018 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病与慢病毒创新团队黑龙江哈尔滨150001

为建立马动脉炎病毒(EAV)的快速检测方法,本研究设计了一对针对EAV Bucyrus株ORF7基因序列的特异性引物,建立了检测EAV的Eva Green荧光定量RT-PCR(q RT-PCR)方法。结果表明,该方法在102拷贝/μL^107拷贝/μL范围内具有良好的线性关系;... 详细信息

为建立马动脉炎病毒(EAV)的快速检测方法,本研究设计了一对针对EAV Bucyrus株ORF7基因序列的特异性引物,建立了检测EAV的Eva Green荧光定量RT-PCR(q RT-PCR)方法。结果表明,该方法在102拷贝/μL^107拷贝/μL范围内具有良好的线性关系;最低检出量为101.5TCID50/m L病毒,敏感性为常规RT-PCR的100倍,与其他马常见病毒无交叉反应;组内及组间重复性试验的变异系数均小于2%,具有较好的重复性。此外,采用该方法测定了EAV Bucyrus株及其拯救病毒ic EAV感染RK-13细胞后的复制动态,并与TCID50方法进行了比较。结果显示ic EAV与其亲本病毒接种RK-13细胞后,0 h测定病毒TCID50及拷贝数分别为103.33TCID50/m L(104.65拷贝/2μL)和103.50TCID50/m L(104.70拷贝/2μL);60 h时,细胞病变达到100%,ic EAV及其亲本病毒的TCID50及拷贝数分别为105.67TCID50/m L(107.0拷贝/2μL)和105.57TCID50/m L(106.98拷贝/2μL),两株病毒在RK-13细胞内的复制效率相似。本研究建立的Eva Green q RT-PCR方法可以为细胞培养物中EAV的检测提供有效的技术手段。

关键词：马动脉炎病毒 qRT-PCR Eva Green 病毒含量

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鉴别猪伪狂犬病病毒强弱毒的高效纳米PCR检测试剂盒及初步应用

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养猪 2014年第5期 100-104页

作者：马兴杰仇铮崔宇超王晓玲张晶朱宝孔苗苗罗亚坤崔尚金中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

试验建立了鉴别猪伪狂犬病病毒（PRV）强弱毒高效纳米PCR检测方法，并对相关条件进行优化，组装了试剂盒。根据PRV保守序列设计3对引物分别扩增PRV基因组的gB（431 bp）、gE（316 bp）和gG（202 bp）3个基因，用于区分PRV强毒与基因缺... 详细信息

试验建立了鉴别猪伪狂犬病病毒（PRV）强弱毒高效纳米PCR检测方法，并对相关条件进行优化，组装了试剂盒。根据PRV保守序列设计3对引物分别扩增PRV基因组的gB（431 bp）、gE（316 bp）和gG（202 bp）3个基因，用于区分PRV强毒与基因缺失毒株，优化反应条件后建立了纳米PCR检测PRV强弱毒的方法并组装试剂盒，对试剂盒进行了特异性、敏感性、批内批间可重复性及保存期评估试验，并对临床样品进行检测。特异性试验表明，此试剂盒对于PRV能够扩增出431（gB）、316（gE）和202 bp（gG）的目的片段，对于PRV-Bartha-K61能够扩增出431和202 bp的目的片段，对于猪捷申病毒、非洲猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒及大肠杆菌等DNA或cDNA均未扩增出条带。敏感性试验表明，此试剂盒的方法比常规PCR方法敏感100-1000倍，最低核酸拷贝数检出量可以达到101 copy/μL数量级。试剂盒的批内、批间检测结果无明显差异，稳定性良好。-20℃至少可保存12个月。在对中国黑龙江、吉林等7个省市的临床送检的117份样品进行检测，结果显示，PRV强毒阳性率为51%，阴性率为49%，未发现有弱毒感染。鉴别PRV强弱毒纳米PCR试剂盒的研制，对PRV感染的早期检测、野毒株和疫苗株的鉴别、疾病控制等都有重要意义，而且也可以用于其他动物PRV感染的检测和早期诊断。

