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中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第二十次学术研讨会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十九次学术研讨会

作者：张沁孙恩成徐青元杨涛吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨 150001

蓝舌病是由呼肠孤病毒科环状病毒属的蓝舌病病毒(BTV)引起的,以库蠓为传播媒介在反刍动物间广泛传播的虫媒性传染病.BTV病毒粒子呈二十面体对称,无囊膜,其基因组为分节段的10个片段的双股RNA,分别编码结构蛋白VP1～VP7及非结构蛋白NS1～... 详细信息

蓝舌病是由呼肠孤病毒科环状病毒属的蓝舌病病毒(BTV)引起的,以库蠓为传播媒介在反刍动物间广泛传播的虫媒性传染病.BTV病毒粒子呈二十面体对称,无囊膜,其基因组为分节段的10个片段的双股RNA,分别编码结构蛋白VP1～VP7及非结构蛋白NS1～***3蛋白由S10基因(822bp)编码,含有两个开放阅读框,分别编码229个氨基酸(aa)的NS3和216个aa的NS3a.本研究通过制备NS3的单克隆抗体(mAbs)及鉴定其抗原表位,以期为BTV的释放机制研究奠定基础.将NCBI中BTV 1~24型NS3蛋白序列进行了序列对比，结果表明1B5,2B12, 4H8所识别的抗原表位201QSYNDAVRMSFTEF216aa在BTV 1~24型NS3蛋白序列中完全保守，具有良好的BTV群特异性。

关键词：蓝舌病病毒非结构蛋白蛋白单克隆抗体抗原表位鉴定机理

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表达狂犬病病毒ERA株糖蛋白重组新城疫病毒活载体疫苗的构建及对小鼠的免疫原性研究

表达狂犬病病毒ERA株糖蛋白重组新城疫病毒活载体疫苗的构建及对...

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会

作者：马良王琪田美杰王喜军翟洪月于文会葛金英步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨 150001 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨 150001 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

在新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统的基础上,构建表达狂犬病病毒ERA株糖蛋白的重组新城疫病毒rLa-ERA-GP,并探索rLa-ERA-GP对小鼠免疫原性.利用RT-PCR技术,从狂犬病病毒ERA疫苗株上得到狂犬病病毒的糖蛋白(GP)基因,将其克... 详细信息

在新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统的基础上,构建表达狂犬病病毒ERA株糖蛋白的重组新城疫病毒rLa-ERA-GP,并探索rLa-ERA-GP对小鼠免疫原性.利用RT-PCR技术,从狂犬病病毒ERA疫苗株上得到狂犬病病毒的糖蛋白(GP)基因,将其克隆到载体pBRN-FL-Pmel上,构建了表达狂犬病病毒糖蛋白重组新城疫病毒全长cDNA克隆pBRN-FL-ERA-GP.利用磷酸钙转染法,在辅助质粒pBS-NP、pBS-P和pBS-L的共同作用下,拯救重组病毒***-PCR检测证实重组病毒rLa-ERA-GP基因组中含有GP基因;western blot和IFA检测结果均表明GP基因在新城疫载体中得到了正确、稳定的表达;大剂量接种BALB/c小鼠不会引起小鼠发病和生长阻滞,并能诱导出高水平ERA特异中和抗体反应;加强免疫后可有效抵御致死剂量RV街毒对BALB/c小鼠的攻击.重组病毒rLa-ERA-GP有望成为防制狂犬病更加安全、有效的,新型重组基因工程活载体疫苗.

关键词：狂犬病病毒反向遗传操作系统重组新城疫病毒糖蛋白表达活载体疫苗免疫原性

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跨膜丝氨酸蛋白酶-4对2009甲型H1N1流感病毒HA的切割及其融合活性研究

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中国预防兽医学报 2013年第7期35卷 517-520页

作者：吴超温志远陈伟业施建忠葛金英步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

流感病毒血凝素(HA)被宿主蛋白酶切割活化是流感病毒复制和扩散的关键步骤。2009甲型H1N1流感病毒HA的裂解位点为单碱性氨基酸,只能被宿主特定组织部位表达的某些蛋白酶所切割活化。本研究构建了主要存在于人呼吸道和肺脏的跨膜丝氨酸... 详细信息