关键词：检测猪伪狂犬病病毒

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基于反向遗传操作的传染性法氏囊病新型重组疫苗研究

基于反向遗传操作的传染性法氏囊病新型重组疫苗研究

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第九届全国免疫学学术大会

作者：祁小乐高立王永强高玉龙高宏雷王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室

背景:传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的鸡的一种重要免疫抑制病。超强毒(vvIBDV)的感染造成50%以上的致死率,耐过鸡呈现严重的免疫抑制,严重威胁养禽业健康发展。IBD疫苗目前存在问题... 详细信息

背景:传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的鸡的一种重要免疫抑制病。超强毒(vvIBDV)的感染造成50%以上的致死率,耐过鸡呈现严重的免疫抑制,严重威胁养禽业健康发展。IBD疫苗目前存在问题:技术瓶颈是疫苗株需要通过人工盲传驯化获得,费事费力;使用误区是中等或中等偏强毒力毒株被用作疫苗,存在生物安全隐患。目的:优化基于反向遗传操作的IBD疫苗研究新型技术平台,研制高效低毒的IBD新型重组疫苗。方法:建立IBD反向遗传操作技术;研究IBDV毒力和细胞嗜性的分子基础;构建和拯救重组病毒;通过动物实验评估重组疫苗株的有效性和安全性。结果:1、建立了RNA聚合酶Ⅱ介导的IBDV新型反向遗传操作系统,比国际同类系统更高效陕捷。2、构建和拯救系列氨基酸突变病毒,证明了VP2的253、284位氨基酸突变协同决定IBDV的细胞嗜性;VP2的253、284位氯基酸是IBDV重要的毒力位点。Q253H/A284T可以使vvIBDV毒力降低,且适应体外细胞培养。3、构建了一株以弱毒疫苗株为亲本骨架、表达流行毒株主要保护性抗原的IBDV重组病毒rGtktLJVP2,该候选疫苗株抗原性与流行毒株更匹配、安全、有效。已获国家发明专利。4、重组病毒rGtHLJVP2,对鸡无致病力。在CEF细胞和SPF鸡上分别盲传15代和5代,毒力没有返强,遗传稳定性良好。已获国家"农业转基因安全证书"。5、rGtHLJVP2免疫效果良好。能100%保护同源(HLJ-0504株)和异源强毒(HuB-1)的攻击,免疫效果和中等毒力疫苗株(B87)相当。目前,正在进行系统的临床评估。结论:建立了IBD疫苗株新型培育平台,构建了一株IBDV重组疫苗株rGtHLJVP2,安全稳定,免疫效果良好,为疫苗株培育方法的升级和疫苗的更新换代奠定了坚实基础。

关键词：传染性法氏囊病(IBD) 重组疫苗反向遗传

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基于反向遗传操作的传染性法氏囊病新型重组疫苗研究

基于反向遗传操作的传染性法氏囊病新型重组疫苗研究

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中国免疫学会第九届全国免疫学学术大会

作者：祁小乐高立王永强高玉龙高宏雷王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨150001

背景:传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的鸡的一种重要免疫抑制病.超强毒(vvIBDV)的感染造成50％以上的致死率,耐过鸡呈现严重的免疫抑制,严重威胁养禽业健康发展.IBD疫苗目前存在问题:... 详细信息

背景:传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的鸡的一种重要免疫抑制病.超强毒(vvIBDV)的感染造成50％以上的致死率,耐过鸡呈现严重的免疫抑制,严重威胁养禽业健康发展.IBD疫苗目前存在问题:技术瓶颈是疫苗株需要通过人工盲传驯化获得,费事费力;使用误区是中等或中等偏强毒力毒株被用作疫苗,存在生物安全隐患.目的:优化基于反向遗传操作的IBD疫苗研究新型技术平台,研制高效低毒的IBD新型重组疫苗.方法:建立IBD反向遗传操作技术;研究IBDV毒力和细胞嗜性的分子基础;构建和拯救重组病毒;通过动物实验评估重组疫苗株的有效性和安全性.

关键词：传染性法氏囊病(IBD) 重组疫苗反向遗传

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