流感病毒血凝素(HA)被宿主蛋白酶切割活化是流感病毒复制和扩散的关键步骤。2009甲型H1N1流感病毒HA的裂解位点为单碱性氨基酸,只能被宿主特定组织部位表达的某些蛋白酶所切割活化。本研究构建了主要存在于人呼吸道和肺脏的跨膜丝氨酸蛋白酶4(TMPRSS4)的真核表达重组质粒pCA-TMPRSS4-Flag与表达2009甲型H1N1流感病毒中国四川分离株HA的真核重组表达质粒pCA-SCHA共转染293T细胞,利用westernblot证明2009甲型H1N1流感病毒的HA蛋白能够被TMPRSS4切割;通过激光共聚焦确定TMPRSS4和HA在293T细胞膜上共定位;并进一步通过细胞融合试验证明经正确切割的HA具有在低pH条件下介导细胞膜发生融合的生物学功能。本实验为研究自然感染情况下参与活化流感病毒的宿主胰蛋白酶提供了实验依据。

关键词： 2009甲型H1N1流感病毒跨膜丝氨酸蛋白酶-4 血凝素细胞融合

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表达鸡毒支原体TM1蛋白基因重组新城疫病毒的构建及其免疫原性研究

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中国预防兽医学报 2013年第10期35卷 779-782页

作者：冯秋霖刘茂军祁芳陈曦邵国青葛金英步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 江苏省农业科学院兽医研究所江苏南京210095

为研制安全、有效的新型鸡毒支原体(MG)疫苗,本研究利用新城疫病毒(NDV)LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统,构建出表达MG TM1蛋白的重组病毒rLa-TM1,并对其生物学特性进行鉴定,评估其作为MG活载体疫苗的安全性和有效性。通过免疫荧光试... 详细信息

为研制安全、有效的新型鸡毒支原体(MG)疫苗,本研究利用新城疫病毒(NDV)LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统,构建出表达MG TM1蛋白的重组病毒rLa-TM1,并对其生物学特性进行鉴定,评估其作为MG活载体疫苗的安全性和有效性。通过免疫荧光试验表明TM1蛋白获得正确表达;经测定,重组病毒平均鸡胚致死时间(MDT)为132 h,脑内致死指数(ICPI)和静脉内致病指数(IVPI)均为0,保持了LaSota亲本株的低致病性;rLa-TM1接种鸡胚所收集尿囊液中的病毒滴度可高达每毫升109.5EID50以上,证明重组病毒保持了LaSota亲本株高滴度鸡胚生长特性;重组病毒rLa-TM1接种1周龄的雏鸡后,可以诱导显著的MG抗体反应;攻毒保护试验证明其保护率可以达90%,而对照组全部发病(10/10)。本研究表明重组病毒rLa-TM1可以作为MG重组病毒活载体疫苗的候选疫苗。

关键词：鸡毒支原体反向遗传操作系统重组新城疫病毒

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表达扎伊尔型埃博拉病毒囊膜糖蛋白重组水泡性口炎病毒的构建

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中国预防兽医学报 2013年第6期35卷 431-435页

作者：宋坤王喜军温志远葛金英冯娜胡旭乐陈伟业高玉伟夏咸柱步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130062

埃博拉病毒(EBO V)能够引起一种人畜共患急性出血性传染病,即埃博拉出血热。研制安全、有效的抗病毒疫苗具有重要意义。本研究利用水泡性口炎病毒(V SV)印第安纳株反向遗传操作系统,构建并拯救得到表达扎伊尔型埃博拉病毒(ZEBO V)囊膜... 详细信息

埃博拉病毒(EBO V)能够引起一种人畜共患急性出血性传染病,即埃博拉出血热。研制安全、有效的抗病毒疫苗具有重要意义。本研究利用水泡性口炎病毒(V SV)印第安纳株反向遗传操作系统,构建并拯救得到表达扎伊尔型埃博拉病毒(ZEBO V)囊膜糖蛋白G P的重组V SV(rV SV-ZEBO V-G P),通过w estern blot和免疫荧光试验证明在重组病毒中ZEBO V G P蛋白获得正确表达;动物试验显示重组病毒对小鼠高度安全;中和试验结果表明重组病毒能诱导小鼠产生针对ZEBO V囊膜糖蛋白G P嵌合V SV假病毒粒的特异性中和抗体。本研究表明rV SV-ZEBO V-G P作为防控ZEBO V的储备性疫苗具有潜在的应用价值。

关键词：扎伊尔型埃博拉病毒囊膜糖蛋白重组水泡性口炎病毒

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布鲁氏菌Cu/Zn-SOD基因的原核表达及其免疫原性分析

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中国预防兽医学报 2013年第4期35卷 317-320页

作者：覃晓琳乔祖健胡森刘文兴赵云李继昌步志高东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为分析布鲁氏菌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)蛋白的免疫原性,本研究将布鲁氏菌强毒株M28的Cu/Zn-SOD基因经PCR扩增并克隆至pET-32a(+)中进行重组表达和纯化。经western blot分析表明,重组蛋白SOD(rSOD)可以与布鲁氏菌自然感染血清发生特... 详细信息

为分析布鲁氏菌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)蛋白的免疫原性,本研究将布鲁氏菌强毒株M28的Cu/Zn-SOD基因经PCR扩增并克隆至pET-32a(+)中进行重组表达和纯化。经western blot分析表明,重组蛋白SOD(rSOD)可以与布鲁氏菌自然感染血清发生特异性反应。同时,以rSOD免疫BALB/c小鼠制备的多抗血清可以与布鲁氏菌疫苗株M5-90发生特异性反应;以rSOD为包被抗原进行间接ELISA检测,结果显示rSOD能够区分布鲁氏菌阳性血清和阴性血清。因此,rSOD蛋白具有良好的免疫原性和ELISA反应原性,为利用rSOD蛋白建立布鲁氏菌检测方法奠定基础。

关键词：布鲁氏菌 Cu Zn SOD基因原核表达免疫原性

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布鲁氏菌M28强毒株O抗原聚合酶基因缺失株的构建及其毒力评价

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中国预防兽医学报 2013年第3期35卷 197-201页

作者：赵云胡森乔祖建刘文兴覃晓琳步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

为构建布鲁氏菌O抗原聚合酶缺失突变株,本研究以布鲁氏菌M28株为亲本株,利用同源重组方法,以编码O抗原聚合酶靶基因M28_B0107基因ORF外侧序列作为同源臂构建重组质粒pSP-B0107-K,将其电转化至M28感受态细胞中,以卡那霉素抗性基因(Kanr)... 详细信息

为构建布鲁氏菌O抗原聚合酶缺失突变株,本研究以布鲁氏菌M28株为亲本株,利用同源重组方法,以编码O抗原聚合酶靶基因M28_B0107基因ORF外侧序列作为同源臂构建重组质粒pSP-B0107-K,将其电转化至M28感受态细胞中,以卡那霉素抗性基因(Kanr)作为标记,筛选缺失突变株(M28-ΔB0107)。M28-ΔB0107经过20余代传代培养,Kanr表达稳定。将M28-ΔB0107与M28以106cfu剂量腹腔接种小鼠,进行体内致病性试验。结果显示,M28-ΔB0107感染组小鼠脾脏荷菌量显著低于亲本M28株感染组,感染6周时,前者低于后者近10倍(p<0.05);而且M28-ΔB0107感染组脾脏重量也显著低于M28强毒株组(p<0.05);小鼠腹腔巨噬细胞系(RAW264.7)感染能力试验结果表明,突变株与亲本株无明显差异(p>0.05)。

关键词：布鲁氏菌 O抗原聚合酶 B0107

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表达西尼罗病毒E蛋白重组腺病毒的构建及鉴定

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中国预防兽医学报 2013年第4期35卷 267-270页

作者：张翠云赵晶陈韬孙恩成刘霓红杨涛徐青元王文世魏鹏吴东来湖南农业大学动物医学学院湖南长沙410128 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为构建表达西尼罗病毒(WNV)E蛋白的重组腺病毒,本实验将WNV的E基因克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,经PmeⅠ酶切线性化后电转化于含有人5型缺陷腺病毒的骨架的BJ5183感受态大肠杆菌中进行同源重组,构建重组质粒pAd-WNV-E;将其经Pac... 详细信息

为构建表达西尼罗病毒(WNV)E蛋白的重组腺病毒,本实验将WNV的E基因克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,经PmeⅠ酶切线性化后电转化于含有人5型缺陷腺病毒的骨架的BJ5183感受态大肠杆菌中进行同源重组,构建重组质粒pAd-WNV-E;将其经PacⅠ酶切线性化后通过脂质体介导转染于人胚肾细胞Ad-293细胞,制备重组腺病毒rAd-WNV-E;经western blot以及间接免疫荧光鉴定表明WNV E蛋白在Ad-293细胞中获得有效表达。病毒滴度测定试验结果显示,该重组腺病毒与野毒型腺病毒复制能力相近。该重组腺病毒的构建为进一步研制表达WNV E蛋白的重组腺病毒的疫苗奠定了基础。

关键词：西尼罗病毒 E蛋白重组腺病毒

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表达羧基端融合HA表位N蛋白的重组小反刍兽疫病毒的拯救及鉴定

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中国预防兽医学报 2013年第6期35卷 456-459页

作者：殷倩倩陈伟业胡倩倩温志远葛金英王喜军步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 安徽科技学院动物科学学院安徽凤阳233100 南京农业大学动物医学院江苏南京210095

为构建小反刍兽疫(PPR)标记疫苗,本研究以PPR病毒(PPRV)反向遗传操作系统为基础,将编码H A表位(YPYD VPDYA)的序列融合连接于PPRV感染性全长cD N A N基因的3'末端构建感染性克隆质粒pN g75/1-GFP/NHA,将其与辅助质粒pCAGGS-N、pCAGG... 详细信息

为构建小反刍兽疫(PPR)标记疫苗,本研究以PPR病毒(PPRV)反向遗传操作系统为基础,将编码H A表位(YPYD VPDYA)的序列融合连接于PPRV感染性全长cD N A N基因的3'末端构建感染性克隆质粒pN g75/1-GFP/NHA,将其与辅助质粒pCAGGS-N、pCAGGS-P、pCAGGS-L共转染V ero细胞救获表达融合H A表位N蛋白的重组病毒rPPRV/GFP/NHA。W estern blot和间接免疫荧光试验表明融合H A表位的N蛋白获得正确表达;体外生长动力学试验分析表明rPPRV/G FP/N H A的生长最高滴度可达106.2TCID50/m L,能够满足标记疫苗的使用要求。本研究结果为进一步研制PPRV标记疫苗奠定基础。

关键词：小反刍兽疫病毒 N蛋白 HA表位标记疫苗

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7株H3亚型禽流感病毒HA基因的遗传演化分析

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畜牧与兽医 2013年第12期45卷 6-10页

作者：黄建龙邓国华谭丹王昌建朱春霞范仲鑫何世成汪洪冰张菁邱立新鲁杏华刘道新湖南省动物疫病预防控制中心湖南长沙410007 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 湖南省动物卫生监督所湖南长沙410007

采用RT—PCR技术对近年来洞庭湖区分离的H3亚型禽流感毒株的HA基因进行扩增、克隆和测序，并对所得全序列进行同源性和遗传演化分析。结果显示：本试验分离到的7株H3亚型禽流感病毒的HA裂解位点均没有多个连续的碱性氨基酸插入，属于低... 详细信息

采用RT—PCR技术对近年来洞庭湖区分离的H3亚型禽流感毒株的HA基因进行扩增、克隆和测序，并对所得全序列进行同源性和遗传演化分析。结果显示：本试验分离到的7株H3亚型禽流感病毒的HA裂解位点均没有多个连续的碱性氨基酸插入，属于低致病性病毒；7株H3亚型毒株之间HA基因核苷酸同源性在87．6％～98．4％之间，推导氨基酸序列的同源性在93．7％～99．1％之间；从HA基因遗传演化关系来看，7株病毒毒可分为三大分支，与以往从蒙古、韩国、越南、西伯利亚及我国香港、广西、三江等地分离的H3亚型毒株关系密切，提示其HA基因来源非常复杂。

关键词： H3亚型禽流感 HA基因同源性遗传演化

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